一种抗生物被膜的抗生素水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料和抗菌领域，涉及一种抗细菌生物被膜的抗生素水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，由于抗生素的滥用和不合理使用导致毒副作用以及耐药性的产生，例如药物剂量低于最低有效药物浓度时可通过诱导基因突变等增加细菌毒力、促进细菌产生耐药性；高药物浓度则会产生耳聋、肾损伤等多种毒副作用。并且细菌通常情况下是以生物被膜的形式存在，由细菌所分泌出的胞外多糖、胞外蛋白，死细菌及其裂解产生的核酸所组成，成为阻碍抗生素等药物的渗透和扩散的屏障，并且帮助细菌逃避生物体的免疫捕获，杀灭生物被膜中的细菌所需要的药物浓度为杀灭游离菌所需药物的成百上千倍，促使细菌产生耐药性。开发新型的抗生素由于经济效益以及政府激励等因素一直进展缓慢，因此可以通过对抗生素进行合理的按需给药，同时破坏生物被膜的屏障作用，提高其杀菌效率，从多方面抵制耐药性的生成。
针对抗生素的合理给药，我们设计了一类可按需释放的氨基糖苷抗生素水凝胶，由氨基糖苷抗生素作为成胶元件，与氧化的天然多糖高分子通过希夫碱键交联成胶。该类凝胶的希夫碱键会在细菌增殖产生的酸性环境下发生断裂，从而释放药物，并且可根据细菌感染程度对氨基糖苷抗生素的释放量进行自行调节，当细菌感染严重时，产生的酸性较强，因此氨基糖苷抗生素释放较多，而当细菌被杀灭后，酸碱度恢复至正常生理酸碱值时，其释放速率降低。该类凝胶尽管可一定程度上对氨基糖苷抗生素进行合理的给药，然而对生物被膜菌的杀灭效果严重下降，对被膜菌的最小抑菌浓度为游离细菌的几百倍。
生物被膜主要是由细菌分泌的胞外多糖基质、胞外蛋白、细菌以及死细菌所裂解产生的各种核酸组成，近年来研究者们发现，通过这些组分对应的生物膜可以显著降低生物被膜含量。V.Singh提出果胶酶、淀粉酶可高效降解曲霉菌MTCC1323的生物被膜，海藻酸酶可以显著降低粘液型绿脓杆菌生物被膜中细菌对抗生素的耐药性。V.V.Tetz证明脱氧核糖核酸酶(DNase)可以有效清除多种细菌的生物被膜，从而提高青霉素、头孢噻肟等多种抗生素对生物被膜中细菌的疗效。而L.L.Burrows则提出蛋白酶K可以分散利斯特菌的成熟细菌生物被膜。基于这些研究基础，我们可进一步在该凝胶中引入降解生物被膜的生物酶成分并制备成复合凝胶，在抗菌的同时降解生物被膜组分来提高氨基糖苷抗生素的灵敏度。
发明内容
本发明提供一种可对氨基糖苷类抗生素按需释放的水凝胶，可根据细菌感染的程度来调节抗生素的释放量。当细菌感染严重时，水凝胶中酸度较强，从而释放出的抗生素量较高；当细菌被杀灭后，水凝胶中的酸碱度趋于正常后，释放速率会变慢。并且在释放氨基糖苷抗生素的同时释放抗生物被膜因子，可降解形成的生物被膜从而消除其对细菌的保护，提高氨基糖苷抗生素对生物被膜感染的灵敏度。本发明是通过下述技术方案来实现的。
本发明提供一种抗生物被膜的抗生素水凝胶的制备方法，以氨基糖苷抗生素、降解生物被膜的生物酶作为成胶元件，与氧化多糖高分子通过酸性敏感的希夫碱键直接交联成胶，制备得到所述抗生素水凝胶。
本发明中，所述降解生物被膜的生物酶包括降解多糖的生物酶、降解蛋白质的生物酶、降解核酸的生物酶等中的一种或者多种。
其中，降解多糖的生物酶包括但不局限于以下种类：果胶酶、纤维素酶、海藻酸酶、淀粉酶等中的一种或者多种。
其中，降解蛋白质的生物酶包括但不局限于以下种类：中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K等中的一种或者多种。
其中，降解核酸的生物酶包括但不局限于以下种类：脱氧核糖核酸酶(Dnase)、核糖核酸酶(Rnase)、磷酸酯酶等中的一种或者多种。
本发明中，所述氨基糖苷类抗生素包括但不局限于以下种类：奈替米星，异帕米星，卷曲霉素，核糖霉素，西索米星，安普霉素，阿米卡星，卡那霉素，庆大霉素，巴龙霉素，妥布霉素，新霉素等中的一种或者多种。
本发明中，所述多糖高分子为天然多糖高分子或人工合成的天然多糖高分子。
本发明中，所述多糖高分子包括但不局限于以下材料：葡聚糖、壳聚糖、海藻酸、透明质酸、纤维素、木质素、软骨素、糖胺聚糖、淀粉、果胶、甘露聚糖等中的一种或者多种。
本发明中，通过氧化剂氧化多糖高分子得到含醛基的氧化多糖高分子。
本发明中，所述氨基糖苷类抗生素、降解生物被膜的生物酶、氧化多糖高分子之间是通过酸性敏感的希夫碱键交联成胶的。
本发明所述氨基糖苷类抗生素、降解生物被膜的生物酶和氧化多糖高分子组成成胶体系；其中，氨基糖苷类抗生素占成胶体系的的质量百分比为0.1％-20％，优选地，为1％；其中，生物酶占成胶体系的的浓度为3-3000u/mL，依生物酶的种类而异；其中，所述氧化多糖高分子占成胶体系的的质量百分比为1％-10％，优选地，为3％；在制备抗生素水凝胶前氧化多糖高分子的母液浓度为30mg/mL-200mg/mL，醛基化比例为5％-95％，优选地，为50％。
本发明中，成胶的制备方法为原位混合成胶，所述凝胶的凝胶化时间为1秒至60分钟之间。凝胶化时间与氧化多糖高分子的醛基化比例、氨基糖苷类抗生素、降解生物被膜的生物酶的用量、种类有关，醛基化比例越高，凝胶化时间越短；抗生素及降解生物被膜的生物酶的含量越高或氨基数目越多，凝胶化时间越短。
本发明中，所制得的抗生物被膜的抗生素水凝胶可同时对氨基糖苷抗生素进行合理的按需释放，并可同时释放抗生物被膜的活性成分。
本发明中，所述抗生物被膜的抗生素水凝胶可高效降解生物被膜，并可抑制生物被膜的产生及降解成熟生物被膜，可显著提高氨基糖苷抗生素的抗菌灵敏度，尤其是针对被膜菌的感染。
其中，所述抗生素水凝胶用于抑制细菌生物被膜的形成及降解成熟细菌生物被膜。
本发明还提供了所述抗生素水凝胶在制备抑制细菌感染或环境细菌污染的药物中的应用。
本发明中，所述抗生物被膜的氨基糖苷抗生素凝胶应用于临床各种创伤、插管、器件植入等感染治疗中，还可应用于其他生物被膜引起的细菌污染治理中。
本发明的主要特点在于：
(1)水凝胶由氨基糖苷类抗生素、降解生物被膜的生物酶作为交联剂，与氧化多糖高分子直接成胶。制备方法简易，所用材料安全。
(2)抗生物膜的成分为生物被膜组分所对应的酶，对生物膜的去除效率高，作用时间短，对菌种的普适性广。不仅可以抑制生物被膜的形成，还可降解成熟细菌生物被膜。
(3)该水凝胶可根据细菌的感染程度来合理的释放抗生物膜的生物酶以及氨基糖苷抗生素。
(4)该水凝胶利用破坏生物膜的屏障，来提高氨基糖苷抗生素抗菌灵敏度，操作方法简便，作用机理简单，抗生物膜效果显著。可应用于多种细菌的生物被膜感染中。
附图说明
图1为实施例1中果胶酶对阿米卡星最小抑菌浓度的影响。
图2为实施例2中中性蛋白酶对阿米卡星最小抑菌浓度的影响。
图3为实施例3中核酸酶对阿米卡星最小抑菌浓度的影响。
图4为实施例4-6中阿米卡星分别与果胶酶、中性蛋白酶、核酸酶所成的复合凝胶照片。
图5为实施例7中果胶酶分别与异帕米星、奈替米星、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、巴龙霉素所成的复合凝胶照片。
图6为实施例8中结晶紫染色分析果胶酶对绿脓杆菌生物被膜形成的影响。
图7为实施例9中平板菌落计数法分析果胶酶对成熟绿脓杆菌生物被膜的影响。
图8为实施例10中结晶紫染色分析中性蛋白酶对绿脓杆菌生物被膜形成的影响。
图9为实施例11中平板菌落计数法分析中性蛋白酶对成熟绿脓杆菌生物被膜的影响。
图10为实施例12中结晶紫染色分析脱氧核糖核酸酶对绿脓杆菌生物被膜形成的影响。
图11为实施例13中平板菌落计数法分析脱氧核糖核酸酶对成熟绿脓杆菌生物被膜的影响。
图12为实施例14中阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶对绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌被膜菌的抑菌圈。
图13为实施例15中MTT法分析阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶对细胞的毒性。
图14为实施例16中阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶的溶血行为。
图15为实施例17中没有经过任何处理，经绿脓杆菌被膜菌感染三天的昆明鼠，以及感染部分皮肤的菌落数统计图。
图16为实施例18中经阿米卡星/氧化右旋糖苷凝胶处理，并绿脓杆菌被膜菌感染三天的昆明鼠，以及感染部分皮肤的菌落数统计图。
图17为实施例19中经果胶酶/氧化右旋糖苷凝胶处理，并绿脓杆菌被膜菌感染三天的昆明鼠，以及感染部分皮肤的菌落数统计图。
图18为实施例20中经阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶处理，并绿脓杆菌被膜菌感染三天的昆明鼠，以及感染部分皮肤的菌落数统计图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、试验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
一、抗生物膜成分对氨基糖苷抗生素杀菌效果的影响：
实施例1：果胶酶对氨基糖苷抗生素杀灭游离菌及被膜菌灵敏度的影响
选取阿米卡星为氨基糖苷抗生素的模型代表药物，果胶酶为抗生物被膜制剂中降解多糖成分的代表。将绿脓杆菌接种于96孔板中，其中每孔100μL，细菌起始浓度为104CFU/mL，置于培养箱中37℃孵育三天，期间每天更换一次培养基，培养成熟生物被膜。第四天，将培养基移除，加入新鲜培养基，并分别加入不同浓度的阿米卡星，检测其对成熟生物被膜中细菌的最小抑菌浓度。同时，在不同浓度的阿米卡星溶液中引入一定浓度果胶酶(200u/mL)，检测二者混合物对成熟生物被膜中细菌的最小抑菌浓度。
如图1所示，阿米卡星对成熟生物被膜中绿脓杆菌的最小抑菌浓度为640ug/mL，为游离绿脓杆菌最小抑菌浓度2ug/mL的320倍，然而在果胶酶的作用下，阿米卡星对生物被膜当中绿脓杆菌所需的最小抑菌浓度为32ug/mL，说明在果胶酶的协助下，阿米卡星对被膜菌的灵敏度得到了显著提升。
实施例2：中性蛋白酶对氨基糖苷抗生素杀灭游离菌及被膜菌灵敏度的影响
按照实施例1中的方法制备成熟生物被膜，并采取同样的方法加入中性蛋白酶对成熟生物被膜进行处理，如图2所示，可观测到中性蛋白酶的使用量为3u/mL时便可显著提高阿米卡星对被膜菌的杀伤性能，将640ug/mL的MIC值降低到8ug/mL。
实施例3：磷酸酯酶对氨基糖苷抗生素杀灭游离菌及被膜菌灵敏度的影响
按照实施例1中的方法制备成熟生物被膜，并采取同样的方法加入磷酸酯酶对成熟生物被膜进行处理，如图3所示，可观测到磷酸酯酶为12.5u/mL时便可显著提高阿米卡星对被膜菌的杀伤性能，将640ug/mL的MIC值降低到16ug/mL。
二、氨基糖苷/抗生物膜剂/氧化多糖高分子复合凝胶的制备：
实施例4：氨基糖苷/抗生物膜剂/氧化天然多糖分子复合凝胶1的制备
选取阿米卡星为氨基糖苷抗生素的模型代表药物，果胶酶为抗生物被膜制剂中降解多糖成分的代表，氧化多糖高分子以右旋糖苷为例。其中阿米卡星10uL(母液为100mg/mL)，果胶酶15μL(终浓度200u/mL)，氧化右旋糖苷75μL(母液为50mg/mL)，三者混合，约2分钟成胶。
实施例5：氨基糖苷/抗生物膜剂/氧化多糖高分子复合凝胶2的制备
选取阿米卡星为氨基糖苷抗生素的模型代表药物，中性蛋白酶为抗生物被膜制剂中降解蛋白质成分的代表，氧化多糖分子以右旋糖苷为例。其中阿米卡星10μL(母液为100mg/mL)，中性蛋白酶15μL(母液为3u/mL)，氧化右旋糖苷75μL(母液为50mg/mL)，三者混合，约2分钟成胶。
实施例6：氨基糖苷/抗生物膜剂/氧化多糖高分子复合凝胶3的制备
选取阿米卡星为氨基糖苷抗生素的模型代表药物，磷酸酯酶为抗生物被膜制剂中降解核酸成分的代表。其中阿米卡星10μL(母液为100mg/mL)，5’-磷酸二酯酶15μL(终浓度12.5u/mL)，氧化右旋糖苷75μL(母液为50mg/mL)，三者混合，约2分钟成胶。
如图4所示，阿米卡星可与果胶酶、中性蛋白酶、脱氧核糖核酸酶形成稳定的复合凝胶。
实施例7：氨基糖苷/抗生物膜剂/氧化多糖高分子复合凝胶的制备
选取其他氨基糖苷抗生素药物，如异帕米星、奈替米星、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、巴龙霉素。抗生物成分以果胶酶为代表，制备与不同氨基糖苷抗生素药物的复合凝胶。其中各种氨基糖苷抗生素药物溶液10μL(母液为100mg/mL)，5’-磷酸二酯酶15μL(终浓度12.5u/mL)，氧化右旋糖苷75μL(母液为50mg/mL)，三者混合，均可成胶，成胶时间在1min至5min之间。
如图5所示，果胶酶可与多种氨基糖苷抗生素、氧化右旋糖苷形成复合凝胶。
三、氨基糖苷/抗生物膜剂/氧化多糖高分子复合凝胶抑制及降解生物被膜的性能评估
实施例8：阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶1抑制生物被膜性能评估
将直径2.0cm的盖玻片为载体放入24孔板中，加入绿脓杆菌菌液进行培养，构建绿脓杆菌的体外生物膜模型，并同时加入抗菌材料。总共分为4组，第一组中加入阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶1，第二组加入阿米卡星/氧化右旋糖苷凝胶，第三组加入果胶酶/氧化右旋糖苷凝胶，第四组不做任何处理。培养48h后，采用结晶紫染色法观察玻片上的生物膜形成情况，并采用显微镜对染色的图片进行拍照。
如图6所示，不做任何处理的玻片上存在非常致密的生物被膜，经过阿米卡星/氧化多糖凝胶或者果胶酶/氧化右旋糖苷凝胶处理过的玻片上生物被膜含量相对较低，而经过阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶处理的玻片上无明显生物被膜。可以得出果胶酶和阿米卡星联用可显著抑制绿脓杆菌生物被膜的生成。
实施例9：阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶1降解生物被膜性能评估
将直径2.0cm的盖玻片为载体放入24孔板中，加入绿脓杆菌菌液(初始浓度为106CFU/mL)进行培养3天，构建绿脓杆菌的体外成熟生物膜模型。第四天，加入抗菌材料。总共分为4组，第一组中加入阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶1，第二组加入阿米卡星/氧化右旋糖苷凝胶，第三组加入果胶酶/氧化右旋糖苷凝胶，第四组不做任何处理。培养24h后，采用平板菌落计数法统计成熟生物膜内存活细菌数目。
如图7所示，不经过任何抗菌处理的绿脓杆菌成熟生物被膜中的活细菌数目为5.0×1010CFU/mL，经过阿米卡星/氧化右旋糖苷凝胶或果胶酶/氧化右旋糖苷凝胶处理后的活细菌数目分别为7.0×109CFU/mL及3.67×1010CFU/mL。而经过阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶处理后，生物被膜内的活细菌数目显著降低，为2.67×107CFU/mL。可以得出果胶酶通过降解多糖从而破坏成熟生物被膜的多糖基质，可协助阿米卡星高效的杀灭生物被膜中的细菌。因此，果胶酶可显著提高阿米卡星对成熟生物膜中细菌的灵敏度。
实施例10：阿米卡星/中性蛋白酶/氧化多糖高分子复合凝胶2抑制生物被膜性能评估
将直径2.0cm的盖玻片为载体放入24孔板中，加入绿脓杆菌菌液(初始浓度为106CFU/mL)进行培养，构建绿脓杆菌的体外生物膜模型，并同时加入抗菌材料。总共分为4组，第一组中加入阿米卡星/中性蛋白酶/氧化多糖复合凝胶2，第二组加入阿米卡星/氧化多糖凝胶，第三组加入中性蛋白酶/氧化多糖凝胶，第四组不做任何处理。培养48h后，采用结晶紫染色法观察玻片上的生物膜形成情况，并采用显微镜对染色的图片进行拍照。
如图8所示，不做任何处理的玻片上存在非常致密的生物被膜，经过阿米卡星/氧化右旋糖苷凝胶或者中性蛋白酶/氧化右旋糖苷凝胶处理过的玻片上生物被膜含量相对较低，而经过阿米卡星/中性蛋白酶/氧化右旋糖苷复合凝胶处理的玻片上无明显生物被膜。可以得出中性蛋白酶和阿米卡星联用可显著抑制绿脓杆菌生物被膜的生成。
实施例11：阿米卡星/中性蛋白酶/氧化右旋糖苷复合凝胶2降解生物被膜性能评估
将直径2.0cm的盖玻片放入24孔板中，加入绿脓杆菌菌液(初始浓度为106CFU/mL)进行培养3天，构建绿脓杆菌的体外成熟生物膜模型。第四天，加入抗菌材料。总共分为4组，第一组中加入阿米卡星/中性蛋白酶/氧化右旋糖苷复合凝胶2，第二组加入阿米卡星/氧化右旋糖苷凝胶，第三组加入中性蛋白酶/氧化右旋糖苷凝胶，第四组不做任何处理。培养24h后，采用平板菌落计数法对成熟生物膜内存活的细菌数进行统计。
如图9所示，不经过任何抗菌处理的绿脓杆菌成熟生物被膜中的存活细菌数目为6.67×108CFU/mL，经过阿米卡星/氧化右旋糖苷凝胶或中性蛋白酶/氧化右旋糖苷凝胶处理后，生物被膜内的存活细菌数目分别为7×106CFU/mL及2.2×108CFU/mL。而经过阿米卡星/中性蛋白酶/氧化右旋糖苷复合凝胶处理后，生物被膜内的存活细菌数目只有2.6×105CFU/mL。可以看出中性蛋白酶可以通过降解胞外蛋白基质从而破坏成熟生物被膜，可协助阿米卡星联用高效的杀灭生物被膜中的细菌。因此，可以得出中性蛋白酶可显著提高阿米卡星对成熟生物膜中细菌的灵敏度。
实施例12：阿米卡星/5’-磷酸二酯酶/氧化右旋糖苷复合凝胶3抑制生物被膜性能评估
将直径2.0cm的盖玻片放入24孔板中，加入绿脓杆菌菌液(初始浓度为106CFU/mL)进行培养，构建绿脓杆菌的体外玻片生物膜模型，并同时加入抗菌材料。总共分为4组，第一组中加入阿米卡星/5’-磷酸二酯酶/氧化右旋糖苷复合凝胶1，第二组加入阿米卡星/氧化右旋糖苷凝胶，第三组加入5’-磷酸二酯酶/氧化右旋糖苷凝胶，第四组不做任何处理。培养48h后，采用结晶紫染色法观察玻片上的生物膜形成情况。
如图10所示，不做任何处理的玻片上存在非常致密的生物被膜，经过阿米卡星/氧化右旋糖苷凝胶或者5’-磷酸二酯酶/氧化右旋糖苷凝胶处理过的玻片上生物被膜含量相对较低，而经过阿米卡星/5’-磷酸二酯酶/氧化右旋糖苷复合凝胶处理的玻片上无明显生物被膜。可以得出5’-磷酸二酯酶和阿米卡星联用可显著抑制绿脓杆菌生物被膜的生成。
实施例13：阿米卡星/5’-磷酸二酯酶/氧化右旋糖苷复合凝胶3降解生物被膜性能评估
将直径2.0cm的盖玻片为载体放入24孔板中，加入绿脓杆菌菌液进行培养3天，构建绿脓杆菌的体外成熟生物膜模型。第四天，加入抗菌材料。总共分为4组，第一组中加入阿米卡星/5’-磷酸二酯酶/氧化右旋糖苷复合凝胶3，第二组加入阿米卡星/氧化右旋糖苷凝胶，第三组加入5’-磷酸二酯酶/氧化右旋糖苷凝胶，第四组不做任何处理。培养24h后，采用平板菌落计数法统计成熟生物膜内存活的细菌数。
如图11所示，不经过任何抗菌处理的绿脓杆菌成熟生物被膜中的细菌数目为4.67×1010CFU/mL，经过阿米卡星/氧化右旋糖苷凝胶或5’-磷酸二酯酶/氧化右旋糖苷凝胶处理后，生物被膜内存活的细菌数目分别为5.67×108CFU/mL及2.33×1010CFU/mL。而经过阿米卡星/5’-磷酸二酯酶/氧化右旋糖苷复合凝胶处理后，生物被膜内存活的细菌只有1.63×107CFU/mL。可以看出5’-磷酸二酯酶由于可以降解核酸从而破坏成熟生物被膜，与阿米卡星联用可以后可高效的杀灭生物被膜中的细菌。因此，可以得出5’-磷酸二酯酶可显著提高阿米卡星对成熟生物膜中细菌的灵敏度。
四、氨基糖苷/抗生物膜剂/氧化多糖高分子复合凝胶的抗菌灵敏度评估
实施例14：琼脂打孔法评估氨基糖苷/被膜酶/氧化多糖复合凝胶的抗菌活性
在6孔板中接种绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌，孵育三天构建成熟生物被膜，之后将上层培养基移除，通过超声将底部的成熟生物被膜配制成菌悬液。制备LB固体平板，同时将成熟生物被膜菌悬液加入培养基中，使得终浓度为105CFU/mL，用50μL的枪头在凝固好的琼脂板上打孔3个，在孔中分别加入20μL阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷凝胶、阿米卡星/氧化右旋糖苷凝胶以及果胶酶/氧化右旋糖苷凝胶。孵育24h，检测抑菌圈的差异。
如图12所示，可以看到在果胶酶存在的情况下，阿米卡星对生物被膜菌的抑菌圈明显增大，而可以看到果胶酶并没有抗菌效果，因此可以得出在果胶酶的协助下，阿米卡星处理生物被膜菌的灵敏度显著增强。
五、氨基糖苷/抗生物膜剂/氧化多糖高分子复合凝胶的生物安全性
实施例15：氨基糖苷/被膜酶/氧化多糖高分子复合凝胶的细胞毒性
在96孔板中接种NIH 3T3细胞，接种密度为5000细胞/孔，37℃，5％CO2，完全培养条件下孵育24h，待细胞密度达到80％以上进行实验。细胞毒性实验以阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶1为例，同时将200μL复合凝胶1放入不含有牛血清蛋白的培养基中，浸泡24h，之后将浸出液取出，并补充牛血清蛋白使得终浓度为10％。将浸出液配制成不同浓度，分别加入接种有NIH 3T3细胞的微孔中，每孔50μL，处理4小时后，采用MTT法观测细胞的存活率。
如图13所示，在10mg/mL阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶的浸出液中，NIH 3T3细胞的存活率仍能够达到92.6％，可以看出阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶对正常组织细胞不具有明显毒性。
实施例16.氨基糖苷/抗生物膜剂/氧化多糖高分子复合凝胶的溶血性
溶血性实验以阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶1为例。通过眼球取血法取小鼠血1mL，配制成2％血细胞悬浮液。另配制20μL复合凝胶1、20μL的Triton X-100(0.5％)，以及pH 7.4的PBS(20μL)，每个样品中加入1mL的血细胞悬浮液在37℃处理1小时，后拍照进行对比。并将混合物在2000r/min的转速下离心5分钟，取上清液在540nm处检测吸收度，将Triton X-100处理后的上清液吸收度设置为100％参照。得到处理后的血清吸收度与材料之间的关系如图14所示。
如图14所示，经阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶1处理后的血清吸收度为2.62％，而经PBS处理的血清吸收率为3.14％，并且也可以通过照片中看出没有出现明显的溶血现象，显示了较好的血液安全性能。
六、氨基糖苷/抗生物膜剂/氧化多糖高分子复合凝胶的体内抗菌活性评估
实施例17.绿脓被膜菌对昆明鼠的皮肤感染评估
该组昆明鼠麻醉后背部剃毛，不在体内注射任何抗菌材料，直接在背部注70μL(108CFU/mL)的绿脓被膜菌。三天后观察昆明鼠注射细菌部位的感染情况，并且取下感染部位的皮肤通过点板方法计算细菌菌落数。
如图15所示，没经过任何抗菌材料处理的昆明鼠的感染部位皮肤发生了严重溃烂，单位体积的菌落数为1.5×1010CFU/mL，皮肤外观显示存在严重的感染情况。
实施例18：阿米卡星/氧化右旋糖苷水凝胶对绿脓被膜菌的体内抑菌效果评价
研究阿米卡星/氧化右旋糖苷水凝胶(药物含量为)在体内的抑菌效果。具体方法：将8周的昆明鼠麻醉后背部剃毛，在老鼠背部皮下注射阿米卡星/氧化右旋糖苷水凝胶(100μL)，随后注射70μL(108CFU/mL)的绿脓被膜菌。三天后观察昆明鼠注射细菌部位的感染情况，并且取下感染部位的皮肤通过点板方法计算细菌菌落数。
如图16所示，注射有阿米卡星/氧化右旋糖苷水凝胶的老鼠感染部位的皮肤有部分溃烂，单位体积皮肤的菌落数为8.9×109CFU/mL，皮肤外观也显示存在一定程度的感染情况。
实施例19：果胶酶/氧化右旋糖苷凝胶的体内抑菌效果评价
研究制备得到的果胶酶/氧化右旋糖苷凝胶在体内的抑菌效果。
具体方法：将8周的昆明鼠麻醉后背部剃毛，在老鼠背部皮下注射果胶酶/氧化右旋糖苷凝胶，随后注射70μL(108CFU/mL)的绿脓被膜菌。三天后观察昆明鼠注射细菌部位的感染情况，并且取下感染部位的皮肤通过平板菌落计数法对皮肤中的细菌数目进行统计。
如图17所示，注射有果胶酶/氧化右旋糖苷凝胶的老鼠感染部位的皮肤基本完好，单位体积皮肤的菌落数为1.3×1010CFU/mL，皮肤外观也显示并不存在严重的感染情况。
实施例20：阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶的体内抑菌效果评价
研究制备得到的阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶1在体内的抑菌效果。
具体方法：将8周的昆明鼠麻醉后背部剃毛，在老鼠背部皮下注射阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶1，随后注射70μL(108CFU/mL)的绿脓被膜菌。三天后观察昆明鼠注射细菌部位的感染情况，并且取下感染部位的皮肤通过平板菌落计数法对皮肤中的细菌数目进行统计。
如图18所示，注射有阿米卡星/果胶酶/氧化右旋糖苷复合凝胶1的老鼠感染部位的皮肤基本完好，单位体积皮肤的菌落数为2.6×108CFU/mL，皮肤外观也显示并不存在严重的感染情况。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
