一种地骨皮中生物碱类化合物的选择性富集方法
技术领域
本发明涉及属于分析化学领域，主要涉及一种地骨皮中生物碱类化合物的选择性富集方法。
背景技术
地骨皮为茄科植物枸杞Lycium chinense Mill.或宁夏枸杞 Lycium barbarumL.的干燥根皮，是一种常用中药，具有凉血除蒸、清肺降火等功效。现代药理研究表明，地骨皮具有降血压、降血糖、调血脂、抗炎、调节机体免疫、解热、抗菌及抗病毒等多重药理作用。地骨皮的化学成分非常复杂，含有黄酮类、苯丙素类、蒽醌类、生物碱类、萜类、甾醇类等多种类型的化合物，给其中化合物的分离研究带来了巨大的困难（Yang Y, An Y, Wang W,et al. Nine compounds from the root bark of Lycium chinense and their anti-inflammatory activities [J]. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2017, 7(4):491-495.）。
生物碱是地骨皮中的一类重要成分，被认为是地骨皮广泛药理活性的重要来源（Zhang J , Guan S , Sun J , et al. Characterization and profiling of phenolicamides from Cortex Lycii by ultra-high performance liquid chromatographycoupled with LTQ-Orbitrap mass spectrometry[J]. Analytical and BioanalyticalChemistry, 2015, 407(2):581-595），但是目前鲜有专门针对地骨皮中生物碱的研究报道，由于大量非生物碱类成分的存在，严重影响了地骨皮中生物碱类化合物的分离纯化与生物活性研究。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种地骨皮中生物碱类化合物的选择性富集方法，包括以下步骤；
（1）地骨皮提取液的制备：称取一定量的地骨皮药材，用浓度为10%-95%的甲醇-水溶液作为提取剂、采用加热回流提取法进行地骨皮样品的提取，过滤得到地骨皮提取液；
（2）生物碱类化合物粗组分的制备：将得到的地骨皮提取液过强阳离子固相萃取柱，富集其中的生物碱类化合物，既得粗分组；
（3）生物碱类化合物细组分的制备：将得到的生物碱类化合物粗组分过反固相萃取柱分离，既得细组分。
更进一步的，地骨皮提取液的制备方法为：称取一定量的地骨皮药材，用5-30倍量，浓度为10%-95%的甲醇-水溶液采用回流提取法，提取1-5次，每次回流提取时间为1-3小时，然后合并提取液，得到地骨皮提取液。
更进一步的，生物碱类化合物粗组分的制备方法为：步骤（1）得到的地骨皮提取液加入10%-95%的甲醇-水溶液稀释，浓度为1mg/mL-100 mg/mL，用3-10倍柱体积量的甲醇溶液活化及平衡强阳离子交换固相萃取柱，上样，上样量为1mg-50mg，洗脱方法为采用线性梯度、台阶梯度或等度；然后对其进行两次淋洗，淋洗一: 1-100mL，浓度为50%-100%（v/v）甲醇-水溶液，流速为1 mL/min-30 mL/min；淋洗二：10-100 mL，浓度为10%-60%（v/v）的乙腈水溶液，流速为1 mL/min-30 mL/min；收集两次洗脱的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂完全除去，即得生物碱粗组分。
更进一步的，所述强阳离子交换固相萃取柱为XCharge C8 SCX、 XCharge C18SCX固相萃取柱或XCharge SCX固相萃取柱；其参数为0.5-20 g，1-60 mL，dp=10μm-100μm。
更进一步的，淋洗二中，所述浓度为10%-60%（v/v）的乙腈水溶液中加入0.1M-2M的磷酸二氢钠，保持淋洗二的过程中，pH值保持在1-3。
更进一步的，生物碱类化合物细组分的制备方法为：将步骤（2）中得到的生物碱类化合物的粗组分进行两次淋洗，淋洗一：用3-5倍柱体积量的蒸馏水或者浓度为0%-20%甲醇-水溶液进行洗脱；淋洗二：用3-5倍柱体积量的，浓度为20%-95%的甲醇-水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，最后真空冷冻干燥，既得生物碱类化合物细组分。
更进一步的，所述反固相萃取柱为常规C8、C18固相萃取柱或极性修饰的C18固相萃取柱；其参数为0.5-20 g，1-60 mL，dp=10μm-100μm。
更进一步的，干燥过程中物料温度不超过70℃，真空度为20-50Pa。
本发明提供的一种地骨皮中生物碱类化合物的选择性富集方法，取得以下技术效果：
（1）实现复杂体系中生物碱类化合物的选择性富集，解决了该类化合物与杂质在反相材料上“共流出”的问题，实现了该类化合物的类分离.
（2）建立了一种地骨皮中生物碱类化合物选择性富集的新方法，为阐明地骨皮的药效物质基础和生物碱类化合物生物活性的深入研究和新药研发提供技术支撑。
附图说明
图1地骨皮提取液和生物碱组分的含量对比结果。
具体实施方式
实施例一
1）称取地骨皮50克，研磨成粉末，地骨皮粉末中加入10倍量，浓度为70%（v/v）甲醇-水溶剂，采用回流提取法提取3次，每次回流提取3 h，布氏漏斗抽滤，合并滤液，得地骨皮提取液。
2）将步骤（1）得到的地骨皮提取液，采用强阳离子交换固相萃取柱选择性富集二咖啡酰亚精胺类化合物；调节样品浓度为50 mg/mL；固相萃取柱的参数为：20 g/60 mL，dp=60μm。；用3倍柱体积量的甲醇溶液活化及平衡强阳离子交换固相萃取柱，上样，上样量为1g（20 mL），洗脱方法为采用线性梯度、台阶梯度或等度；然后对其进行两次淋洗，淋洗一:60mL，浓度为90%（v/v）甲醇-水溶液，流速为10mL/min；淋洗二：60 mL，浓度为30%（v/v）的乙腈水溶液,加入1.0M，pH2.5的磷酸二氢钠，流速为10 mL/min；收集两次洗脱的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂完全除去，即得生物碱粗组分。
3）针对生物碱粗组分，利用反相固相萃取柱进行脱盐。分离条件：分离材料为反相固相萃取柱（1 g/6 mL），反固相萃取柱的参数为20 g/60 mL，dp=60μm；将步骤（2）中得到的生物碱类化合物的粗组分进行两次淋洗，淋洗一：用3倍柱体积量的蒸馏水进行洗脱；淋洗二：用3倍柱体积量的，浓度为60%的甲醇-水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，最后真空冷冻干燥，既得生物碱类化合物细组分。总二咖啡酰亚精胺含量见图1。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
