一种双靶向的酸敏感普鲁士蓝载药体系的制备方法及应用
技术领域
本发明属于纳米医药领域，具体涉及针对白血病治疗的靶向药物递送系统的制备。
背景技术
急性髓系白血病是一种恶性的克隆性疾病，主要表现在造血干细胞异常增殖和分化受阻，导致造血衰竭。尽管传统的化疗方法使用广泛，但药物并不能很好地改善患者的临床预后，微小残留病灶和细胞耐药是白血病患者复发、转移和低生存率的重要因素。另外，由于血液系统肿瘤不具有明显的EPR(增强的渗透与滞留)效应，提高靶向性对于减轻患者的系统毒性非常重要。因此，寻找新的靶点、清除微小残留病灶、克服细胞耐药成为白血病治疗中亟待解决的重大问题。
骨髓微环境在白血病耐药和复发进程中起着关键的作用，是化疗后肿瘤细胞残留的主要位点。骨髓微环境主要是由富含胶原、纤连蛋白及各种蛋白聚糖的细胞外基质和基质细胞等构成。白血病细胞通过骨髓基质细胞分泌各种细胞因子、趋化因子和粘附分子，获得黏附、迁移以及促存活和耐药的信号。CXCR4、VLA-4和CD44是骨髓微环境和白血病细胞相互作用过程中最重要的三个受体。大多数白血病细胞表面高度表达CXCR4，当化疗药物进入外周血后，白血病细胞通过其表面CXCR4受体与骨髓基质细胞分泌的基质细胞衍生因子CXCL12之间的特异性识别作用，滞留于骨髓微环境中，进而逃逸化疗药物的杀伤作用。其次，这种相互作用使其获得黏附、迁移和抗凋亡的信号，导致耐药的发生。另外，由于肝脏、脾、肺、脑、淋巴组织内的基质细胞会大量分泌CXCL12，CXCR4/CXCL12介导的迁移会引起多种白血病细胞的髓外浸润。CD44表达增多与白血病患者的不良预后密切相关。白血病细胞通过自身高度表达的CD44与透明质酸的作用，向骨髓基质细胞黏附、迁移、浸润，促进白血病的发展。
普鲁士蓝是一种历史悠久的染料，具有优良的生物安全性和生物相容性，已经在生物医药领域得到了广泛的应用。普鲁士蓝制备过程简单、反应条件温和、成本低、表面容易修饰、化学结构稳定，FDA已批准其用于临床治疗放射性铊中毒。随着纳米科技的发展，普鲁士蓝纳米颗粒还被发现具有类酶活性以及光热治疗等功能，已经成为纳米医学研究的重要载体材料。
透明质酸是广泛分布在哺乳动物骨髓细胞外基质和疏松结缔组织中的一种机体内天然的粘多糖，在细胞增殖、分化、迁移、黏附等方面发挥着重要作用。此外，透明质酸具有良好的生物相容性、可降解性、高黏弹性和非免疫原性等物理和化学性质，经透明质酸修饰的纳米颗粒不仅可以改善其亲水性和稳定性，延长血液循环时间，还可以实现与白血病细胞表面CD44分子的特异性结合，起到靶向递送药物并阻断白血病细胞通过CD44分子向骨髓基质黏附、迁移与浸润。
CXCR4拮抗多肽E5与白血病细胞有较高结合力，具有成本低廉、免疫原性低、易合成、良好的体内安全性等优点，能够有效阻断CXCR4/CXCL12介导的白血病细胞的迁移和粘附的功能，从而抑制白血病细胞骨髓归巢与肝脾等脏器浸润。
发明内容
技术问题：针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种CXCR4拮抗多肽与透明质酸双靶向修饰的酸敏感普鲁士蓝载药体系的制备方法及应用，可有效解决白血病的化疗耐药及肝脏、脾脏浸润问题。
技术方案：本发明的一种双靶向的酸敏感普鲁士蓝载药体系的制备方法，该制备方法是将酸敏感聚乙二醇-聚乙烯亚胺分子通过静电作用吸附在普鲁士蓝纳米颗粒表面，趋化因子受体CXCR4拮抗多肽E5和透明质酸与聚乙二醇-聚乙烯亚胺修饰的普鲁士蓝纳米颗粒共价连接，柔红霉素通过氢键作用负载于普鲁士蓝纳米颗粒表面；其制备方法具体包括以下步骤：
步骤1，制备普鲁士蓝纳米颗粒PBNPs：以铁氰化钾为原料，以聚乙烯吡咯烷酮为还原剂与稳定剂，将其溶于盐酸水溶液中，70-100℃加热条件反应12-24小时后，离心去上清，蓝色沉淀用水和乙醇各离心洗涤2次以上，55℃下真空干燥24小时以上；
步骤2，制备酸敏感聚乙烯亚胺-聚乙二醇高分子修饰的普鲁士蓝纳米颗粒,PP-PBNPs：将两倍体积的PBNPs水溶液逐滴加入到1倍体积聚乙烯亚胺-聚乙二醇水溶液中，磁力搅拌0.5-1小时，之后超滤去除多余的聚乙烯亚胺-聚乙二醇分子，纯水洗涤3次以上，即得PP-PBNPs水溶液，浓度为0.1-1.0mg/mL；
步骤3，制备透明质酸HA修饰的PP-PBNPs：在水溶液中用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC对透明质酸的羧基进行活化，之后缓慢滴加入10倍体积的PP-PBNPs水溶液中，并在摇床中150-250rpm下震荡反应过夜，之后超滤去除多余的透明质酸，纯水洗涤3次，即得HA-PP-PBNPs水溶液，浓度为0.1-1.0mg/mL；
步骤4，制备拮抗多肽E5修饰的HA-PP-PBNPs：在水溶液中用EDC对多肽E5进行活化，之后缓慢滴加到20倍体积的HA-PP-PBNPs水溶液中，置于摇床中在4℃、150-250rpm下震荡反应过夜；反应结束后，超滤去除游离多肽，纯水洗涤3次以上，即得E5/HA-PP-PBNPs水溶液，浓度为0.1-1.0mg/mL；
步骤5，制备负载柔红霉素DNR的E5/HA-PP-PBNPs：将柔红霉素配制成浓度为0.1mg/mL水溶液，在剧烈搅拌下滴加到1-10倍体积的E5/HA-PP-PBNPs水溶液中，避光搅拌24小时以上，之后超滤去除游离药物，纯水洗涤3次以上，即得双靶向的酸敏感普鲁士蓝载药体系E5/HA-PP-PBNPs-DNR，浓度为0.1-1.0mg/mL。
其中，
步骤1中，所述的铁氰化钾浓度为2.0-5.0g/L，聚乙烯吡咯烷酮浓度为50.0-125.0g/L，反应体系pH为1.0-3.0。
步骤2中，所述的PBNPs和聚乙烯亚胺-聚乙二醇均配制成浓度为0.2-1mg/mL水溶液，其中聚乙烯亚胺与聚乙二醇之间通过酸敏感化学键链接。
步骤3中，所述的EDC对透明质酸的羧基进行活化，是将透明质酸和EDC分别配制成浓度为1mg/mL和10mg/mL水溶液，反应体积比为10:3，反应体系pH为4.0-6.5，室温孵育0.5-3小时。
步骤4中，所述的在水溶液中用EDC对拮抗多肽E5进行活化，是将拮抗多肽E5和EDC分别配制成浓度为1mg/mL和10mg/mL水溶液，反应体积比为2:1，反应体系pH为4.0-6.5，室温孵育0.5-3小时。
所述的E5/HA-PP-PBNPs-DNR纳米颗粒的粒径为50-200nm范围之内。
步骤4中所述的超滤选择截留分子量为100KDa的超滤管4500rpm离心10分钟。
本发明方法制备的酸敏感普鲁士蓝载药体系在小鼠白血病的靶向治疗与抑制转移复发方面的应用。
有益效果：本发明制备方法简单温和，材料安全易得且具有良好的生物相容性，制备的载体通过尺寸控制与聚乙二醇修饰、透明质酸以及多肽修饰，具有血液长循环能力、白血病细胞双靶向能力；进入白血病细胞内涵体或溶酶体后，在其酸性条件下聚乙烯亚胺与聚乙二醇之间的酸敏感化学键断裂，聚乙二醇脱落下来，导致聚乙烯亚胺暴露，有利于内涵体或溶酶体逃逸；同时柔红霉素在酸性条件下易于释放，增强了化疗效果；透明质酸与多肽E5不仅起到双靶向作用，通过阻断CXCR4/CXCL12生物轴与CD44的基质粘附作用，有效抑制骨髓归巢与肝脏、脾脏浸润，结合化疗药物治疗，可有效提升白血病治疗效果。
附图说明
图1为本发明双靶向普鲁士蓝纳米颗粒载药体系的制备过程示意图。
图2为本发明双靶向普鲁士蓝纳米颗粒的透射电镜图；
图3为本发明双靶向普鲁士蓝纳米颗粒载药体系的电位图；
图4为本发明双靶向普鲁士蓝纳米颗粒载药体系在不同pH环境下药物释放对比图；
图5为本发明双靶向普鲁士蓝纳米颗粒载药体系促进细胞摄取图；
图6为本发明双靶向普鲁士蓝纳米颗粒载药体系的体外细胞杀伤效果图；
图7为本发明双靶向普鲁士蓝纳米颗粒的体外细胞迁移、粘附抑制效果图；
图8为本发明双靶向普鲁士蓝纳米颗粒载药体系的对白血病小鼠的治疗效果图。
具体实施方式
本发明是一种CXCR4拮抗多肽与透明质酸双靶向修饰的酸敏感的普鲁士蓝载药体系的制备方法，包括如下步骤：
解决的技术方案是，首先，酸敏感聚乙二醇-聚乙烯亚胺分子通过静电、氢键等相互作用吸附在普鲁士蓝纳米颗粒表面；其次，CXCR4拮抗多肽E5和透明质酸通过化学键与普鲁士蓝纳米颗粒表面的聚乙烯亚胺分子连接；再次，柔红霉素通过氢键作用负载于普鲁士蓝纳米颗粒表面(图1)。
该制备方法包括以下步骤：
(1)制备普鲁士蓝纳米颗粒(PBNPs)：以铁氰化钾为原料，以聚乙烯吡咯烷酮为还原剂与稳定剂，将其溶于盐酸水溶液中，70-100℃加热条件反应12-24小时后，离心去上清，蓝色沉淀用水和乙醇各离心洗涤2次，55℃下真空干燥24小时；
(2)制备酸敏感聚乙烯亚胺-聚乙二醇高分子修饰的普鲁士蓝纳米颗粒(PP-PBNPs)：将两倍体积的PBNPs水溶液逐滴加入到1倍体积聚乙烯亚胺-聚乙二醇水溶液中，磁力搅拌0.5-1小时，之后超滤去除多余的聚乙烯亚胺-聚乙二醇分子，纯水洗涤3次，即得PP-PBNPs水溶液，浓度为0.5mg/mL；
(3)制备透明质酸(HA)修饰的PP-PBNPs(HA-PP-PBNPs)：在水溶液中用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)对透明质酸的羧基进行活化，之后缓慢滴加入10倍体积的PP-PBNPs水溶液中，并在摇床中150-250rpm下震荡反应过夜，之后超滤去除多余的透明质酸，纯水洗涤3次，即得HA-PP-PBNPs水溶液，浓度为0.5mg/mL；
(4)制备拮抗多肽E5修饰的HA-PP-PBNPs(E5/HA-PP-PBNPs)：在水溶液中用EDC对多肽E5进行活化，之后缓慢滴加到20倍体积的HA-PP-PBNPs水溶液中，置于摇床中在4℃、150-250rpm下震荡反应过夜。反应结束后，超滤去除游离多肽，纯水洗涤3次，即得E5/HA-PP-PBNPs水溶液，浓度为0.5mg/mL；
(6)制备负载柔红霉素(DNR)的E5/HA-PP-PBNPs(E5/HA-PP-PBNPs-DNR)：将柔红霉素配制成浓度为0.1mg/mL水溶液，在剧烈搅拌下滴加到1-10倍体积的E5/HA-PP-PBNPs水溶液中，避光搅拌24小时。之后超滤去除游离药物，纯水洗涤3次，即得E5/HA-PP-PBNPs-DNR，浓度为0.5mg/mL。
(7)所述的PBNPs制备方法，反应体系中铁氰化钾浓度为2.0-5.0g/L，聚乙烯吡咯烷酮浓度为50.0-125.0g/L，反应体系pH为1.0-3.0。
(8)所述的PP-PBNPs制备方法中，PBNPs和聚乙烯亚胺-聚乙二醇均配制成浓度为0.2-1mg/mL水溶液，其中聚乙烯亚胺与聚乙二醇之间通过酸敏感化学键链接，如席夫碱、腙键。
(9)所述的HA-PP-PBNPs制备方法中，将透明质酸和EDC分别配制成浓度为1mg/mL和10mg/mL水溶液，反应体积比为10:3，反应体系pH为4.0-6.5，室温孵育0.5-3小时。
(10)所述的E5/HA-PP-PBNPs制备方法中，将E5和EDC分别配制成浓度为1mg/mL和10mg/mL水溶液，反应体积比为2:1，反应体系pH为4.0-6.5，室温孵育0.5-3小时。
(11)所述一种CXCR4拮抗多肽E5与透明质酸双靶向修饰的酸敏感普鲁士蓝载药纳米颗粒的粒径为50-200nm范围之内。
(12)所述的超滤纯化方法，选择截留分子量为100KDa的超滤管，4500rpm离心10分钟。
(13)所述一种CXCR4拮抗多肽与透明质酸双靶向修饰的酸敏感普鲁士蓝载药体系在小鼠白血病的靶向治疗方面具有应用。
(14)所述一种CXCR4拮抗多肽与透明质酸双靶向修饰的酸敏感普鲁士蓝载药体系在抑制小鼠白血病细胞骨髓归巢与肝脏、脾脏浸润方面具有应用。
为了更好地理解本发明，下面用实施例进一步阐明本发明，但本发明的内容不仅仅局限于下面实例
实施例1
普鲁士蓝纳米颗粒的制备
称取131.7mg铁氰化钾、3g聚乙烯吡咯烷酮K30溶于40mL浓度为0.01M的盐酸，磁力搅拌使其溶解，待溶液变黄色澄清液体后，置于80℃的水浴锅中反应20小时。反应结束后，将得到的蓝色溶液在10000rpm离心1小时，沉淀用水洗涤1次，用乙醇洗涤2次，再用水洗涤1次，55℃下真空干燥24小时，将干燥的普鲁士蓝纳米颗粒(PBNPs)收集置于4℃冰箱备用。
实施例2
酸敏感的聚乙烯亚胺-聚乙二醇修饰的普鲁士蓝纳米颗粒的制备
精密称取一定量的PBNPs和聚乙烯亚胺-聚乙二醇，均配制成浓度为0.5mg/mL水溶液，探头超声使纳米颗粒分散均匀。磁力搅拌下将30mLPBNPs逐滴加入到15mL聚乙烯亚胺-聚乙二醇溶液中，继续搅拌0.5小时。搅拌结束后，超滤去除多余的HA，纯水洗涤3次。将纯化后的聚乙烯亚胺-聚乙二醇修饰的普鲁士蓝纳米颗粒(PP-PBNPs)配置成0.5mg/mL的水溶液，于4℃冰箱保存备用。
实施例3
酸敏感的透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米颗粒的制备
精密称取一定量的透明质酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，分别配制成浓度为1mg/mL和10mg/mL水溶液，在超声波下震荡溶解。将1mL透明质酸溶液加入到300μL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液中，室温孵育2小时。孵育完毕后，用滴管将此混合液缓慢滴加到10mLPP-PBNPs中，然后置于摇床中180rpm下反应过夜。反应结束后，超滤(4500r/min，10min)去除多余的透明质酸，纯水洗涤3次，最终纯化样本(HA-PP-PBNPs)配置成0.5mg/mL的水溶液，于4℃冰箱保存备用。
实施例4
酸敏感的E5修饰的普鲁士蓝纳米颗粒的制备
将E5配置成1mg/mL的水溶液，分装后于-20℃保存。取150μLE5水溶液与75μL(3)所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺混合，室温孵育2小时。孵育完毕后，将此混合液缓慢滴加到10mLPP-PBNPs中，然后置于摇床中在4℃、180rpm下反应过夜。反应结束后，超滤(4500r/min，10min)去除游离多肽，纯水洗涤3次，收集全部滤出液，通过BCA试剂盒定量检测滤出液中的蛋白含量，从而计算样本中E5的偶联效率。最终纯化样本(E5-PP-PBNPs)配置成0.5mg/mL的水溶液(含l％牛血清白蛋白)，于4℃冰箱保存备用。
实施例5
酸敏感的E5和透明质酸双靶向修饰的普鲁士蓝纳米颗粒的制备
取300μL(4)中E5水溶液与150μL(3)所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液混合，室温孵育2小时。孵育完毕后，将此混合液缓慢滴加到10mLHA-PP-PBNPs中，然后置于摇床中在4℃、180rpm下反应过夜。反应结束后，超滤(4500r/min，10min)去除游离多肽，纯水洗涤3次，收集全部滤出液，通过BCA试剂盒定量检测滤出液中的蛋白含量，从而计算样本中E5的偶联效率。最终纯化样本(E5/HA-PP-PBNPs)保存在l％牛血清白蛋白水溶液中，置于4℃冰箱备用。图2显示双靶向普鲁士蓝粒径均一、分散性好。
实施例6
药物负载的普鲁士蓝纳米颗粒的制备
称取一定量的柔红霉素，配制成浓度为0.1mg/mL水溶液。在超声、冰水浴的作用下，将8mL的柔红霉素溶液逐滴加入到10mL的普鲁士蓝空载体溶液中，滴加完毕后，继续避光搅拌24小时。搅拌结束后，超滤(4500r/min，10min)去除游离药物，纯水洗涤3次，即得药物负载的普鲁士蓝纳米颗粒，于4℃下避光保存备用。收集全部滤出液，通过紫外分光光度计定量检测滤出液中的药物含量。根据以下公式计算DNR的载药率和包封率：
载药率＝(药物总量-未结合的药物量)/药物负载的纳米颗粒总量×100％
包封率＝(药物总量-未结合的药物量)/药物总量×100％
如表1所示，普鲁士蓝的载药率为10.93-12.85％，包封率为84.35-89.60％。
实施例7
配置10μg/mL不同修饰阶段的普鲁士蓝纳米颗粒，超声2分钟后静置2分钟，用马尔文激光粒度仪测定其粒径大小、电位变化及PDI，表1中的PDI数值进一步说明所制得的载药双靶向普鲁士蓝纳米颗粒分布均匀，粒径为133.4nm，图3显示其电位为8.08mV，接近中性的电荷有利于其实现血液长循环。
实施例8
载药普鲁士蓝纳米颗粒的释药性能
将适当浓度的10mL载药普鲁士蓝纳米颗粒溶液置于10KDa透析袋内中，分别置于pH为7.4、5.0的25mL缓冲液中，100r/min,37℃条件下震荡，每隔一定时间取出2mL缓冲液,用紫外分光光度计测定柔红霉素浓度并计算释放速度。图4表明，载药普鲁士蓝纳米颗粒具有明显的缓释效果，药物释放速度为：pH5.0>pH7.4。
实施例9
采用流式细胞术方法，将HL60以一定密度接种到6孔板中，加入游离的柔红霉素、载药单靶向和双靶向普鲁士蓝纳米颗粒(均含有相同剂量的药物)，抑制实验中先用E5(5μM)、透明质酸(200mg/mL)或二者联合预处理细胞1小时。孵育4小时后，洗涤并收集细胞，上机测试药物红色荧光强度。图5表明，载药的双靶向普鲁士蓝纳米颗粒通过CXCR4和CD44受体介导的内吞作用更好地进入细胞。
实施例10
载药双靶向普鲁士蓝纳米颗粒对HL60细胞的杀伤效果评价
采用CCK-8方法，将HL60以一定密度接种到96孔板中，样品组分别加入游离的柔红霉素、载药单靶向和双靶向普鲁士蓝纳米颗粒(均含有相同剂量的药物)，对照组加入等量的PBS，于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育24小时。孵育结束后，每孔加入10μLCCK-8,于恒温培养箱中继续孵育4小时，用酶标仪测定96孔板中各孔细胞液的吸光度(OD)，细胞存活率按照以下公式计算：
细胞存活率＝(样品OD-空白OD/对照OD-空白OD)×100％
样品OD：加入样品的细胞液的吸光度
对照OD：加入PBS的细胞液的吸光度
空白OD：空白培养基的吸光度
每个样品设置5个重复，图6结果表明，杀伤效果：DNR-E5/HA-PP-PBNPs>DNR-E5-PP-PBNPs>DNR-HA-PP-PBNPs>DNR-PP-PBNPs>DNR。
实施例11
双靶向普鲁士蓝纳米颗粒对HL60细胞迁移、粘附的抑制作用评价
将HL60细胞用钙黄绿素染色，然后用单靶向和双靶向普鲁士蓝纳米颗粒(普鲁士蓝纳米颗粒浓度为100μg/mL)处理1小时后接种到transwell上室(8μm)，每孔2×105个细胞，PBS处理组为阴性对照组，HA(200μg/mL)和E5(5μM)处理组为阳性对照组。迁移小室下室为含有CXCL12(200ng/mL)和HA(200μg/mL)的800μL完全培养基。孵育24小时后，用细胞计数仪检测下室的HL60细胞数量，将阳性对照组细胞迁移率设为100％，进而计算各实验组相对迁移率。
MS-5细胞接种到24孔板内形成基质细胞层，每孔2×105个细胞。用10μM钙黄绿素标记HL60细胞，用单靶向或双靶向普鲁士蓝纳米颗粒(普鲁士蓝纳米颗粒浓度为100μg/mL)处理1小时后接种到上室，PBS处理组为阴性对照组，HA(200μg/mL)和E5(5μM)处理组为阳性对照组。避光孵育2小时后，轻轻收集上层未粘附的HL60细胞，PBS清洗后使用酶标仪检测激发光488nm发射光514nm的荧光值。将阳性对照组细胞粘附率设为100％，进而计算各实验组相对迁移率。图7体外迁移、粘附抑制结果表明：相比于其他组，E5/HA-PP-PBNPs组迁移、粘附抑制最明显。
实施例12
载药双靶向普鲁士蓝纳米颗粒对白血病小鼠的治疗作用
将5-6周雌性非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠使用X射线照射，剂量为250cGy。约24小时后，将辐照小鼠通过尾静脉注射HL60细胞悬液(1×106个)。当小鼠表现出明显的白血病症状时，将建立的AML异种移植模型小鼠随机分为6组分别治疗，每周3次，治疗方式如下：正常组、对照组(生理盐水)、游离DNR、DNR-PP-PBNPs组、DNR-HA-PP-PBNPs组、DNR-E5-PP-PBNPs组、DNR-E5/HA-PP-PBNPs组。同时称量小鼠体重，观察小鼠生存状态，实时记录死亡情况。治疗结束后将小鼠处死，收集外周血、骨髓和脾脏内细胞，使用红细胞裂解液裂解红细胞后流式分析HL60细胞在以上各部分组织的比例，以评价各组小鼠治疗效果。图8结果表明：相比于其他组，DNR-E5/HA-PP-PBNPs组HL60细胞比例最小，取得了显著的抗白血病效应。
实施例13
载药的双靶向普鲁士蓝纳米颗粒减轻白血病小鼠肝、脾的浸润
将各实验组小鼠摘眼球取血、断颈处死后取出脾脏和肝脏，使用PBS漂洗以去除血液后，制备成石蜡切片，使用H&E染色和免疫组化方法观察HL60细胞浸润情况。体内浸润抑制结果表明：相比于其他组，DNR-E5/HA-PP-PBNPs组浸润抑制最明显。
表1为本发明双靶向普鲁士蓝纳米颗粒载药体系的粒径、载药率和包封率。
表1
