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糖工程

2021-02-13 22:45:57

糖工程

  优先权要求

  本申请要求2017年12月18日提交的美国临时申请号62/607,111的权益。上述全部内容通过引用并入本文。

  联邦资助的研究或开发

  本发明是基于由美国国立卫生研究院(NIH)授予的授权号AR068272在政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

  技术领域

  本公开涉及糖工程,例如通过体内工程化抗体聚糖以调节IgG效应子功能用于达到各种治疗效果,例如治疗在器官移植过程中的IgG介导的病症、减轻自身抗体介导的炎症、治疗自身免疫疾病和/或治疗抗体介导的损伤。

  背景技术

  构成人体的蛋白质和细胞被糖修饰(Varki,A.Glycobiology 3,97-130(1993))。糖可以与许多类型的生物分子连接形成糖缀合物。将糖/糖类与自身和其他分子连接的酶促过程称为糖基化。糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂是在哺乳动物细胞中发现的最丰富的糖缀合物。

  已经确定异常糖基化与许多不同的疾病有关。因此,需要开发工程化糖基化的工具和方法,并进一步使用这类工具或方法来治疗与异常糖基化有关的各种病症。

  发明内容

  本公开涉及糖工程。

  一方面,本公开涉及具有抗体重链CH2区;抗体重链CH3区;和唾液酸转移酶的催化结构域的融合多肽,其中唾液酸转移酶的催化结构域催化糖蛋白的唾液酸化。

  在一些实施方案中,唾液酸转移酶是β-半乳糖苷α-2,6唾液酸转移酶1。在一些实施方案中,唾液酸转移酶是人唾液酸转移酶。

  在一些实施方案中,抗体重链CH2区是人IgG重链CH2区。在一些实施方案中,抗体重链CH3区是人IgG重链CH3区。

  另一方面,本公开涉及具有抗体重链CH2区;抗体重链CH3区;和半乳糖基转移酶的催化结构域的融合多肽,其中半乳糖基转移酶的催化结构域催化糖蛋白的半乳糖基化。

  在一些实施方案中,半乳糖基转移酶是β-1,4-半乳糖基转移酶1。在一些实施方案中,半乳糖基转移酶是人半乳糖基转移酶。

  在一些实施方案中,抗体重链CH2区是人IgG重链CH2区。在一些实施方案中,抗体重链CH3区是人IgG重链CH3区。

  一方面,本公开提供编码如本文所述的融合多肽的多核苷酸。

  一方面,本公开还提供具有编码如本文所述的融合多肽的多核苷酸序列的载体。

  一方面,本公开涉及一种具有如本文所述的载体的细胞,并且载体任选地表达如本文所述的融合多肽。

  在一方面,本公开涉及一种异源多聚体,该异源多聚体具有第一融合多肽,所述第一融合多肽具有抗体重链CH2区、抗体重链CH3区和唾液酸转移酶的催化结构域,其中唾液酸转移酶的催化结构域催化糖蛋白的唾液酸化;和第二融合多肽,所述第二融合多肽具有抗体重链CH2区、抗体重链CH3区和半乳糖基转移酶的催化结构域,其中半乳糖基转移酶的催化结构域催化糖蛋白的半乳糖基化。

  在一些实施方案中,异源多聚体是异源二聚体,并且第一融合多肽与第二融合多肽缔合,从而形成异源二聚体。

  在一些实施方案中,唾液酸转移酶是β-半乳糖苷α-2,6唾液酸转移酶1。在一些实施方案中,唾液酸转移酶是人唾液酸转移酶。

  在一些实施方案中,半乳糖基转移酶是β-1,4-半乳糖基转移酶1。在一些实施方案中,半乳糖基转移酶是人半乳糖基转移酶。

  一方面,本公开涉及治疗患有IgG介导的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用有效量的具有如本文所述的异源多聚体的组合物。

  在一些实施方案中,IgG介导的病症是炎症。在一些实施方案中,IgG介导的病症是自身免疫疾病。

  在一些实施方案中,自身免疫疾病是关节炎。在一些实施方案中,自身免疫疾病是古德帕斯彻病(Goodpasture’s disease)。在一些实施方案中,自身免疫疾病是肾毒性肾炎。在一些实施方案中,自身免疫疾病是乳糜泻、1型糖尿病、格雷夫斯病(Gravesdisease)、炎性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮。

  另一方面,本公开还涉及治疗患有IgG介导的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用有效量的具有唾液酸转移酶的催化结构域的第一多肽和有效量的具有半乳糖基转移酶的催化结构域的第二多肽,其中唾液酸转移酶的催化结构域催化糖蛋白的唾液酸化和半乳糖基转移酶的催化结构域催化糖蛋白的半乳糖基化。

  在一些实施方案中,第一多肽还具有抗体重链CH2区和抗体重链CH3区。

  在一些实施方案中,第二多肽还具有抗体重链CH2区和抗体重链CH3区。

  在一些实施方案中,IgG介导的病症是炎症。在一些实施方案中,IgG介导的病症是自身免疫疾病。

  在一些实施方案中,自身免疫疾病是关节炎。在一些实施方案中,自身免疫疾病是古德帕斯彻病。在一些实施方案中,自身免疫疾病是肾毒性肾炎。在一些实施方案中,自身免疫疾病是乳糜泻、1型糖尿病、格雷夫斯病、炎性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮。

  一方面,本公开还涉及在受试者中治疗器官移植期间的抗体介导的损伤的方法。该方法包括向受试者施用有效量的具有如本文所述的异源多聚体的组合物。

  另一方面,本公开还涉及在受试者中治疗器官移植期间的抗体介导的损伤的方法。该方法包括向受试者施用有效量的具有唾液酸转移酶的催化结构域的第一多肽和有效量的具有半乳糖基转移酶的催化结构域的第二多肽,其中唾液酸转移酶的催化结构域催化糖蛋白的唾液酸化和半乳糖基转移酶的催化结构域催化糖蛋白的半乳糖基化。

  一方面,本公开还提供异源多聚体,其具有:第一融合多肽,其具有胶原三聚结构域(collagen trimerizing domain)和唾液酸转移酶的催化结构域;第二融合多肽,其具有胶原三聚结构域和半乳糖基转移酶的催化结构域;和第三融合多肽,其具有胶原三聚结构域,其中第一融合多肽、第二融合多肽和第三融合多肽彼此结合,形成异源多聚体。

  在一些实施方案中,第三融合多肽还具有唾液酸转移酶的催化结构域。在一些实施方案中,第三融合多肽还具有半乳糖基转移酶的催化结构域。

  另一方面,本公开还涉及异源多聚体,其具有具四个链霉亲和素多肽的四聚体;以及四个多肽,其中四个多肽中的每一个与生物素相连,并且四个多肽中的一个或多个具有唾液酸转移酶的催化结构域或半乳糖基转移酶的催化结构域,其中四个多肽中的每一个与具有四个链霉亲和素多肽的四聚体结合。

  在一些实施方案中,四个多肽中的每一个具有唾液酸转移酶的催化结构域或半乳糖基转移酶的催化结构域。

  在一些实施方案中,四个多肽中的每一个具有唾液酸转移酶的催化结构域。在一些实施方案中,四个多肽中的每一个具有半乳糖基转移酶的催化结构域。

  在一些实施方案中,四个多肽中的两个各自具有唾液酸转移酶的催化结构域,并且四个多肽中的两个各自具有半乳糖基转移酶的催化结构域。

  一方面,本公开还提供异源多聚体,其具有:抗体或其抗体片段;唾液酸转移酶的催化结构域;和半乳糖基转移酶的催化结构域,其中唾液酸转移酶的催化结构域和半乳糖基转移酶的催化结构域与抗体或其抗体片段连接。

  在一些实施方案中,异源多聚体具有抗体,并且该抗体具有两个抗体重链和两个抗体轻链。在一些实施方案中,唾液酸转移酶的催化结构域连接至抗体重链的C端。在一些实施方案中,唾液酸转移酶的催化结构域连接至抗体轻链的C端。在一些实施方案中,半乳糖基转移酶的催化结构域连接至抗体重链的C端。在一些实施方案中,半乳糖基转移酶的催化结构域连接至抗体轻链的C端。

  如本文所用,术语“多聚体”是指具有两个以上的多肽的蛋白或由两个以上的多肽形成的多肽复合物。多肽可以彼此缔合,形成四级结构。

  如本文所用,术语“异源多聚体”是指具有超过一种类型的多肽的多聚体。

  如本文所用,术语“同源二聚体”是指具有两个相同多肽的多聚体。

  如本文所用,术语“异源二聚体”是指具有两个多肽的多聚体,并且两个多肽是不同的。

  如本文所用,术语“腔结构域”或“酶促腔结构域”是指糖基化酶以其天然状态位于高尔基体腔内的部分。糖基转移酶的酶促腔结构域通常是糖基化酶的可溶部分。

  如本文所用,术语“可溶部分”或“可溶结构域”是指可溶的糖基化酶的部分。对于反式高尔基体糖基化酶,可溶性部分通常是糖基化酶的酶促腔结构域。对于非反式高尔基体糖基化酶,整个糖基化酶可以是可溶的。因此,在一些实施方案中,可溶部分可以是整个糖基化酶或糖基化酶的一部分。

  如本文所用,术语“催化结构域”是指具有催化活性的蛋白质的一部分。

  如本文所用,术语“IgG介导的病症”是指由免疫球蛋白G(IgG)的水平升高或活性升高引起或表征的病症。

  如本文所用,术语“连接”是指例如通过化学键(例如肽键或碳-碳键)、通过疏水相互作用、通过范德华相互作用和/或通过静电相互作用共价或非共价缔合。

  除非另有定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文描述用于本发明的方法和材料;也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的,而无意于进行限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均通过引用将其整体并入本文。在发生冲突的情况下,以本说明书包括定义为准。

  根据以下详细描述和附图以及权利要求,本发明的其他特征和优点将变得显而易见。

  附图说明

  图1A-1E.增溶和工程化糖基转移酶。(A-C)显示IgG、其复合物、双天线型(biantennary)Fc聚糖和酶-Fc融合体的示意图。(A)IgG Fab和在N297处具有单个N-连接的糖基化位点的Fc。(B)由GlcNAc(正方形)、甘露糖(绿色圆圈)、以及可变添加的岩藻糖(红色三角形)、二等分GlcNAc、半乳糖(黄色圆圈)或唾液酸(紫色菱形)组成的聚糖核心结构(在方框内)。(C)具有胞质(cyto)、跨膜(TMD)和酶促腔结构域(Lumen)的反式高尔基体酶B4GALT1和ST6GAL1。导致其分泌的ST6GAL1切割位点EFQ41-43为红色。将B4GALT1和ST6GAL1的酶促腔结构域与IgG Fc融合(分别为B4Fc和ST6Fc)。(D,E)单独或一起对B4Fc、ST6Fc的糖基转移酶活性进行连接特异性凝集素印迹分析。与工程化酶和糖-核苷酸供体一起孵育后,目标糖蛋白胎球蛋白(D)或小鼠和人IgG Fcs(E)上的末端β1,4半乳糖(ECL)或α2,6唾液酸(SNA)(用于B4Fc的UDP-Gal,用于ST6Fc的CMP-SA)。

  图2A-2H.体内唾液酸化的抗炎活性。(A)用K/BxN血清和PBS(黑色圆圈)、ST6Fc(粉红色三角形)、B4Fc(橙色菱形)或IVIG(蓝色正方形)处理小鼠,并在几天内监测爪肿胀。(B)绘制了(A)中单个小鼠的第10天临床评分。(C)对K/BxN处理的小鼠给予PBS(黑色圆圈)、IVIG(蓝色正方形)或B4ST6Fc(红色三角形),并在几天内监测爪肿胀。(D)显示(C)中单个小鼠的第9天临床评分。(E)在用PBS、IVIG或B4ST6Fc处理的小鼠中诱发关节炎后7天,爪部切片的H&E。用NTN诱导并用PBS(黑色圆圈)、IVIG(蓝色正方形)或B4ST6Fc(红色三角形)处理的小鼠在第7天的血尿素氮(BUN)水平(F)和存活(G)。(H)在施用PBS、IVIG或B4ST6Fc后7天,来自NTN处理的小鼠的染色的冷冻肾切片的PAS。绘制平均值和标准偏差。结果代表至少两个独立的重复。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.005,****p<0.001,ns(无显著性),由双向ANOVA和Tukey多重比较检验确定。

  图3A-3G.体内唾液酸化的受体要求。(A)对FcγRIIB-/-小鼠给予K/BxN血清和PBS(黑色圆圈)、IVIG(蓝色正方形)或B4ST6Fc(红色三角形),并在几天内监测爪肿胀。(B)绘制(A)的单个小鼠的第6天临床评分。(C)给WT小鼠施用TKO SIGN-R1抗体和K/BxN血清和PBS(黑色圆圈)、IVIG(蓝色正方形)或B4ST6Fc(红色三角形),并在几天内监测爪肿胀。(D)显示(C)中的单个小鼠的第6天临床评分。(E)对SIGN-R1-/-和(F)hDC-SIGN+/SIGN-R1-/-小鼠给予K/BxN血清和PBS(圆圈)、IVIG(正方形)或B4ST6Fc(三角形)并在几天内监测爪肿胀。(G)显示SIGN-R1-/-和hDC-SIGN+/SIGN-R1-/-小鼠的第6天临床评分。绘制平均值和标准偏差。结果代表至少两个独立的重复。**p<0.01,***p<0.005,****p<0.001,ns(无显著性),通过双向ANOVA和Tukey多重比较检验确定。

  图4A-4E.体内唾液酸化的酶要求。(A)B4GALT1和酶死亡的ST6GAL1(C350A,C361A)和所得的B4ST6FcCACA的示意图。(B)在EndoS处理后除去B4Fc和ST6Fc上的Fc聚糖的示意图,得到B4ST6Fc-Endo。(C)用B4ST6Fc、B4ST6FcCACA或B4ST6Fc-Endo孵育后,对人IgG Fcs上的末端β1,4半乳糖(ECL)或α2,6唾液酸(SNA)进行连接特异性凝集素印迹分析(Linkage-specificlectin blots assaying)。通过在(G0)IgG Fc上与UDP-Gal孵育来测定半乳糖基化。唾液酸转移酶活性通过在(G2)IgG Fc上与CMP-SA孵育进行评估。(D)向WT小鼠施用K/BxN血清和PBS(黑色圆圈)、IVIG(蓝色正方形)或B4ST6Fc(红色三角形)、B4ST6FcCACA(黑色十字,红色虚线)或B4ST6Fc-Endo(黑色边缘的红色三角形,红色虚线)并在几天内监测爪肿胀。(E)显示(D)中的小鼠的第6天临床评分。绘制平均值和标准偏差。结果代表至少两个独立的重复。*p<0.05,**p<0.005,****p<0.001,ns(无显著性),由双向ANOVA和Tukey多重比较检验确定。

  图5A-5E.表征自身免疫炎症期间的体内唾液酸化。(A,B)在施用PBS、IVIG或B4ST6Fc后,在第7天NTN处理的小鼠中从血清或肾脏IgG中回收的总聚糖的HPLC痕迹。阴影对应于末端糖的保留时间(蓝色,G0;黄色,G1;橙色,两个G2;粉红色,一个S1;紫色,S2)。(C,D)(A,B)中所述的来自IgG的单唾液酸化和无半乳糖基化(agalactosylated)的聚糖的比率(S1/G0)。(E)将从接受PBS、IVIG或B4ST6Fc的NTN处理的小鼠的血清和肾脏中纯化的总IgG通过免疫印迹检测小鼠和人IgG。绘制平均值和标准偏差。结果代表至少两个独立的重复。**p<0.01,ns(无显著性),由双向方差分析和Tukey多重比较检验确定。

  图6A-6H.血小板活化和体内唾液酸化。(A)将用PBS、IVIG和B4ST6Fc处理后的未经处理和第7天NTN处理的小鼠的肾脏进行肾小球(mNephrin,绿色)、小鼠IgG(蓝色)、血小板(CD41,红色)、活化的血小板(CD62,黄色)的检测。显示代表性的个体图像和叠加图像。(B,C)将未处理和氯吡格雷处理的小鼠给予K/BxN血清和PBS(黑色圆圈)、IVIG(蓝色正方形)或B4ST6Fc(红色三角形),并在几天内监测爪肿胀。(D)显示未处理和氯吡格雷处理的小鼠的第6天临床评分。在未处理的(E,F)和氯吡格雷处理的(G,H)动物中诱导NTN,并监测第7天的BUN水平(mg/dL)和存活。绘制平均值和标准偏差。结果代表至少两个独立的重复。*p<0.05,***p<0.005,****p<0.001,ns(无显著性),通过双向ANOVA和Tukey多重比较检验确定。

  图7A-7D.治疗体内唾液酸化。(A,B)未处理、活化(凝血酶+)或在氯吡格雷处理(凝血酶+,氯吡格雷+)后活化的人血小板血浆,并测定UPD-Gal(A)和CMP-SA(B)。(C-D)在第0天用K/BxN血清或第3天用PBS(黑色圆圈)、IVIG(蓝色正方形)或B4ST6Fc(红色三角形)处理小鼠,并在几天内监测爪肿胀(C)。(D)显示(C)中的单个小鼠的第7天临床评分。绘制平均值和标准偏差。结果代表至少两个独立的重复。**p<0.01,***p<0.005,****p<0.001,ns(无显著性),通过双向ANOVA和Tukey多重比较检验确定。

  图8A-8D.可溶性半乳糖基和唾液酸转移酶蛋白的工程化和表征。(A)人ST6GAL1的蛋白序列。黄色和浅蓝色阴影序列分别表示胞质和跨膜结构域(TMD)。编号的红色三角形表示与IgG Fc融合的唾液酸转移酶的起始位点。带有星号的三角形表示该手稿中所有实验中使用的可溶性ST6GAL1的起始位点。(B)显示每个ST6GAL1的示意图。(C)对于与IgG(N,天然蛋白;D,变性蛋白)的反应性的Fc酶蛋白的免疫印迹。当在EFQ41-43上游融合时,ST6Fc在变性时被裂解成Fc和ST6GAL1。(D)ST6Fc、B4Fc和B4ST6Fc与B4GALT1、ST6GAL1或IgG的反应性的免疫印迹。

  图9A-9B.NTN诱导后的抗羊应答。(A,B)用PBS(黑色圆圈)、高剂量IVIG(蓝色正方形)或B4ST6Fc(2.5mg/kg)(红色三角形)处理NTN诱导的小鼠。通过ELISA确定第7天的抗羊IgG滴度。

  图10A-10B.体内唾液酸化对照组的受体要求。(A,B)分别是图2B和2D的K/BxN注射后未处理的C57BL/6小鼠在第6天的临床评分。这些来自图3A-3D中示出的FcγRIIB-/-(A)和TKO-SIGN-R1(B)处理的对照组。结果代表至少两个独立的重复。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.005,****p<0.001,ns(无显著性),,通过双向ANOVA和Tukey多重比较检验确定。

  图11A-11D.稳态过程中的体内唾液酸化。用半衰期图的形式对施用后以规定间隔的IVIG(A)和B4ST6Fc(B)的血清浓度作图。(C)前一周施用PBS(黑色圆圈)、B4ST6Fc(红色三角形)后的血液检验值或前两个月施用B4ST6Fc(空心红色三角形)后的血液检验值。WBC,白细胞;LYM,淋巴细胞;MONO,单核细胞;GRAN,粒细胞;HCT,血细胞比容;MCV,平均红细胞体积;RDW,红细胞分布宽度;HGB,血红蛋白;MCHC,平均红细胞血红蛋白浓度;MCH,平均红细胞血红蛋白;RBC,红细胞(erythrocyte)计数;PLT,血小板;MPV,平均血小板体积;BUN,血尿素氮;ALT(GPT),丙氨酸氨基转移酶;ALP,碱性磷酸酶;GGT,γ-谷氨酰转移酶。(D)在前一周施用PBS、B4ST6Fc或前两个月施用B4ST6Fc后,绘制单唾液酸化聚糖和无半乳糖基化聚糖的比率(S1/G0)。

  图12.炎症期间的部位特异性体内唾液酸化。从NTN诱导的小鼠肾脏中回收的二唾液酸化聚糖和无半乳糖基化聚糖IgG的比率(S2/G0)。

  图13A-13B.NTN体内唾液酸化期间的血小板。(A)检查未处理的和在PBS、IVIG和B4ST6Fc处理的动物中NTN诱导后7天的肾脏的肾小球(mNephrin,绿色)、DAPI(蓝色)、血小板(CD41)、活化的血小板(CD62)。显示代表性的个体图像和叠加图像。(B)用PBS(黑色圆圈)、高剂量IVIG(蓝色正方形)或B4ST6Fc(2.5mg/kg)(红色三角形)处理NTN诱导的小鼠的第7天抗羊IgG滴度,其中一些也接受氯吡格雷处理。

  图14A-14B.预防性和治疗性体内唾液酸化。(A)在第0天对K/BxN处理的小鼠给予PBS(黑色圆圈)、IVIG(蓝色正方形)或B4ST6Fc(红色三角形),并在几天内监测爪肿胀。(B)显示单个小鼠的第7天临床评分。这些是图7C和7D所示的数据的对照组。

  图15A是显示糖基化酶的可溶部分的图。

  图15B是显示由与IgG Fcs融合的糖基化酶的可溶部分形成的二聚体的图。

  图15C是显示由与胶原三聚结构域融合的糖基化酶的可溶部分形成的三聚体的图。

  图15D是显示由糖基化酶的可溶部分形成的四聚体的图,该糖基化酶被生物素连接酶生物素化并随后与链霉亲和素(SA)一起孵育。

  图16A是显示与抗体重链的C端融合的糖基化酶的可溶部分的图。

  图16B是显示与抗体轻链的C端融合的糖基化酶的可溶部分的图。

  图17是显示工程化的糖-酶(glycol-enzymes)可用于治疗炎症的图。

  图18显示具有和不具有“旋钮入孔(knobs-into-holes)”突变、ST6Fc同二聚体和B4Fc同二聚体的B4ST6Fc的蛋白质印迹结果(具有抗人IgG)和考马斯凝胶染色。

  图19显示原始B4ST6Fc、异源二聚体B4ST6FcKln和B4ST6FcG3在关节炎模型中的作用。

  图20列出几种示例性糖基化酶的氨基酸序列。

  图21列出几种人和小鼠免疫球蛋白G(IgG)的示例性片段可结晶区(Fc)的氨基酸序列。

  图22列出几种示例性糖基化酶-Fc融合蛋白的氨基酸序列。

  图23列出狗IgG重链A、狗IgG重链B、狗IgG重链C、狗IgG重链D、狗ST6GAL1和狗B4GALT1的氨基酸序列。

  图24列出猫IgG1a重链、猫IgG1b重链、猫ST6GAL1和猫B4GALT1的氨基酸序列。

  图25列出牛IgG1重链恒定区、牛IgG2重链恒定区、牛IgG3重链恒定区、牛ST6GAL1和牛B4GALT1的氨基酸序列。

  图26列出马IgG1重链恒定区、马IgG2重链恒定区、马IgG3重链恒定区、马IgG4重链恒定区、马IgG5重链恒定区、马IgG6重链恒定区、马ST6GAL1和马B4GALT1的氨基酸序列。

  具体实施方式

  免疫球蛋白γ(IgG)抗体是免疫系统的主要效应蛋白。它们在病原体暴露或接种疫苗后必不可少,桥接了适应性和先天性免疫系统以清除微生物,但是当它们针对自身抗原而产生时,也可促使自身免疫疾病的发病(Nimmerjahn和Ravetch,2008b)。IgG抗体的双峰活性允许通过具有高亲和力的抗原结合片段(Fab,图1A)同时识别抗原,并通过可结晶片段(Fc,图1A)和由先天免疫细胞表达的Fcγ受体(FcγRs)或补体级联反应的启动子C1q之间的相互作用来募集和活化白细胞(Nimmerjahn等人,2015)。这会触发IgG的典型炎症效应子功能,例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、已识别的抗原的摄入和补体依赖性细胞毒性(CDC)(Franklin,1975,Huber等人,1976)。

  在所有IgG的每条重链上均存在单个N-连接聚糖,其位于Fc中的天冬酰胺-297处(N-297,图1A-1B)(Arnold等人,2007)。聚糖的核心七庚糖具有复杂的双天线型结构,其可以通过添加岩藻糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖或唾液酸而变化(图1B)。这些可变的添加导致了巨大的异质性,在健康个体的循环IgG中鉴定出30多种不同的聚糖(Kaneko等人,2006b)。重要的是,过去十年的研究表明,Fc聚糖的组成对IgG效应子功能具有深远的影响(Jefferis,2005,Jefferis,2009a,Jefferis,2009b)。与岩藻糖基化IgG相比,具有去岩藻糖基化(afucosylated)Fc聚糖的IgG较活化FcγR、FcγRIIIA具有50倍提高的亲和力,并且在体内显示显著增强的ADCC(Ferrara等人,2011,Natsume等人,2005,Okazaki等人,2004,Shields等人,2002)。结果,一些旨在引起ADCC的下一代治疗性IgG被工程化为缺乏岩藻糖(Beck等人,2010)。确实,最近的研究将这些发现扩展到了传染病,确定了具有去岩藻糖基化Fc聚糖的登革热特异性IgG与登革热出血热之间的关联(Wang等人,2017),以及去岩藻糖基化IgG在控制潜在非活化的TB传染病之间的关联(Lu等人,2016)。迄今为止最成功的HIV疫苗试验导致在IgG Fc聚糖上二等分GlcNAc的水平增加,这一修饰也增加了对FcγRIIIA的亲和力,尽管程度不如去岩藻糖基化(Ackerman等人,2013,Chung等人,2014,Davies等人,2001)。相反地,Fc聚糖的末端唾液酸化降低了IgG对I型FcγRs的亲和力,并且唾液酸化的IgG在体内启动ADCC的能力降低(Scallon等人,2007,Anthony等人,2008a,Li等人,2017)。流感疫苗接种后,IgG唾液酸化作用的增强归因于通过II型FcγR-CD23途径改善的亲和力成熟(Wang等人,2015)。尽管对IgG糖基化的调控尚不完全了解,但IL-23已参与调控ST6GAL1的表达(Pfeifle等人,2017)。

  矛盾的是,IgG在临床上通常用于抑制炎症(Negi等人,2007)。静脉免疫球蛋白(IVIG)是一种源自数以万计的健康供体的多克隆单体IgG的治疗性制剂,并且已以高剂量(1-2g/kg)在临床上成功使用了近40年,用于治疗炎症和自身免疫疾病(Imbach等人,1981,Nimmerjahn和Ravetch,2008a)。机理研究表明,IVIG的Fc部分在体内具有足够的抗炎活性(Debre等人,1993,Samuelsson等人,2001),并且这需要抑制性FcγRIIB(Samuelsson等人,2001,Schwab等人,2012,Schwab等人,2014,Tackenberg等人,2009,Tackenberg等人,2010)。进一步研究表明,Fc聚糖的唾液酸化对于该活性是必不可少的(Kaneko等人,2006b,Anthony等人,2008a)。唾液酸化的IgG Fc结合II型FcγR、人DC-SIGN或鼠类SIGN-R1而未结合活化的I型FcγR,最终导致抑制性FcγRIIB在炎性效应细胞上的表面表达增加(Anthony等人,2011,Anthony等人,2008b,Samuelsson等人,2001)。因此,IgG Fc聚糖组合物,特别是末端唾液酸,与DC-SIGN和FcγRIIB共同负责体内IgG的抗炎活性(Kaneko等人,2006b,Tackenberg等人,2009,Anthony等人,2011,Washburn等人,2015)。

  本公开涉及包含融合肽的方法和组合物,所述融合肽包含与Fc融合的糖基化酶(例如,糖基化酶-Fc融合蛋白)的催化结构域。本文所述的方法和组合物可用于通过体内工程化抗体聚糖来调节IgG效应子功能,以达到各种治疗效果。例如,本公开涉及通过体内工程化抗体聚糖来调节IgG效应子功能作为减轻自身抗体介导的炎症的新手段。公认的是,包括唾液酸化等的糖基化会深刻影响IgG生物学。实际上,人们越来越认识到IgG糖基化对传染病的贡献,并且据报道IgG糖型促使登革热和结核病的临床表现(Lu等人,2016;Wang等人,2017)。在更有可能患有登革热出血热的患者以及具有潜在但非活化的TB传染病的患者中,发现对活化FcγRIIIA具有增强亲和力的去岩藻糖基化IgG。唾液酸化明显降低IgG对FcγR的亲和力,使IgG无法进行trIgGer炎症反应(Scallon等人,2007,Kaneko等人,2006b,Anthony等人,2008a,Li等人,2017)。接种疫苗后,发现流感特异性IgG Fc聚糖的唾液酸化增强,并且以CD23型II FcγR依赖性方式与流感特异性广泛中和抗体相关(Wang等人,2015)。同样,当以足够高的剂量施用时,唾液酸化的IgG Fcs传递抗炎活性(Anthony等人,2008a,Kaneko等人,2006b,Washburn等人,2015)。

  控制IgG剂量依赖性抗炎作用的机制已被广泛讨论(Clynes,2007;Schwab和Nimmerjahn,2013)。然而,IVIG的功能测试一致表明IgG的唾液酸化负责该体内抗炎活性(Washburn等人,2015,Zhang等人,2016,Fiebiger等人,2015,Schwab等人,2012,Schwab等人,2014,Ohmi等人,2016)。从IgG中除去Fc聚糖使IVIG不能抑制自身免疫炎症(Kaneko等人,2006b)。此外,用神经氨酸酶处理以从Fc聚糖中去除末端唾液酸的IVIG,也表现出无抗炎活性(Kaneko等人,2006b)。因此,IgG Fc聚糖组合物,特别是唾液酸,负责体内IgG的抗炎活性。

  唾液酸化的IgG Fcs的产生并非无关紧要,并且可能导致了文献中的混乱。确实,污染LPS、Fcs降解、凝集素富集不当(Stadlmann等人,2009)、无关的体外测定(Bayry等人,2009)以及IVIG中Fab特异性的异质性令人困惑。此外,唾液酸化物质的表征为某些差异提供了解释,因为ST6GAL1既可以附连(attach)也可以去除唾液酸(Washburn等人,2015)。重要的是,许多研究小组已经报告的发现与原始报道相似,唾液酸化的hIgG1实际上在Guillain-Barré综合征(Zhang等人,2016)和胶原蛋白诱发的关节炎(Ohmi等人,2016)的试验模型中具有抗炎性。值得注意的是,通过体内唾液酸化IgG,已经避免了产生抗炎性唾液酸化IgG的许多技术问题。

  在体内成功进行糖工程化的努力已经使用了细菌来源的聚糖修饰酶(Albert等人,2008;Xiao等人,2016)。链球菌(Streptococcal)内切糖苷酶EndoS已被证明减轻IgG介导的炎症(Albert等人,2008)。此外,使霍乱弧菌(Vibrio cholerae)神经氨酸酶靶向肿瘤糖萼(glycocalixes)以改善ADCC(Xiao等人,2016)。这些研究证明了糖工程的力量,但是由于靶向细菌来源的酶的免疫应答,重复施用这些药物变得困难。虽然B4ST6Fc可被免疫应答所靶向,但其它人IgG Fc融合体的耐受性也很好。

  体内唾液酸化的潜在应用远远超出了自身免疫和炎症条件。实际上,这些方法可以应用于当前通过高剂量IVIG治疗的病症。但是IgG唾液酸化的调节也可用于提高疫苗效力,因为有研究报道接种疫苗后产生的初始IgG被唾液酸化,并且这些唾液酸化IgG通过II型FcγR依赖性机制有助于改善亲和力成熟(Wang等人,2015)。此外,体内唾液酸化可以在处理后以规定间隔有效地截断治疗性IgG的活性。而且,这些糖基转移酶和这些融合蛋白的Fc部分可以被进一步工程化,包括增加的FcRn对延长的血清半衰期的亲和力或增加的/减少的受体结合(Schlothauer等人,2016)。

  因此,本公开涉及通过将反式高尔基体中发现的人糖基化酶与IgG Fcs融合的唾液酸化对IgG生物学的功能。有效的唾液酸化需要附连半乳糖和唾液酸的酶(Anthony等人,2008a)。重要的是,这种糖基化酶的组合能够通过选择性地唾液酸化沉积在炎症部位的IgG,在两个不同的体内模型中减轻自身抗体介导的炎症。施用这种酶组合似乎不会影响循环中IgG或循环中其他糖蛋白的唾液酸化。数据显示这可能是因为血小板仅在炎症部位释放半乳糖和唾液酸底物。因此,本公开提供了有效的方法,其通过糖工程化内源性抗体并将其转化为抗炎介质来减轻有害的自身抗体介导的炎症。

  本文所述的方法和组合物(例如,糖基化酶-Fc融合蛋白)还可用于多种其他治疗作用,例如,治疗IgG介导的病症、治疗自身免疫疾病或治疗在器官移植过程中抗体介导的损伤。此外,本公开所述的糖基化酶-Fc融合蛋白具有良好的耐受性,因为全血细胞计数(CBC)和综合代谢组(CMP)分析在施用后一周和两个月均在正常水平内,使得它们适合临床使用。因此,本发明提供治疗IgG介导的病症(例如炎症和自身免疫疾病)和在器官移植过程中抗体介导的损伤的有用方法。

  聚糖

  聚糖在许多蛋白质的功能中具有重要作用。聚糖是形成糖缀合物(例如,糖蛋白、糖肽、肽聚糖、糖脂、糖苷和脂多糖)的碳水化合物部分的糖(即,糖基连接的多个单糖)。可以将它们添加到内质网中的蛋白质中,并随着蛋白质穿过高尔基体而进一步修饰。前体聚糖的结构可以附连至天冬酰胺(N-连接)、丝氨酸或苏氨酸(O-连接)、磷脂(GPI)、色氨酸(C-连接)或通过磷酸二酯键(磷酸糖基化)连接。虽然许多生物学功能归因于聚糖,但是糖基化的两种一般类型的功能是(1)维持或修饰糖蛋白的结构或功能,以及(2)为碳水化合物受体或凝集素提供基于聚糖的识别平台。

  N-连接糖基化

  在内质网腔中,通过酶寡糖基转移酶将14个残基的前体寡糖(葡萄糖3甘露糖9N-乙酰氨基葡萄糖2(Glc3Man9GlcNAc2))转移至在共有序列N-X-S/T中发现的天冬酰胺残基(Schachter等人,in Essentials of Glycobiology,Edn.2010/03/20,eds.V.A等人,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(NY),2009)。通过外切糖苷酶将前体聚糖修饰成高甘露糖结构(Man8-9GlcNAc2),同时将合成的蛋白质组装并运输至高尔基体中。然后,随着蛋白质通过分泌途径的前进,可以进一步加工聚糖。

  核心复合物双天线型聚糖结构(GlcNAc3Man3GlcNAc2)是通过β1,2N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-II转移GlcNAc而产生的。该结构位于IgG抗体的恒定区,可以进一步修饰。核心GlcNAc可通过α1,6-岩藻糖基转移酶进行岩藻糖基化。二等分的N-乙酰葡萄糖胺通过N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-III附连至核心。当蛋白质沿着分泌途径前进时,可分别通过β1,4半乳糖基转移酶和α2,6唾液酸转移酶向臂中添加半乳糖和唾液酸而在反式高尔基体中进一步修饰聚糖。

  O-连接糖基化

  O-连接糖基化是通过将GlcNAc附连至丝氨酸或苏氨酸而引起的(Schachter等人,in Essentials of Glycobiology,Edn.2010/03/20.,eds.V.A等人,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor(NY),2009)。与N-联糖基化相比,对引起这些修饰的途径的了解较少。一项评估表明存在至少8种哺乳动物N-乙酰氨基葡萄糖转移酶,它们根据细胞类型而差异表达。因此,尚不清楚ER或高尔基体是否是该糖基化的起始位点。O-联聚糖不存在已知的共有氨基酸序列,尽管反而暗示了二级结构的偏好性。实际上,大多数O-糖基化存在于β转角中。此外,在-1和+3位上注意到脯氨酸残基的富集,而在这些位上不优选带电荷的残基。

  大多数O-聚糖包含Core 1亚型结构,该结构是通过Core 1β1-3半乳糖基转移酶(Core 1 GalT)将半乳糖以β1-3连接的方式添加至GlcNAc中形成的。Core 2型O-聚糖可以通过将GlcNAc以β1-6连接的方式添加至GalNAc中生成。Core 2 O-聚糖需要Core 1结构作为底物。Core 3 O-聚糖的产生受Core 3 GlcNAcT活性的控制,其使用GlcNAc-丝氨酸/苏氨酸底物。在一些细胞类型中或某些糖蛋白之间,Core 1 GalT和Core 3 GalT酶之间的竞争会调节Core 1和Core 3的生成。

  GPI连接糖基化

  鞘糖脂的从头生物合成始于ER-高尔基体途径的膜内小叶(Schachter等人,inEssentials of Glycobiology,Edn.2010/03/20,eds.V.A等人,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor(NY),2009)。首先合成神经酰胺,然后通过特定的糖基转移酶进行糖基化或半乳糖基化。随后添加β-连接的半乳糖残基。此后,可以以逐步的方式延长分子,从而提供各种各样的不同核心结构。糖鞘脂的外部延伸,包括添加唾液酸、岩藻糖或葡萄糖醛酸残基,与N-和O-聚糖有很多共同点。

  糖基化酶

  糖基化酶负责其中碳水化合物即糖基供体与另一分子(糖基受体,例如蛋白质、脂质和聚糖)的羟基或其他官能团附连的反应。这些糖基化酶的可溶部分(或酶促腔结构域)或催化结构域可与Fc或其他合适的肽融合形成多聚体,并可用于本文上述任何方法中。

  α-2,6唾液酸转移酶(ST6GAL1)

  唾液酸在IgG Fc聚糖上的半乳糖上的附连被酶α-2,6唾液酸转移酶(ST6GAL1;NP_003023.1;SEQ ID NO:1)催化。通过ST6GAL1的IgG的唾液酸化通常发生在反式高尔基体中,其中发现ST6GAL1通过跨膜结构域锚定在高尔基体中(TMD,图1C)。这种反式高尔基体酶可以将末端唾液酸附连至复合的双天线型聚糖上。如图1C所示,反式高尔基体酶ST6GAL1具有胞质结构域(cyto)、跨膜结构域(TMD)和酶促腔结构域(Lumen)(SEQ ID NO:1的氨基酸24-406,SEQ ID NO:1的氨基酸29-406,SEQ ID NO:1的氨基酸34-406,或SEQ ID NO:1的氨基酸41-406)。催化结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸160-390)位于酶促腔结构域内。

  几种不同的启动子调节该转移酶的细胞和组织特异性表达(Kalcheva等人,Mammalian genome:official journal of the International Mammalian GenomeSociety 8,619-620(1997);Wang等人The Journal of biological chemistry 268,4355-4361(1993))。例如,启动子1仅用于肝细胞表达ST6GAL1,而B细胞使用启动子2(Appenheimer,M.M.等人Glycobiology 13,591-600(2003))。肝细胞专门负责裂解并分泌到循环中的可溶性ST6GAL1(sST6GAL1)的产生。重要的是,与野生型对照相比,肝脏特异性启动子1的遗传破坏导致循环唾液酸化IgG的水平明显降低。然而,来自两种小鼠品系的B细胞都能够表达该酶,这意味着该酶在IgG唾液酸化中的肝可溶形式。β-1,4-半乳糖基转移酶1(B4GALT1)

  β-1,4-半乳糖基转移酶1是人B4GALT1基因编码的酶。B4GALT1(NP_001488.2;SEQID NO:2)是II型膜结合糖蛋白,似乎对供体底物UDP-半乳糖具有排他特异性。它将β1,4连接的半乳糖转移至类似的受体糖(例如N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc))上,后者既是单糖又是糖蛋白碳水化合物链的非还原端。催化结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸:185-390)位于B4GALT1的腔结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸79-398,或SEQ ID NO:2的氨基酸106-398)内。

  可溶性糖基化酶

  许多糖基化酶被分泌出来。可溶形式可以例如通过在跨膜(TM)区域附近沿羧基末端方向通过蛋白水解切割而从其膜相关形式衍生而来。

  如图1C所示,反式高尔基体酶B4GALT1和ST6GAL1包括胞质结构域(细胞)、跨膜结构域(TMD)和酶促腔结构域(Lumen)。单个疏水区段用作信号锚序列。该跨膜区段(TMD)跨越包括高尔基体的膜等的分泌途径的脂质双层。糖基转移酶的酶促腔结构域位于高尔基体内腔内。嵌膜转移酶(Membrane-tethered transferases)在其“茎”区域内易于被蛋白水解切割。蛋白水解释放出可从细胞释放的酶的催化活性的、可溶的形式。结果,发现许多糖基化酶以可溶形式存在于循环中和各种体液中。有趣的是,在某些炎症条件下,肝细胞和内皮中这些可溶性酶的产生也可以明显增加。

  ST6GAL1在其内腔结构域的EFQ41-43处具有β-分泌酶(BACE1)切割位点,这可以导致其分泌(图1C,图8A-8D)。可溶性ST6GAL1在循环中具有酶促活性,可有助于IgG Fc聚糖的唾液酸化。

  B4GALT1的切割位点是L79和S106。该酶的亚群在其茎结构域中蛋白水解切割后被分泌,并且该酶的可溶形式具有酶促活性。

  因此,一方面,本公开提供一种融合蛋白或肽,其包含唾液酸转移酶的酶促腔结构域或唾液酸转移酶的催化结构域,或由其组成。在一些实施方案中,唾液酸转移酶的酶促腔结构域不具有BACE1切割位点。在一些实施方案中,唾液酸转移酶的酶促腔结构域包含SEQID NO:1的氨基酸24-406、SEQ ID NO:1的氨基酸29-406、SEQ ID NO:1的氨基酸34-406、或SEQ ID NO:1的氨基酸41-406,或由其组成。唾液酸转移酶的催化结构域催化糖蛋白的唾液酸化。在一些实施方案中,唾液酸转移酶的催化结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸160-390,或由其组成。

  本公开还提供融合蛋白或肽,其包含半乳糖基转移酶的酶促腔结构域或半乳糖基转移酶的催化结构域,或由其组成。在一些实施方案中,半乳糖基转移酶的酶促腔结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸79-398,或SEQ ID NO:2的氨基酸106-398,或由其组成。半乳糖基转移酶的催化结构域催化糖蛋白的半乳糖基化。在一些实施方案中,半乳糖基转移酶的催化结构域包含或由SEQ ID NO:2的氨基酸185-390,或由其组成。

  核酸序列和氨基酸序列

  本公开提供各种核酸序列和氨基酸序列。

  在一些实施方案中,核酸序列与本文公开的任何核酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性。在一些实施方案中,核酸序列与本公开描述的任何序列相同。

  在一些实施方案中,氨基酸序列与本文公开的任何氨基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性。在一些实施方案中,氨基酸序列与本公开描述的任何序列相同。

  为了确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的同一性百分比,出于最佳比较目的,对序列进行比对(例如,为了最佳比对可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一条或两条中引入空位,出于比较目的可以忽略最佳比对和非同源序列)。出于比较目的而比对的参考序列的长度是该参考序列的长度的至少80%,并且在一些实施方案中是至少90%、95%或100%。然后比较在相应的氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时,则分子在该位置是相同的(如本文所用,氨基酸或核酸的“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。考虑到空位数和每个空位的长度,两条序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数目的函数,这需要引入以实现两条序列的最佳比对。为了本公开的目的,可以使用具有空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵来完成序列的比较和两条序列之间的同一性百分比的确定。

  FcB4,FcST6和FcChm

  高尔基体酶,包括ST6GAL1和B4GALT1,是高尔基体II型膜蛋白。酶促转移酶活性位于蛋白质的C末端(图1C)。

  糖基化酶、酶促腔结构域、可溶性结构域或其催化结构域可以与IgG(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或其一部分融合。在一些实施方案中,糖基化酶、酶促腔结构域、可溶性结构域或其催化结构域可用于IgG(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的Fc部分。Fc融合体具有许多优点:可溶性蛋白将具有延长的血清半衰期(例如,超过5天、10天、14天或20天),并且还将形成二聚体。在一些实施方案中,取决于糖基化靶,这些融合多肽可以形成同源二聚体或异源二聚体。

  IgG Fc可以是本领域已知的任何IgG的Fc区。例如,IgG Fc可以是人IgG1-Fc(例如,包含SEQ ID NO:3的氨基酸26-256)、人IgG2-Fc(例如,包含SEQ ID NO:4的氨基酸52-266)、人IgG3-Fc(例如包含SEQ ID NO:5的氨基酸41-318)、人IgG4-Fc(例如包含SEQ IDNO:6的氨基酸53-268)、小鼠IgG1-Fc(例如,包含SEQ ID NO:7的氨基酸26-252)、小鼠IgG2a-Fc(例如,包含SEQ ID NO:8的氨基酸21-253)、小鼠IgG2b-Fc(例如,包含氨基酸SEQID NO:9的氨基酸21-259)、小鼠IgG3-Fc(例如,包含SEQ ID NO:10的氨基酸21-253)、犬IgG-A Fc(例如包含SEQ ID NO:15的氨基酸21-244)、或猫IgG1 Fc(例如,包含SEQ ID NO:17的氨基酸21-243)。优选地,选择免疫球蛋白的种类以对应于将向其施用融合蛋白的受试者的种类

  在一些实施方案中,肽包含IgG抗体重链CH2区、IgG抗体重链CH3区和酶促腔结构域或唾液酸转移酶的催化结构域。在一些实施方案中,肽具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。本公开还提供包含IgG抗体重链CH2区、IgG抗体重链CH3区、酶促腔结构域或半乳糖基转移酶的催化结构域的多肽。在一些实施方案中,肽具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,这些多肽可以形成同源二聚体。同源二聚体可具有两个唾液酸转移酶的酶促腔结构域(或催化结构域)(例如,FcST6或ST6Fc)。在一些其它情况下,同源二聚体可以具有半乳糖基转移酶的两个酶促腔结构域(或催化结构域)(例如,FcB4或B4Fc)。在一些实施方案中,这些多肽可以形成异源二聚体(FcChm或FcB4/FcST6),其具有唾液酸转移酶的一个酶促腔结构域(或催化结构域)和一个半乳糖基转移酶的酶促腔结构域(或催化结构域)。

  图22显示糖基化酶-Fc融合蛋白的一些实例,包括人IgG Fc-B4GALT1融合蛋白(SEQ ID NO:11)、人IgG1 Fc-ST6GAL1融合蛋白(SEQ ID NO:12)、小鼠IgG1 Fc-B4GALT1融合蛋白(SEQ ID NO:13)、小鼠IgG1 Fc-ST6GAL1融合蛋白(SEQ ID NO:14)、犬IgG-A(IgG1)Fc-ST6GAL1融合蛋白(SEQ ID NO:15)、犬IgG-A(IgG1)Fc-B4GALT1融合蛋白(SEQ ID NO:16)、猫IgG1 Fc-ST6GAL1融合蛋白(SEQ ID NO:17)、猫IgG1 Fc-B4GALT1融合蛋白(SEQ IDNO:18)。

  在一些实施方案中,这些肽可以另外具有信号序列,例如IL2-信号序列(SEQ IDNO:3的氨基酸1-20)或κ信号序列(SEQ ID NO:4的氨基酸1-39)。这些信号序列通常存在于肽的N端。

  在一些实施方案中,Fc区可具有“旋钮入孔”(KIH)突变。KIH突变可用于促进异源二聚体的形成。在一些实施方案中,一个Fc具有一个以上的选自由Y349C、T366S、L368A和Y407V(全部以EU编号)组成的组的突变。另一个Fc可以具有选自由S354C和T366W(全部以EU编号)组成的组的突变的一个或两个突变。在一些实施方案中,Fc-B4GALT1融合蛋白具有在SEQ ID NO:42所示的序列。在一些实施方案中,Fc-ST6GAL1融合蛋白具有在SEQ ID NO:43所示的序列。

  在一些实施方案中,糖基化酶的酶促腔结构域、可溶结构域或催化结构域可与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的部分或全部融合。在一些实施方案中,可以将糖基化酶的酶促腔结构域、可溶结构域或催化结构域融合至IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc部分。在一些实施方案中,Fc部分是IgG3的Fc。

  可以将具有所需特异性的完整抗体与糖基化酶融合,从而实现酶的特异性靶向。此外,可以使用狗/猫/马/牛等同/同源抗体或糖基化酶产生类似的蛋白融合体,从而能够治疗非人类动物(例如,宠物和家畜)。

  单体,二聚体,三聚体和四聚体

  示例性单体在图15A中示出。如图15A所示,单体可以是糖基化酶(例如,唾液酸转移酶或半乳糖基转移酶)的酶促腔结构域、可溶结构域或催化结构域。

  可以通过本领域已知的任何方法产生多聚体。在一些实施方案中,多聚体可以具有一个、两个、三个、四个或超过四个糖基化酶的酶促腔结构域、可溶结构域或催化结构域。在一些实施方案中,多聚体可以具有一个、两个,三个、四个或超过四个唾液酸转移酶的酶促腔结构域(或催化结构域)。在一些实施方案中,多聚体可以具有一个、两个、三个、四个或超过四个半乳糖基转移酶的酶促腔结构域(或催化结构域)。

  在一些实施方案中,多聚体可以是二聚体(例如,FcB4、FcST6和FcChm)。

  多聚体也可以是三聚体或四聚体。三聚体和四聚体可通过将腔酶部分或可溶部分分别融合至例如胶原样肽支架(Gly-Pro-Pro)x10或生物素化位点而产生。如图15C-15D所示,可以将糖基化酶的可溶性部分通过融合至胶原三聚结构域来工程化为三聚体(图15C),或通过包含生物素-连接酶识别位点、用生物素连接酶对融合体进行生物素化、并随后与链霉亲和素一起孵育来工程化为四聚体(图15D)。在图15C-15D中,将多聚体绘制为异源多聚体,但也可以根据需要制成同源多聚体。产生多价蛋白结合剂的详细方法在例如Fan,Chia-Yu,等人“Production of multivalent protein binders using a self-trimerizingcollagen-like peptide scaffold.”The FASEB Journal 22.11(2008):3795-3804中描述,通过引用将其整体并入本文。

  位点特异性糖工程化

  尽管在全身发现了可溶性高尔基体酶,但在某些应用和环境中,更需要将这些酶选择性靶向确定结构位置的能力。在一些合适的情况下,可以将酶促腔结构域或催化结构域连接至免疫球蛋白(例如抗体或单链可变片段)以产生全长抗体-酶缀合物。

  单个天然IgG抗体包含轻链的两个相同拷贝和重链的两个相同拷贝。重链各自包含一个可变结构域(或可变区,VH)和三个恒定结构域(或恒定区,CH1、CH2、CH3),它们在其恒定结构域内通过二硫键相互结合形成抗体的“茎”。轻链各自包含一个可变结构域(或可变区,VL)和一个恒定结构域(或恒定区,CL),轻链各自通过二硫键结合至一条重链。每个轻链的可变区与它所结合的重链的可变区对齐。片段抗原结合(Fab)片段是抗体上的与抗原结合的区域。它由每条重链和每条轻链的一个恒定区和一个可变区组成。片段可结晶区(Fc区)是抗体的尾巴区域,与称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统的某些蛋白相互作用。该特性使抗体激活免疫系统。

  在IgG中,Fc区由两个相同的蛋白片段组成,这些片段来自抗体两条重链的第二和第三恒定区。

  与Fab的Fc或恒定C端的融合将取决于特定的应用(图16A-16B)。类似地,全长免疫球蛋白中使用的可变区序列将通过定位与免疫球蛋白附连的糖基化酶的能力进行选择。可变区序列的标准将包括识别位于感兴趣的糖基化位点附近的基序,从而使融合酶非常接近以修饰靶聚糖。而且,将避免可变区序列直接结合至聚糖或阻断聚糖的可及性。最后,可以对Fc部分进行工程化以引起期望的抗体依赖性效应子功能(图16A)。例如,对于靶向感染因子的糖基化酶,表现出增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的Fcs可以是有效的。相反,用于其他应用(包括异种移植)的糖基化酶融合体将包含无ADCC功能的Fcs。

  如图16A-16B所示,可以使用感兴趣的免疫球蛋白可变链和恒定链产生酶融合体。取决于应用,可以将酶融合至Fc或恒定Fab的C端。选择Fab的原因是其特异性,使糖基化酶足够接近所需聚糖的能力。Fc可以被工程化以引起或不引起期望的免疫球蛋白效应子功能。

  在一些实施方案中,本公开提供一种异源多聚体。异源多聚体包括抗体或其抗体片段、唾液酸转移酶的酶促腔结构域(或催化结构域)、和/或半乳糖基转移酶的酶促腔结构域(或催化结构域)。在一些实施方案中,抗体或其抗体片段具有两条重链和两条轻链。唾液酸转移酶的酶促腔内结构域(或催化结构域)可以与重链或轻链的C-末端融合。类似地,半乳糖基转移酶的酶促腔结构域(或催化结构域)也可以融合至重链或轻链的C-末端。

  治疗方法

  本文所述的方法包括用于治疗IgG介导的病症(例如炎症、自身免疫疾病)和在器官移植中抗体介导的损伤的方法。在一些实施方案中,病症是自身免疫疾病,例如特发性血小板减少性紫癜(ITP)、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、慢性炎性脱髓鞘性神经病变、干燥综合征、肉芽肿伴多发性血管炎(韦格纳氏症(Wegner's))等。这些自身免疫疾病描述于例如Dal,Mehmet Sinan,等人"Assessment of the underlying causes ofthe immune thrombocytopenia:Ten years experience."JPMA.The Journal of thePakistan Medical Association 67.7(2017):1004;Prineas,John W.,和John DEParratt."Multiple sclerosis:Serum anti-CNS autoantibodies."Multiple SclerosisJournal(2017):1352458517706037;Bai,Yunqiang,等人."Self-dsDNA in thepathogenesis of systemic lupus erythematosus."Clinical&ExperimentalImmunology(2017);Hughes,Graham RV."Frequency of anti-DNA antibodies in SLE,RAand other diseases:experience with the ammonium sulphate precipitationtechnique."Scandinavian Journal of Rheumatology 4.sup11(1975):42-51;Fu,S.M.,等人"Autoantibodies and glomerulonephritis in systemic lupus erythematosus."Lupus 12.3(2003):175-180;Tan,Eng M."Autoantibodies and autoimmunity:A three-decade perspective.A tribute to Henry G.Kunkel."Annals of the New YorkAcademy of Sciences 815.1(1997):1-14;Querol等人,“Autoantibodies in chronicinflammatory neuropathies:diagnostic and therapeutic implications.”Nat RevNeurol.2017Sep;13(9):533-547;每一个均通过引用其整体并入本文。

  通常,该方法包括对有此治疗需要或已确定有此治疗需要的受试者施用治疗有效量的试剂(例如融合蛋白或肽),所述试剂包含糖基化酶的酶促腔结构域或催化结构域、多聚体(例如,FcB4、FcST6、FcChm)或如本文所述的组合物,或由其组成。

  如本文所用,“治疗”是指减轻病症或疾病的至少一种症状。通常,治疗导致症状的改善。在一些实施方案中,治疗可导致炎症降低。在一些实施方案中,减轻或降低一种以上的临床症状,缩短持续时间,降低症状发生的频率,或防止临床症状显现(即,降低症状风险)。

  如本文所用,术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用,并且描述根据本发明的方法提供治疗的动物、人类或非人类,例如哺乳动物。本发明考虑了兽医和非兽医应用。人类患者可以是成年人或未成年人(例如18岁以下的人)。除人类外,患者包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、雪貂、猫、狗和灵长类动物。包括例如非人灵长类动物(例如猴子、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔子)、兔形目、猪(例如猪、微型猪)、马、犬、猫、牛和其他家养、农场和动物园的动物。因此,本文所述的糖基化酶、抗体或其部分(例如,抗体的Fc区或糖基化酶的催化结构域)也可以源自这些非人类动物。本公开还提供源自这些非人类动物中一些的糖基化酶、以及抗体或其部分的氨基酸序列。例如,图23列出狗IgG重链A、狗IgG重链B、狗IgG重链C、狗IgG重链D、狗ST6GAL1和狗B4GALT1的氨基酸序列。图24列出猫IgG1a重链、猫IgG1b重链、猫ST6GAL1和猫B4GALT1的氨基酸序列。图25列出牛IgG1重链恒定区、牛IgG2重链恒定区、牛IgG3重链恒定区、牛ST6GAL1和牛B4GALT1的氨基酸序列。图26列出马IgG1重链恒定区、马IgG2重链恒定区、马IgG3重链恒定区、马IgG4重链恒定区、马IgG5重链恒定区、马IgG6重链恒定区、马ST6GAL1和马B4GALT1的氨基酸序列。

  在一些实施方案中,受试者是年龄超过25岁、30岁、40岁、50岁、60岁、70岁或80岁的人(例如,男性或女性)。

  如本文所用,术语“治疗有效”和“有效量”可互换使用,应用于剂量或量,是指组合物、化合物或药物制剂在施用于有此需要的受试者时足以产生所需活性的量。在本公开的上下文中,术语“治疗有效”是指足够量的组合物、化合物或药物制剂可以降低或消除如本文所述的病症的至少一种症状或一种病症。

  IgG介导的病症

  如本文所用,术语“IgG介导的病症”是指由IgG水平升高或活性升高引起或以其为表征的任何病症。因此,抑制IgG的活性通常是针对IgG介导的病症的治疗。IgG介导的病症可以包括但不限于炎症和各种自身免疫疾病。

  实际上,IgG在临床上广泛用于抑制炎症。静脉内免疫球蛋白(IVIG)是一种源自数以万计的健康供体的多克隆单体IgG的治疗性制剂。它以400-600mg/kg用于免疫功能低下的患者,作为抗体替代疗法。1981年,IVIG以高剂量(1-2g/kg)施用于患有其中自身抗体靶向血小板的自身免疫疾病(免疫介导的血小板减少症,ITP)的小儿患者。该治疗使血小板计数恢复正常,使患者暂时缓解(Imbach,P.等人Lancet 1,1228-1231(1981))。从那时起,IVIG通常用作抗炎疗法,用于治疗多种疾病,包括自身免疫疾病ITP、多发性硬化症、系统性红斑狼疮和实体器官移植(参见,例如,Fillit,H.Lancet Neurol 3,704(2004);Fillit,H.,Hess,G.,Hill,J.,Bonnet,P.&Toso,C.Neurology 73,180-185(2009);Hack,C.E.&Scheltens,P.J Neurol Neurosurg Psychiatry 75,1374-1375(2004);Ishii,N.,Hashimoto,T.,Zillikens,D.&Ludwig,R.J.Clin Rev Allergy Immunol 38,186-195(2010);Nimmerjahn,F.&Ravetch,J.V.Annu Rev Immunol 26,513-533(2008))。

  已经广泛研究了控制IgG剂量依赖性促炎和抗炎作用的机制(Clynes,R.CurrOpin Immunol 19,646-651(2007);Schwab,I.&Nimmerjahn,F.Nat Rev Immunol 13,176-189(2013))。从IgG中除去Fc聚糖片段已经阐明了驱动IgG的抗炎活性的机制(Kaneko,Y.,Nimmerjahn,F.&Ravetch,J.V.Science 313,670-673(2006))。在类风湿关节炎的模型中,去糖基化的IVIG无法抑制炎症。此外,用神经氨酸酶处理以从Fc聚糖上除去末端唾液酸的IVIG,也表现出无抗炎活性。因此,IgG Fc聚糖聚糖组合物,特别是末端唾液酸,负责IgG的抗炎活性。此外,唾液酸化的IgG Fc以比IVIG低30倍的剂量表现出抗炎活性。

  因此,本公开中描述的方法可以用于治疗各种IgG介导的疾症(例如,炎症、自身免疫性疾病)。

  在另一方面,本公开中描述的方法可以用于治疗可以通过IVIG治疗的任何疾病或病症。这些疾病或病症包括但不限于炎症,自身免疫性疾病,特发性血小板减少性紫癜(ITP),多发性硬化症,系统性红斑狼疮和阿尔茨海默氏病。

  在一些实施方案中,该方法包括以下步骤:鉴定患有IgG介导的疾病的受试者,并向该受试者施用如本公开中所述的任何多肽、多聚体或组合物。

  炎症

  炎症是人体组织对有害刺激物复杂的生物应答的一部分。炎症的功能是消除造成细胞损伤的最初原因,清除原始损伤和炎症过程中受损的坏死细胞和组织,并起始组织修复。然而,在某些情况下,炎症可对身体造成伤害。如上所述,炎症通常由抗体介导。因此,本文所述的方法可用于治疗、抑制、降低或控制炎症。

  自身免疫疾病

  自身免疫疾病是由对正常身体部位的异常免疫应答引起的病症。由于自身免疫疾病通常是由IgG的异常功能介导的,因此本公开描述的方法可用于治疗各种自身免疫疾病。自身免疫疾病可影响主要器官(例如心脏、肾脏、肝脏、肺、皮肤和生殖器官)、腺体(例如肾上腺、胰腺、甲状腺和唾液腺)、消化系统、血液、结缔组织、肌肉、神经系统、眼、耳、血管系统等。一些常见的自身免疫疾病包括乳糜泻、1型糖尿病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、牛皮癣、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。

  可以通过本公开描述的方法治疗的自身免疫疾病的列表包括但不限于艾迪生氏病(Addison’s disease)、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性病、强直性脊柱炎、抗gbm/抗tbm肾炎、抗磷脂综合征、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、轴突和神经元神经病变、贝塞特氏病(Behcet’s disease)、大疱性类天疱疮、卡斯曼病、乳糜泻、恰加斯病(chagas disease)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、慢性复发性多灶性骨髓炎、血管炎(Churg-Strauss)、瘢痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮、柯根氏综合症(Cogan’ssyndrome)、冷凝集素病、先天性心脏病、柯萨奇心肌炎(coxsackie myocarditis)、CREST综合征、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、疱疹样皮炎、皮肌炎、迪维克氏病(Crohn’sdisease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、系统性红斑狼疮、德勒斯勒综合症(Dressler’ssyndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、原发性混合性冷球蛋白血症、伊万斯综合征(evans syndrome)、纤维肌痛、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征(Goodpasture’ssyndrome)、肉芽肿伴多发性血管炎、格雷夫斯病(Graves disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、溶血性贫血、过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮、低丙种球蛋白血症、IgA肾病、与IgG4相关的硬化性疾病、包涵体肌炎、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(1型糖尿病)、幼年型肌炎、川崎病(kawasaki disease)、兰伯特-伊顿综合征(lambert-eaton syndrome)、白细胞碎裂性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木样结膜炎、线性IgA疾病、狼疮,慢性莱姆病、美尼尔氏病(Meniere’s disease)、微观多发性血管炎、混合结缔组织病、穆伦溃疡(Mooren’s ulcer)、穆查-哈伯曼病(Mucha-Habermann disease)、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性嗜睡病、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病、PANDAS(链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神病症)、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、帕里伯格综合症(Parry Rombergsyndrome)、睫状体扁平部炎(周围葡萄膜炎)、帕森纳格-特纳综合征(Parsonnage-Turnersyndrome)、天疱疮、周围神经病变、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征(多神经病、器官肿大、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、皮肤变化)、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、黄体酮皮炎、银屑病、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍、坏疽性脓皮病、雷诺现象(Raynaud’s phenomenon)、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、类风湿性关节炎、赖特氏综合征、复发性多软骨炎、不安腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征(Schmidt syndrome)、巩膜炎、硬皮病、舍格伦综合征(Sjogren’ssyndrome)、精子和睾丸自身免疫性、僵硬人综合征、亚急性细菌性心内膜炎、苏萨克综合征(Susac’s syndrome)、交感性眼炎、大动脉炎(Takayasu’s arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(例如,特发性血小板减少性紫癜)、托洛萨-亨特综合征(Tolosa-Hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、韦格纳肉芽肿病(现称肉芽肿伴多发性血管炎)。

  在某些情况下,自身免疫疾病是一种获得性自身免疫病症。例如,感染HIV可以引起免疫系统破坏,从而导致损坏多个器官系统和组织。因此,一方面,本公开描述的方法可以用于治疗获得性自身免疫病症。

  实体器官移植

  当移植组织被受体的免疫系统排斥时,就会发生移植排斥,这会破坏移植的组织。移植排斥通常涉及抗体介导的损伤。抗体在移植中的作用描述于例如Hourmant等人“Frequency and clinical implications of development of donor-specific andnon–donor-specific HLA antibodies after kidney transplantation.”Journal ofthe American Society of Nephrology 16.9(2005):2804-2812,通过引用将其整体并入本文。因此,一方面,本公开描述的方法可用于治疗或控制移植排斥(例如,降低或最小化抗体介导的损伤),或治疗移植物抗宿主疾病。在一些实施方案中,移植的器官是心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、肠、皮肤或胸腺。

  疫苗接种改善

  疫苗可以刺激免疫系统产生对病原体抗原具有特异性的抗体。研究表明,对疫苗抗原特异的唾液酸化抗体通过前馈机制导致产生高特异性和高亲和力的抗体。这种机制描述于例如,Wang,Taia T.,等人“Anti-HA glycoforms drive B cell affinity selectionand determine influenza vaccine efficacy.”Cell 162.1(2015):160-169。因此,本文所述的方法还可以与标准疫苗接种一起使用,以产生对疫苗抗原特异的唾液酸化抗体,最终产生对病原体抗原具有高特异性和高亲和力的抗体。

  在一些实施方案中,该方法包括在向受试者施用疫苗之前、之中或之后,向受试者施用治疗有效量的本文所述的多肽、多聚体(例如,FcB4、FcST6和/或FcChm)或组合物。在一些实施方案中,将包含疫苗和本文所述的多肽、多聚体(例如FcB4、FcST6和/或FcChm)或组合物的组合物施用于受试者。

  表达系统

  为了使用本文所述的融合蛋白或肽,可以从编码它们的核酸表达它们。这可以以多种方式进行。例如,可以将编码融合蛋白或肽的核酸克隆到中间载体中,以转化至原核或真核细胞中以进行复制和/或表达。中间载体通常是原核生物载体,例如质粒、或穿梭载体、或昆虫载体,用于存储或操作编码用于生产的融合蛋白或肽的核酸。也可以将编码融合蛋白或肽的核酸克隆到表达载体中,以施用于植物细胞、动物细胞、优选哺乳动物细胞或人细胞、真菌细胞、细菌细胞或原生动物细胞。

  为了获得表达,通常将编码融合蛋白或肽的序列亚克隆到含有启动子以指导转录的表达载体中。合适的细菌和真核启动子是本领域众所周知的,并描述于例如Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(3d ed.2001);Kriegler,Gene Transferand Expression:A Laboratory Manual(1990);和Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等人,eds.,2010).Bacterial expression systems for expressingthe engineered protein are available in,e.g.,E.coli,Bacillus sp.,andSalmonella(Palva等人,1983,Gene 22:229-235)。用于这种表达系统的试剂盒是商购可得的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域众所周知的,并且也是商购可得的。在一些实施方案中,融合蛋白和肽通过用包含编码本公开所述的融合蛋白和肽的多核苷酸的载体转染HEK-293T细胞、Expi293细胞或CHO细胞来表达。

  用于指导核酸表达的启动子取决于特定的应用。例如,强组成型启动子通常用于融合蛋白的表达和纯化。相反,当编码融合蛋白或肽的载体在体内施用时,根据特定需要,可以使用组成型或诱导型启动子。在一些实施方案中,用于施用编码融合蛋白或肽的载体的启动子可以是弱启动子,例如HSV TK或具有相似活性的启动子。启动子还可以包括对反式激活有响应的元件,例如缺氧响应元件、Gal4响应元件、lac阻遏物响应元件、以及小分子控制系统,例如四环素调节系统和RU-486系统(参见,例如,Gossen&Bujard,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547;Oligino等人,1998,Gene Ther.,5:491-496;Wang等人,1997,Gene Ther.,4:432-441;Neering等人,1996,Blood,88:1147-55;和Rendahl等人,1998,Nat.Biotechnol.,16:757-761)。

  除启动子外,表达载体通常还包含转录单元或表达盒,其含有在原核细胞或真核细胞的宿主细胞中表达核酸所需的所有其他元件。因此,典型的表达盒包含可操作地连接至例如编码融合蛋白或肽的核酸序列的启动子,以及例如转录物的有效聚腺苷酸化、转录终止、核糖体结合位点、或翻译终止所需的任何信号。表达盒的其他元件可包括例如增强子和异源剪接的内含子信号。

  根据预期用途例如在植物、动物、细菌、真菌、原生动物等中的表达,选择用于将遗传信息转运至细胞中的特定表达载体。标准细菌表达载体包括质粒,例如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D、和商购可得的标签融合表达系统,例如GST和LacZ。

  含有来自真核病毒的调节元件的表达载体经常用于真核表达载体,例如SV40载体、乳头瘤病毒载体和源自爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)的载体。其他示例性的真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE、以及允许在SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子、或其他在真核细胞中有效表达的启动子的指导下表达蛋白的任何其他载体。

  用于表达融合蛋白或肽的载体可包括RNA Pol III启动子以驱动指导RNA的表达,例如H1、U6或7SK启动子。这些人启动子允许在质粒转染之后在哺乳动物中表达融合蛋白或肽。

  一些表达系统具有用于选择稳定转染的细胞系的标志物,例如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。高产量表达系统也是合适的,例如在昆虫细胞中使用杆状病毒载体,在多角体蛋白启动子或其他强杆状病毒启动子的指导下编码序列。

  表达载体中通常包含的元件还包括在大肠杆菌中起作用的复制子,编码抗生素抗性以允许选择带有重组质粒的细菌的基因,和允许插入重组序列的在质粒非必需区中的独特限制位点。

  标准转染方法用于产生表达大量蛋白的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系,然后使用标准技术对其进行纯化(参见,例如,Colley等人,1989,J.Biol.Chem.,264:17619-22;Guide to Protein Purification,in Methods in Enzymology,vol.182(Deutscher,ed.,1990))。根据标准技术进行真核细胞和原核细胞的转化(参见,例如Morrison,1977,J.Bacteriol.132:349-351;Clark-Curtiss&Curtiss,Methods in Enzymology 101:347-362(Wu等人,eds,1983)。

  可以使用任何将外来核苷酸序列引入宿主细胞的已知方法。这些方法包括使用磷酸钙转染、聚凝胺(polybrene)、原生质体融合、电穿孔、核转染、脂质体、显微注射、裸DNA、质粒载体、病毒载体,游离型和整合型、以及将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外来遗传物质引入宿主细胞的任何其他众所周知的方法(参见,例如,Sambrook等人,同上)。仅需要所使用的特定基因工程方法能够将至少一种基因成功地引入能够表达融合蛋白或肽的宿主细胞中。

  本公开还包括载体和包含该载体的细胞,以及包含本文所述的蛋白和核酸的试剂盒,例如,用于本文所述的各种方法中。

  剂量

  “有效量”是足以产生有益或期望结果的量。例如,治疗量是达到期望的治疗效果的量。该量可以与预防有效量相同或不同,预防有效量是预防疾病或疾病症状发作所需的量。有效量可以一种以上的施用、应用或剂量施用。多肽、多聚体(例如FcB4、FcST6、FcChm)或组合物的治疗有效量(即有效剂量)取决于所选择的多肽、多聚体或组合物。可以从每天一次以上至每周一次以上,包括隔天一次中的一个施用该组合物。技术人员将理解,某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时间,包括但不限于疾病或病症的严重程度、在先治疗、受试者的总体健康状况和/或年龄、以及存在的其他疾病。此外,用治疗有效量的本文所述的多肽、多聚体或组合物治疗受试者可以包括单一治疗或一系列治疗。

  多肽、多聚体或组合物的剂量、毒性和治疗功效可通过细胞培养或实验动物中的标准制药方法来确定,例如用于确定LD50(人群的50%致死剂量)和ED50(在50%的人群中具有治疗效果的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数,可以表示为比例LD50/ED50。优选具有高治疗指数的多肽、多聚体或组合物。尽管可以使用具有毒副作用的多肽、多聚体或组合物,但应注意设计一种将多肽、多聚体或组合物靶向受影响组织部位的递送系统,最大限度地减少对未感染细胞的潜在损害,从而减少副作用。

  从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于制定用于人类的剂量范围。多肽、多聚体或组合物的剂量优选在循环浓度的范围内,该循环浓度包括几乎无毒性或无毒性的ED50。剂量可以在此范围内变化,这取决于所采用的剂型和所采用的施用途径。对于如本公开所述的方法中使用的任何多肽、多聚体或组合物,治疗有效剂量可以首先从细胞培养测定中估计。可以在动物模型中制定剂量,以达到循环血浆浓度范围,包括在细胞培养中确定的IC50(即达到症状最大抑制一半的试验多肽、多聚体或组合物的浓度)。此类信息可用于更准确地确定对人有用的剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱测定。

  药物组合物和施用方法

  本文所述的方法包括包含如本公开所述的任何多肽或多聚体(例如,FcB4、FcST6和/或FcChm)作为活性成分的药物组合物以及组合物本身的用途。在一些实施方案中,该组合物包含FcB4、FcST6和FcChm。

  药物组合物通常包含药学上可接受的载体。如本文所用,语言“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。

  通常将药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外,例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、透皮(局部)、经粘膜和直肠施用。

  配制合适的药物组合物的方法是本领域已知的,参见,例如,Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,21st ed.,2005;和Drugs and the PharmaceuticalSciences:a Series of Textbooks and Monographs(Dekker,NY)系列丛书。例如,用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下成分:无菌稀释剂,例如注射用水、盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂;抗菌剂,例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂,如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂,如乙二胺四乙酸;缓冲液,例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐,以及用于调节张力的试剂,例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱,例如盐酸或氢氧化钠调节pH。肠胃外制剂可以装入玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。

  适用于注射用途的药物组合物可包括无菌水溶液(水溶性时)或分散液,以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉剂。对于静脉内施用,合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下,该组合物必须是无菌的,并且应该以易于注射的程度流动。它在生产和储存条件下应该是稳定的,并且必须保存以防微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质,其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用诸如卵磷脂等的包衣,在分散液的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂,例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来达到防止微生物的作用。在许多情况下,优选在组合物中包括等渗剂,例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇,氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂,例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

  可以通过将所需量的如本公开所述的多肽、多聚体或组合物引入合适的溶剂中并根据需要组合上述列举的一种成分或成分,然后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常,通过将多肽、多聚体或组合物掺入无菌媒介物中来制备分散液,所述无菌媒介物包含基本的分散介质和所需的其他上述列举的成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥,这由其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。

  口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。为了口服治疗施用,可将活性剂与赋形剂结合并以片剂、锭剂或例如明胶胶囊等的胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用流体载体制备以用作漱口水。药物相容性结合剂,和和/或辅助材料可以作为组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可包含以下任何成分或类似性质的试剂:粘合剂,例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶;赋形剂,例如淀粉或乳糖,崩解剂,例如藻酸、Primogel或玉米淀粉;润滑剂,例如硬脂酸镁或Sterotes;助流剂,例如胶体二氧化硅;甜味剂,例如蔗糖或糖精;或调味剂,例如薄荷、水杨酸甲酯或橙调味剂。

  为了通过吸入施用,组合物可以以气溶胶喷雾的形式从压力容器或分配器中输送,该压力容器或分配器包含合适的推进剂,例如气体,例如二氧化碳,或喷雾器。这样的方法包括在美国专利号6,468,798中描述的那些方法。

  在一些实施方案中,将多肽或多聚体与将保护多肽或多聚体免于从体内快速消除的载体,例如控释制剂,包括植入剂和微囊递送系统一起制备。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物,例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。这样的制剂可以使用标准技术来制备,或可以从例如Alza Corporation和NovaPharmaceuticals,Inc.商购获得。脂质体悬浮液(包括靶向具有针对细胞抗原的单克隆抗体的选定细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备,例如,如美国专利号4,522,811中所述。

  药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。

  实施例

  在以下实施例中进一步描述本发明,这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

  实施例1:IgG抗体的体内唾液酸化减轻自身免疫疾病

  进行实验以确定通过体内内源性IgG的糖工程化调节IgG介导的炎症的治疗效果。

  材料和方法:

  糖基化酶-Fc融合体的构建和产生。将前面加上IL2分泌信号序列的人IgG Fc与ST6GAL1(β-半乳糖苷α-2,6唾液酸转移酶1)或B4GALT1(β-1,4-半乳糖基转移酶1)的可溶性结构域通过重叠PCR连接,使得人IgG Fc融合至酶的5'末端。表2提供本研究中使用的引物列表。表中显示HindIII(AAGCTT)、XhoI(CTCGAG)的限制性酶切位点。然后根据制造商的说明(Life Technologies)将Fc-酶融合基因TOPO克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.4中。根据制造商的说明,使用Expi293表达系统试剂盒(Life Technologies)将质粒瞬时转染到Expi293细胞中,从而产生重组Fc酶。通过以1:1的比例共转染pcDNA3.4/ST6Fc和pcDNA3.4/B4Fc产生B4ST6Fc酶。使用蛋白G琼脂糖珠(Thermo Scientific)从培养上清液中纯化酶,并在PBS中透析以进行体内注射。

  体内动物研究。7-8周龄的C57BL/6和NOD小鼠从杰克逊实验室购买,并根据美国国立卫生研究院(NIH)的指导,在无特定病原体的条件下在Massachusetts GeneralHospital(MGH)的动物设施中饲养。C57BL/6背景(K/B)的KRN TCR转基因小鼠是来自D.Mathis和C.Benoist(Harvard Medical School,Boston,MA)的惠赠,并与NOD小鼠进行繁殖以产生K/BxN小鼠(Korganow等人,1999)。如先前所述(Kaneko等人,2006)制备K/BxN血清。通过静脉内注射K/BxN血清(每只小鼠200μL合并的K/BxN血清)诱发炎性关节炎。为了进行治疗性干预实验,在注射K/BxN血清后第0天或第3天注射IVIG(1g/kg)、B4Fc(1.25mg/kg或2.5mg/kg)、ST6Fc(1.25mg/kg或2.5mg/kg)、B4ST6Fc(2.5mg/kg)或生理盐水。如(Kaneko等人,2006)所述,通过临床检查对关节炎评分,并添加所有四只爪的指数(0=不受影响,1=一个关节肿胀,2=超过一个关节肿胀,3=整个爪严重肿胀)。在进行K/BxN血清注射之前,注射PBS、IVIG(1g/kg)或B4ST6Fc(50μg)1小时。对于肾毒性肾炎实验,通过腹膜内途径用CFA中的200μg羊IgG(BioRad)对小鼠进行预免疫,然后4天后静脉注射羊NTS(Probetex,Inc.)(每克小鼠2μl血清)。在羊NTS注射之前1小时,单独注射IVIG(1g/kg)、B4ST6Fc(50μg)或其媒介物。使用改良的脲酶试剂盒(Stanbio Laboratory),通过酶偶联平衡法测定血清中的尿素氮(BUN)。所有动物实验均按照MGH的机构动物护理和使用委员会的规定进行。

  氯吡格雷处理。如前所述(Pucci等人,2016),每天注射10mg/kg氯吡格雷(Selleckchem)进行血小板抑制。在炎性关节炎模型中,在注射K/BxN血清之前2天开始处理。在肾毒性肾炎模型中,用羊IgG预免疫后2天开始处理。持续处理3周。

  体外糖基化。如先前所述(Anthony等人,2008),在体外检查融合酶的酶活性。简而言之,用唾液酸酶A(ProZyme)和β1,4-半乳糖苷酶-S(New England Biolabs,Inc.)在37℃下过夜处理聚糖受体蛋白(胎蛋白,人或小鼠IgG Fc),以除去唾液酸和半乳糖。为了评估B4Fc或B4ST6Fc的半乳糖基转移酶活性,将无唾液酸化的(asialylated)、无半乳糖基化的聚糖-受体蛋白与5mM UDP-半乳糖(Calbiochem)在2×半乳糖基化缓冲液(50mM MOPS,20mMMnCl2,pH7.2)中在37℃下孵育过夜。为了评估ST6Fc或B4ST6Fc的唾液酸转移酶活性,将无唾液酸化的糖蛋白与5mM CMP唾液酸(Nacalai tesque)在唾液酸化缓冲液(150mM NaCl,20mMHEPES,pH7.4)中在37℃下孵育过夜。

  蛋白印迹和凝集素印迹。如先前所述进行蛋白印迹和凝集素印迹(Anthony等人,2008)。简而言之,将等量的蛋白在4–12%Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(Life Technologies)上分离,然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。在PBST(0.05%Tween 20)中用5%奶粉封闭膜以进行蛋白印迹后,使用抗人IgG-HRP(20ng/ml,Promega);抗人B4GALT1(100ng/ml,Sigma-Aldrich),然后抗兔IgG-HRP(50ng/ml,Promega);或抗人ST6GAL1血清(1:100,来自J.Paulson博士的慷慨惠赠),然后抗兔IgG-HRP两者中任何一个检测蛋白。对于凝集素印迹,将膜在无蛋白封闭缓冲液(Thermo Fisher Scientific)中封闭,并用生物素化的接骨木黑胶凝集素(SNA;5μg/ml,Vector Laboratories)或生物素化的鸡冠刺桐凝集素(ECL;5μg/ml,Vector Laboratories)两者中任何一个作为探针,分别检测末端唾液酸或半乳糖。

  HPLC聚糖分析。根据制造商的说明,分别使用PNGaseF或Endo S(New EnglandBiolabs,Inc.)从糖蛋白中释放总或Fc特异性N连接聚糖。在37℃下过夜进行去糖基化反应,以确保聚糖的有效释放。使用GlykoCleanTMG色谱柱(Prozyme)从反应中纯化聚糖,干燥,并用2-AB(2-氨基苯甲酰胺)(Sigma-Aldrich)进行荧光标记。用GlykoCleanTMS-plus色谱柱(Prozyme)清洗标记的聚糖,干燥,然后进行HPLC分析。将聚糖样品溶解在100mM甲酸铵(pH4.5)中,并使用配备有2.1×150mm,2.7μm AdvanceBio聚糖映射柱和荧光检测器的Agilent 1260Infinity四元液相色谱系统进行分离。通过比较市售人IgG N-连接聚糖文库的峰,在OpenLAB软件(Agilent)中分析产生的峰,并指定糖型。

  羊IgG特异性循环IgG水平的测定。用5%牛血清白蛋白封闭后,将涂有5μg/mL羊IgG的96孔ELISA板与1:500稀释的血清孵育。用含有0.05%Tween 20的PBS洗涤后,将板与HRP缀合的抗小鼠IgG-Fc(Bethyl Laboratories)一起孵育。通过3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB;Biolegend)评估结合的IgG的量,并在添加2M硫酸后测定450nm处的吸光度。

  用于IgG纯化的肾脏和关节匀浆的制备。在抗GBM抗血清注射后第4天和第7天使小鼠放血。通过血清凝胶管(BD)从血液中分离出血清,并与蛋白G高容量琼脂糖珠(ThermoFisher Scientific)一起孵育以进行IgG纯化。解剖在关节和肾脏上方切开的爪子,将其悬浮在补充有蛋白酶抑制剂和2mM EDTA的1mL PBS中,切成小块,然后用不锈钢珠和TissueLyser II(Qiagen)以3Hz/s的速度机械匀浆2分钟。然后将匀浆稀释5倍体积(含蛋白抑制剂(Thermo)和2mM EDTA的PBS),通过70μm滤网过滤,并以1000×g离心5分钟。使用上清液,用蛋白G高容量琼脂糖珠纯化IgG。

  组织学。解剖踝关节并在固定剂和脱钙剂溶液Cal-Ex II中孵育48小时-72小时(Fisher Chemical),并包埋在石蜡中。4μm切片用苏木精/曙红染色以进行组织学分析。解剖肾脏,固定在10%福尔马林缓冲液中,并包埋在石蜡中。用过碘酸希夫(periodic acid-schiff,PAS)和苏木精/曙红对4μm石蜡切片进行染色,以进行光学显微镜分析。根据制造商的说明,将4μm OCT(组织-Tek)冷冻肾切片固定在丙酮中,并根据指示用DAPI(Biolegend)或兔抗小鼠IgG-Fc特异性DyLight405(Jackson ImmunoResearch)与大鼠抗小鼠CD41-APC(Biolegend)、大鼠抗小鼠CD62P-PE(Biolegend)和山羊抗小鼠Nephrin(R&D Systems),然后驴抗山羊IgG-AF488(Jackson ImmunoResearch)组合进行染色。使用荧光显微镜(CarlZeiss)检查载玻片。

  血小板制备。血小板分离、活化和抑制是根据过去的研究(Boilard等人,2010;Lee等人,2014)改编的。健康个体给予知情同意,并将全血收集在柠檬酸钠缓冲的采血管(BD)中,并以200×g离心10分钟。收集上清液中富含血小板的血浆(PRP),并以900×g进一步离心5分钟。在除去上清液中的血小板不良血浆后,将沉淀的血小板重悬于140mM NaCl、3mMKCl、0.5mM MgCl2、5mM NaHCO3、10mM D-葡萄糖、10mM HEPES、pH 7.4中。在37℃下使用0.2U凝血酶(Roche)5分钟实现血小板活化。在室温下使用0.25mg氯吡格雷抑制血小板活化15分钟。通过1000×g离心5分钟使血小板沉淀,并定量血小板上清液中的UDP-半乳糖和CMP-SA。

  人血清中半乳糖和唾液酸供体的定量。除了一个例外,如制造商(R&Dsystems)所说明的,使用唾液酸转移酶和糖基转移酶活性试剂盒对人血小板上清液中的聚糖供体进行定量。使用一系列UDP-Gal和CMP-SA生成标准曲线,以便更准确地报告浓度。

  血清半衰期实验。将50μg的IVIG或B4ST6Fc静脉内施用于C57BL/6雌性小鼠。在注射后直至第4天每天对小鼠放血,直到第10天隔天放血。通过ELISA检测小鼠血清中的IVIG或B4ST6Fc。简而言之,将96孔板用5μg/ml抗人IgG Fc(Bethyl Laboratories)涂覆,在PBS中用2%BSA封闭,并用抗人IgG-HRP(20ng/ml,Promega)作为探针。使用3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB;Thermo Fisher Scientific)进行检测,并使用2M硫酸终止反应。

  验血。将50μg的B4ST6Fc静脉内注射给小鼠。施用酶1周或2个月后,给小鼠放血,并将全血和血清送至MGH组织病理学研究中心进行全血细胞计数和综合代谢组检测。

  量化和统计分析。在GraphPad Prism中进行数据分析:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.005,****p<0.001,通过双向方差分析(ANOVA)和Tukey的多重比较检验确定。

  表1.材料和来源

  

  

  表2.寡核苷酸

  

  括号中显示HindIII(AAGCTT)和XhoI(CTCGAG)的限制性酶切位点。

  实施例2:工程化可溶性糖基转移酶

  ST6GAL1催化α2,6唾液酸与N-连接聚糖上的半乳糖附连(Meng等人,2013)。由ST6GAL1进行的唾液酸化通常发生在反式高尔基体中,其中糖基转移酶被跨膜结构域锚定(TMD,图1C)。β-分泌酶(BACE1)切割位点存在于ST6GAL1的EFQ41-43处的腔结构域中,这导致ST6GAL1分泌(图1C和8)(Woodard-Grice等人,2008)。值得注意的是,最近的研究表明,可溶性ST6GAL1有助于IgG Fc聚糖的唾液酸化(Jones等人,2012;Sugimoto等人,2007;Jones等人,2016)。唾液酸化对IgG生物学的非凡影响促使我们探索体内糖工程化IgG的治疗潜力。

  为此,将糖基化酶与人IgG1 Fc融合,这是产生可溶性形式的膜蛋白的常用方法。具有Fc和ST6GAL1融合体的表达构建体在氨基酸序列中包括EFQ41-43上游区域,产生多种蛋白产物,与BACE1活性一致(图8)。然而,当Fc直接连接至E41时,省略了ST6GAL1的前40个氨基酸,产生单个产物(ST6Fc,图1C和8B)。因为唾液酸化效率随半乳糖含量的增加而提高(Anthony等人,2008a),所以对负责将半乳糖附连至IgG Fc聚糖的B4GALT1酶采用了类似的方法。将B4GALT1腔结构域与人IgG1 Fc工程化融合,产生单个蛋白产物(B4Fc,图1C和8B)。确定工程化糖基转移酶具有正确的分子量,并通过免疫印迹被对B4GALT1、ST6GAL1和人IgG特异的抗体所识别(图8D)。

  使用胎球蛋白(高度糖基化的蛋白质)作为糖工程的目标,研究了工程化酶的体外活性。首先用糖苷酶处理胎球蛋白,去除唾液酸和半乳糖残基,产生无唾液酸化、半乳糖基化(G2)和无半乳糖基化(G0)的胎球蛋白(图1D)。将G0和G2胎球蛋白与B4Fc、ST6Fc或与两种酶(B4ST6Fc)以及糖-核苷酸供体(分别用于半乳糖和唾液酸的UDP-半乳糖(UDP-Gal)和CMP-唾液酸(CMP-SA))一起孵育。通过凝集素印迹检查连接特异性糖基化,并揭示B4Fc有效地附连β1,4连接中的末端半乳糖,ST6Fc附连α2,6末端唾液酸(图1D)。当与半乳糖供体一起孵育时,B4ST6Fc附连β1,4半乳糖(UDP-Gal,图1D)。如上所述,研究表明半乳糖基化可以通过增加潜在的唾液酸化位点的数量来提高唾液酸化的效率(Anthony等人,2008a),而B4ST6Fc与半乳糖和唾液酸供体一起孵育时,B4ST6Fc有效地唾液酸化胎球蛋白(图1D)。此外,B4ST6Fc将半乳糖和唾液酸转移至小鼠和人IgG中(图1E)。

  实施例3:体内唾液酸化的抗炎活性

  试验这些工程化的糖基化酶在体内减轻炎症的能力。给予小鼠关节炎K/BxN血清,该血清可引起主要由IgG1自身抗体介导的关节炎症,该抗体在处理后数天内会出现水肿和炎性细胞浸润(Korganow等人,1999)。动物还接受PBS、高剂量IVIG(1g/kg)、B4Fc(2.5mg/kg)、ST6Fc(2.5mg/kg)或B4Fc和ST6Fc(B4ST6Fc,2.5mg/kg,图2A-2D)。如通过临床评分所测定的,关节炎血清在经PBS处理的动物中诱导强烈的炎症,而通过IVIG减轻炎症(图2A-2B)。B4Fc和ST6Fc均不能单独减轻诱导的炎症。然而,当共施用工程化的酶(B4ST6Fc,2.5mg/kg)时,炎症显著减弱至通过IVIG达到的相似水平(图2C-2D)。与用PBS处理的对照相比,在用IVIG和B4ST6Fc处理的动物中,炎症渗入关节,以及在处理后7天的组织破坏明显减少(图2E)。总之,这些结果表明,施用同时附连半乳糖和唾液酸的酶可有效减轻体内的被动性自身免疫性关节炎的炎症。

  为了将这些发现扩展至自身免疫疾病的活动模型,使用古德帕斯彻病(Goodpasture’s disease)的模型,该模型导致肾毒性肾炎(NTN),其主要由沉积在肾脏中的导致肾脏损害的基于IgG2b的免疫复合物驱动(Lerner等人,1967,Schrijver等人,1990,Kaneko等人,2006a)。在第7天通过测定血液尿素氮(BUN)水平,B4ST6Fc的施用与IVIG一样有效地抑制了肾脏病理(图2F),并延长了存活(图2G)。实际上,与PBS对照相比,B4ST6Fc和IVIG在第7天减少炎性细胞向肾脏的浸润(图2H)。通过测定血清或肾脏IgG滴度,IVIG和B4ST6Fc均不影响诱导的病原性抗体应答(图9A-9B)。总之,这些结果表明,B4ST6Fc进行的体内唾液酸化以比免疫调节高剂量IVIG低400倍的剂量有效改善自身抗体介导的肾脏破坏。

  实施例4:体内唾液酸化的要求

  使用鼠模型的功能研究已经支持了抑制性FcγRIIB对IVIG和唾液酸化IgG Fc的抗炎活性的要求(Samuelsson等人,2001;Bruhns等人,2003;Anthony等人,2011,Schwab等人,2014),并且在向慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病患者施用高剂量IVIG后观察到白细胞中FcγRIIB的表面表达增加(Tackenberg等人,2009)。此外,唾液酸化的IgG Fc显示需要鼠SIGN-R1或人DC-SIGN来抑制炎症(Anthony等人,2011,Anthony等人,2008b,Schwab等人,2012)。因此,IgG的唾液酸化将受体的偏好性转换为II型FcγR,而唾液酸化的IgG与这些受体的连接最终导致炎性细胞上抑制性FcγRIIB的上调(Pincetic等人,2014)。还进行了实验以确定体内唾液酸化是否通过类似于IVIG的途径抑制炎症。将K/BxN血清与PBS、IVIG或B4ST6Fc一起施用于野生型或FcγRIIB-/-小鼠,并追踪接下来几天的爪炎症。在FcγRIIB-/-小鼠中,相对于PBS,IVIG和B4ST6Fc都没有抑制炎症(图3A、3B和10A),这表明对该受体而言需要其抗炎活性。接下来,向小鼠施用抗体,导致SIGN-R1瞬时敲低(TKO SIGN-R1(Kang等人,2004)),已被证明可减弱IVIG和体内唾液酸化的IgG抗炎活性(Anthony等人,2008b)。这导致在用K/BxN和PBS、IVIG或B4ST6Fc处理的小鼠中未观察到差异,表明SIGN-R1干扰抑制IVIG和体内唾液酸化的抗炎活性(图3C、3D和10B)。

  接下来,将K/BxN血清施用于SIGN-R1-/-和与SIGN-R1-/-背景杂交的人DC-SIGN转基因小鼠(hDC-SIGN+/SIGN-R1-/-,图3E、3F、3G)。小鼠还接受PBS、IVIG或B4ST6Fc,并在接下来的几天中监测炎症。K/BxN血清的转移连同PBS处理导致两种基因型中的强烈炎症(图3E、3F)。SIGN-R1-/-动物没有被IVIG或B4ST6Fc保护免于诱导的关节炎(图3E)。然而,IVIG和B4ST6Fc在hDC-SIGN+/SIGN-R1-/-小鼠中均减弱诱导的炎症(图3F)。总之,这些结果表明IVIG和通过工程化的半乳糖基和唾液酸转移酶进行的体内唾液酸化可以通过相似的途径抑制炎症。

  IVIG和体内唾液酸化之间共享的受体和途径增加了这种可能性,即工程化酶上的Fc聚糖而非酶促活性负责体内的抗炎活性。因此,产生通过将两个酶促结构域半胱氨酸残基突变为丙氨酸而产生酶促失活的ST6Fc(C350A、C361A、ST6FcCACA,图4A(Meng等人,2013))。并行地,用IgG Fc特异性内切糖苷酶EndoS处理B4Fc和ST6Fc以去除Fc聚糖(B4ST6Fc-Endo,图4B)(Collin和Olsen,2001)。已显示酶促去除Fc聚糖消除IgG和FcγR的相互作用(Allhorn等人,2010;Benkhoucha等人,2012;Yang等人,2010)。重要的是,尽管半乳糖基转移酶活性保持不变,但是B4ST6FcCACA不能在体外将唾液酸转移至人IgG Fc(图4C)。然而,B4ST6Fc-Endo保留半乳糖基和唾液酸转移酶活性(图4C)。试验了这些酶的体内抗炎活性。向小鼠施用K/BxN血清,小鼠也接受PBS、IVIG、B4ST6Fc、B4ST6FcCACA或B4ST6Fc-Endo。K/BxN转移诱导强烈的炎症,其被IVIG、B4ST6Fc和B4ST6Fc-Endo减弱(图4D、4E)。然而,B4ST6FcCACA不能抑制诱导的炎症(图4D、4E)。这些结果证明,在体内抑制炎症需要转移酶活性而不是工程化酶上的Fc聚糖。

  实施例5:体内部位特异性唾液酸化

  尽管施用工程化的糖基转移酶有力地抑制自身免疫炎症,但潜在的不良副作用可能是脱靶聚糖修饰。通常,在IgG Fc聚糖上发现低水平的唾液酸,因为健康个体中总IgG的5-10%具有唾液酸化的Fc聚糖。细胞和可溶性糖蛋白上大多数复杂的触角聚糖都是高度唾液酸化的,从而限制体内唾液酸化的潜在脱靶作用(Kaneko等人,2006b,Youings等人,1996)。尽管如此,进行实验以检查体内施用B4ST6Fc后的毒性和全身糖基化。B4ST6Fc在循环中的半衰期与IVIG相似(分别为8天和7天,图11A、11B),表明这些分子的Fc部分类似地控制着体内的血清半衰期。还进行实验以检查施用后一周和两个月的B4ST6Fc的稳态作用(图11C)。在红细胞(RBC)、白细胞(WBC)和血小板的全血细胞计数(CBC)分析中未发现有害作用。综合代谢组(CMP)分析显示,血清葡萄糖和钙水平保持在正常范围内,而肾脏和肝脏功能未改变。分析显示在PBS处理和任一B4ST6Fc处理之间几乎没有差异,并且表明B4ST6Fc的施用是无毒的(图11C)。在施用B4ST6Fc后一周和两个月,进行进一步的实验以检查IgG和总血清蛋白的糖基化(图11D)。与PBS处理的对照相比,在B4ST6Fc处理的动物中观察到的糖基化变化最小,表明体内唾液酸化的脱靶效应最小。

  由于两种工程化酶的施用均在体内具有抗炎作用,但在稳态条件下并未明显改变血清IgG或蛋白糖基化作用,因此进行实验以检查在炎症反应过程中的糖基化。在接受PBS、IVIG或B4ST6Fc的一组小鼠中诱导NTN,并检查总的N-连接糖基化。诱发疾病后七天,在PBS、IVIG或B4ST6Fc处理的小鼠中未观察到循环IgG的差异,这与B4ST6Fc不影响循环糖蛋白的糖基化的发现一致(图5A)。有趣的是,已经观察到与从PBS或IVIG处理的小鼠的肾脏中回收的IgG相比,从B4ST6Fc处理的动物的肾脏中回收的IgG的唾液酸化增加(图5B)。血清的抗炎单唾液酸化与炎性无半乳糖基化的IgG Fc聚糖之比(S1/G0%)显示血清IgG的唾液酸含量无差异,而从肾脏中回收的IgG的唾液酸化显著增加,但无半乳糖基化的肾脏IgG Fc聚糖的二唾液酸化未改变(图5C、5D、12)。从PBS、IVIG或B4ST6Fc处理的动物的血清(S)和肾脏(K)纯化的IgG的免疫印迹分析显示在所有样品中的小鼠IgG的可测定水平,而人IgG Fc仅在用IVIG处理的小鼠中可检测到(图5E)。这表明在PBS和B4ST6Fc处理组上对IgG聚糖的分析仅限于内源性小鼠IgG Fc,而不是工程化糖基转移酶的Fc。总之,这些结果表明,在炎症部位的内源性IgG被B4ST6Fc选择性地唾液酸化。

  实施例6:体内唾液酸化需要血小板活化

  检测可溶性ST6GAL1的活性的研究显示血小板作为CMP唾液酸(CMP-SA)的供体,需要唾液酸化反应(Jones等人,2016;Jones等人,2012;Lee等人,2014)。因此,进行实验以确定血小板是否提供B4ST6Fc的糖-核苷酸供体。实际上,在诱导了NTN的小鼠肾脏的肾小球中检测到CD41+血小板,而在未处理的肾脏的肾小球中未检测到,这与先前的研究表明血小板募集到炎症部位是一致的(图6A和13A)(Devi等人,2010,Boilard等人,2010)。此外,NTN-发炎的肾脏中的CD41+血小板也表达了血小板活化标志物CD62P(图6A、13A)。在NTN发炎期间用PBS、IVIG或B4ST6Fc进行处理不影响血小板的积聚和活化(图6A、13A)。

  还进行实验以确定体内唾液酸化的抗炎活性是否需要血小板活化。在施用K/BxN血清前两天,每天给予小鼠氯吡格雷(10mg/kg),以防止血小板活化(Pucci等人,2016)。小鼠还接受PBS、IVIG或B4ST6Fc,并在接下来的几天内监测炎症。氯吡格雷处理不影响PBS处理的动物的诱发炎症(图6B-6D)。在存在氯吡格雷的情况下,IVIG抑制炎症(图6B-6D)。然而,当与氯吡格雷配合给予时,B4ST6Fc不能减轻炎症(图6C、6D)。

  为了扩展这些结果,在施用氯吡格雷的小鼠中诱导NTN(图6E-6H),然后接受PBS、IVIG或B4ST6Fc。重要的是,这些处理并未影响所处理的小鼠的抗羊IgG滴度(图13B)。如通过血液尿素氮水平和存活所测定的,NTN的诱导在氯吡格雷和PBS处理的动物中引起肾脏损害(图6G、6H)。不管氯吡格雷处理如何,IVIG保护处理的小鼠免于肾脏疾病(图6E-H)。然而,当与氯吡格雷一起给予时,B4ST6Fc在减轻疾病方面无效(图6G、6H)。总之,这些结果表明,B4ST6Fc的抗炎活性而不是IVIG取决于体内的血小板活化。

  进行进一步的实验以确定人类血小板是否释放唾液酸化所需的糖-核苷酸供体,并从健康供体中产生富含血小板的血浆(PRP)(Lee等人,2014;Jones等人,2016;Tan人,2016)。血小板未经处理、未活化(凝血酶+)或在氯吡格雷处理后被活化(氯吡格雷+/凝血酶+),并测定唾液酸和半乳糖-核苷酸供体(CMP-SA、UDP-Gal)的释放。实际上,人血小板在活化时释放唾液酸和半乳糖-核苷酸供体二者,并且该释放被氯吡格雷显著抑制(图7A、7B)。有趣的是,活化增加半乳糖核苷酸供体的释放,但没有增加唾液酸供体的释放。

  需要成功的抗炎治疗剂来抑制持续的炎症。为了确定体内唾液酸化是否在治疗上有效,用诱导关节炎的血清处理小鼠,然后在诱导关节炎后的第0天或第3天给予PBS、IVIG或B4ST6Fc。当在第0天施用时,IVIG和B4ST6Fc而非PBS有效地减少诱导的关节炎(图14A、14B)。然而,当在疾病诱导后第3天施用时,IVIG不能抑制诱导的关节炎(图7C、7D)。重要的是,与IVIG和PBS处理组相比,在第3天用关节炎血清和B4ST6Fc处理的小鼠在第7天和第8天表现出显著减轻的炎症(图7C、7D)。这些结果表明,B4ST6Fc能够以治疗方式有效地减轻自身抗体诱导的炎症,这在该模型中用IVIG是无法实现的,与先前的结果一致(Bruhns等人,2003)。

  实施例7:B4Fc和ST6Fc的异源二聚体化

  为了实现B4Fc和ST6Fc的异源二聚体化,在每个重链CH3结构域中引入“旋钮入孔”(KIH)突变。具体地,将Y349C/T366S/L368A/Y407V和S354C/T366W点突变分别引入B4Fc(SEQID NO:42)和ST6Fc(SEQ ID NO:43)。

  图18显示原始B4ST6Fc和新“旋钮入孔”B4ST6Fc的蛋白印迹结果(使用抗人IgG)和考马斯凝胶染色。在图中,ST6Fc代表ST6Fc同源二聚体。B4Fc代表B4Fc同源二聚体。原始B4ST6Fc没有旋钮入孔突变,因此可能是ST6Fc同源二聚体、B4Fc同源二聚体和B4FCST6Fc异源二聚体的混合物。如考马斯凝胶中所示,“KIH”B4ST6Fc是B4FCST6Fc异源二聚体,并在凝胶中稍高。

  实施例8:在关节炎模型中试验B4FcST6Fc异源二聚体

  为了试验体内活性,给小鼠施用K/BxN血清,然后给小鼠施用高剂量的IVIG、原始B4ST6Fc、异源二聚体B4ST6FcKln(“旋钮入孔”B4ST6Fc)和B4ST6FcG3(具有没有KIH突变的IgG3Fc结构域)。随后几天监测足肿胀。如图19所示,在PBS处理的对照中(圆圈),K/BxN血清诱导爪中强烈的炎症。相反,高剂量的IVIG(正方形)、B4ST6Fc(实心三角形)、异源二聚体B4ST6FcKln(虚线和菱形)和B4ST6FcG3(倒三角形)均减轻炎症。结果表明,原始B4ST6Fc、异源二聚体B4ST6FcKln和B4ST6FcG3可以减轻关节炎模型中的炎症,因此可用于治疗自身免疫病症。

  其他实施方式

  应当理解,尽管已经结合本发明的详细描述描述了本发明,但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围,本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。

  参考文献

  Ackerman,M.E.,Crispin,M.,Yu,X.,Baruah,K.,Boesch,A.W.,Harvey,D.J.,Dugast,A.S.,Heizen,E.L.,Ercan,A.,Choi,I.,Streeck,H.,Nigrovic,P.A.,Bailey-Kellogg,C.,Scanlan,C.&Alter,G.2013.Natural variation in Fc glycosylation ofHIV-specific antibodies impacts antiviral activity.J Clin Invest,123,2183-92.

  Albert,H.,Collin,M.,Dudziak,D.,Ravetch,J.V.&Nimmerjahn,F.2008.In vivoenzymatic modulation of IgG glycosylation inhibits autoimmune disease in anIgG subclass-dependent manner.Proc Natl Acad Sci U S A,105,15005-9.

  Allhorn,M.,Briceno,J.G.,Baudino,L.,Lood,C.,Olsson,M.L.,Izui,S.&Collin,M.2010.The IgG-specific endoglycosidase EndoS inhibits both cellularand complement-mediated autoimmune hemolysis.Blood,115,5080-8.

  Anthony,R.M.,Kobayashi,T.,Wermeling,F.&Ravetch,J.V.2011.Intravenousgammaglobulin suppresses inflammation through a novel T(H)2 pathway.Nature,475,110-3.

  Anthony,R.M.,Nimmerjahn,F.,Ashline,D.J.,Reinhold,V.N.,Paulson,J.C.&Ravetch,J.V.2008a.Recapitulation of IVIG anti-inflammatory activity with arecombinant IgG Fc.Science,320,373-6.

  Anthony,R.M.,Wermeling,F.,Karlsson,M.C.&Ravetch,J.V.2008b.Identification of a receptor required for the anti-inflammatoryactivity of IVIG.Proc Natl Acad Sci U S A,105,19571-8.

  Arnold,J.N.,Wormald,M.R.,Sim,R.B.,Rudd,P.M.&Dwek,R.A.2007.The impactof glycosylation on the biological function and structure of humanimmunoglobulins.Annu Rev Immunol,25,21-50.

  Bayry,J.,Bansal,K.,Kazatchkine,M.D.&Kaveri,S.V.2009.DC-SIGN andalpha2,6-sialylated IgG Fc interaction is dispensable for the anti-inflammatory activity of IVIg on human dendritic cells.Proc Natl Acad Sci U SA,106,E24;author reply E25.

  Beck,A.,Wurch,T.,Bailly,C.&Corvaia,N.2010.Strategies and challengesfor the next generation of therapeutic antibodies.Nat Rev Immunol,10,345-52.

  Benkhoucha,M.,Molnarfi,N.,Santiago-Raber,M.L.,Weber,M.S.,Merkler,D.,Collin,M.&Lalive,P.H.2012.IgG glycan hydrolysis by EndoS inhibitsexperimental autoimmune encephalomyelitis.J Neuroinflammation,9,209.

  Boilard,E.,Nigrovic,P.A.,Larabee,K.,Watts,G.F.,Coblyn,J.S.,Weinblatt,M.E.,Massarotti,E.M.,Remold-O'donnell,E.,Farndale,R.W.,Ware,J.&Lee,D.M.2010.

  Platelets amplify inflammation in arthritis via collagen-dependentmicroparticle production.Science,327,580-3.

  Bruhns,P.,Samuelsson,A.,Pollard,J.W.&Ravetch,J.V.2003.Colony-stimulating factor-1-dependent macrophages are responsible for IVIGprotection in antibody-induced autoimmune disease.Immunity,18,573-81.

  Chung,A.W.,Ghebremichael,M.,Robinson,H.,Brown,E.,Choi,I.,Lane,S.,Dugast,A.S.,Schoen,M.K.,Rolland,M.,Suscovich,T.J.,Mahan,A.E.,Liao,L.,Streeck,H.,Andrews,C.,Rerks-Ngarm,S.,Nitayaphan,S.,De Souza,M.S.,Kaewkungwal,J.,Pitisuttithum,P.,Francis,D.,Michael,N.L.,Kim,J.H.,Bailey-Kellogg,C.,Ackerman,M.E.&Alter,G.2014.Polyfunctional Fc-effector profiles mediated by IgGsubclass selection distinguish RV144 and VAX003 vaccines.Sci Transl Med,6,228ra38.

  Clynes,R.2007.Protective mechanisms of IVIG.Curr Opin Immunol,19,646-51.

  Collin,M.&Olsen,A.2001.EndoS,a novel secreted protein fromStreptococcus pyogenes with endoglycosidase activity on human IgG.EMBO J,20,3046-55.

  Davies,J.,Jiang,L.,Pan,L.Z.,Labarre,M.J.,Anderson,D.&Reff,M.2001.Expression of GnTIII in a recombinant anti-CD20 CHO production cellline:Expression of antibodies with altered glycoforms leads to an increase inADCC through higher affinity for FC gamma RIII.Biotechnol Bioeng,74,288-94.

  Debre,M.,Bonnet,M.C.,Fridman,W.H.,Carosella,E.,Philippe,N.,Reinert,P.,Vilmer,E.,Kaplan,C.,Teillaud,J.L.&Griscelli,C.1993.Infusion of Fc gammafragments for treatment of children with acute immune thrombocytopenicpurpura.Lancet,342,945-9.

  Devi,S.,Kuligowski,M.P.,Kwan,R.Y.,Westein,E.,Jackson,S.P.,Kitching,A.R.&Hickey,M.J.2010.Platelet recruitment to the inflamed glomerulus occursvia an alphaIIbbeta3/GPVI-dependent pathway.Am J Pathol,177,1131-42.

  Ferrara,C.,Grau,S.,Jager,C.,Sondermann,P.,Brunker,P.,Waldhauer,I.,Hennig,M.,Ruf,A.,Rufer,A.C.,Stihle,M.,Umana,P.&Benz,J.2011.Uniquecarbohydrate-carbohydrate interactions are required for high affinity bindingbetween Fc{gamma}RIII and antibodies lacking core fucose.Proc Natl Acad Sci US A,108,12669-74.

  Fiebiger,B.M.,Maamary,J.,Pincetic,A.&Ravetch,J.V.2015.Protection inantibody-and T cell-mediated autoimmune diseases by antiinflammatory IgG Fcsrequires type II FcRs.Proc Natl Acad Sci U S A,112,E2385-94.

  Franklin,E.C.1975.Structure and function of immunoglobulins.ActaEndocrinol Suppl(Copenh),194,77-95.

  Huber,R.,Deisenhofer,J.,Colman,P.M.,Matsushima,M.&Palm,W.1976.Crystallographic structure studies of an IgG molecule and an Fcfragment.Nature,264,415-20.

  Imbach,P.,Barandun,S.,D'apuzzo,V.,Baumgartner,C.,Hirt,A.,Morell,A.,Rossi,E.,Schoni,M.,Vest,M.&Wagner,H.P.1981.High-dose intravenousgammaglobulin for idiopathic thrombocytopenic purpura in childhood.Lancet,1,1228-31.

  Jefferis,R.2005.Glycosylation of recombinant antibodytherapeutics.Biotechnol Prog,21,11-6.

  Jefferis,R.2009a.Glycosylation as a strategy to improve antibody-based therapeutics.Nat Rev Drug Discov,8,226-34.

  Jefferis,R.2009b.Glycosylation of antibody therapeutics:optimisationfor purpose.Methods Mol Biol,483,223-38.

  Jones,M.B.,Nasirikenari,M.,Lugade,A.A.,Thanavala,Y.&Lau,J.T.2012.Anti-inflammatory IgG production requires functional P1 promoter inbeta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase 1(ST6Gal-1)gene.J Biol Chem,287,15365-70.

  Jones,M.B.,Oswald,D.M.,Joshi,S.,Whiteheart,S.W.,Orlando,R.&Cobb,B.A.2016.B-cell-independent sialylation of IgG.Proc Natl Acad Sci U S A,113,7207-12.

  Kalcheva,I.,Elliott,R.W.,Dalziel,M.&Lau,J.T.1997.The gene encodingbeta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase maps to mouse chromosome 16.MammGenome,8,619-20.

  Kaneko,Y.,Nimmerjahn,F.,Madaio,M.P.&Ravetch,J.V.2006a.Pathology andprotection in nephrotoxic nephritis is determined by selective engagement ofspecific Fc receptors.J Exp Med,203,789-97.

  Kaneko,Y.,Nimmerjahn,F.&Ravetch,J.V.2006b.Anti-inflammatory activityof immunoglobulin G resulting from Fc sialylation.Science,313,670-3.

  Kang,Y.S.,Kim,J.Y.,Bruening,S.A.,Pack,M.,Charalambous,A.,Pritsker,A.,Moran,T.M.,Loeffler,J.M.,Steinman,R.M.&Park,C.G.2004.The C-type lectin SIGN-R1 mediates uptake of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniaein the marginal zone of mouse spleen.Proc Natl Acad Sci U S A,101,215-20.

  Korganow,A.S.,Ji,H.,Mangialaio,S.,Duchatelle,V.,Pelanda,R.,Martin,T.,Degott,C.,Kikutani,H.,Rajewsky,K.,Pasquali,J.L.,Benoist,C.&Mathis,D.1999.Fromsystemic T cell self-reactivity to organ-specific autoimmune disease viaimmunoglobulins.Immunity,10,451-61.

  Lee,M.M.,Nasirikenari,M.,Manhardt,C.T.,Ashline,D.J.,Hanneman,A.J.,Reinhold,V.N.&Lau,J.T.2014.Platelets support extracellular sialylation bysupplying the sugar donor substrate.J Biol Chem,289,8742-8.

  Lerner,R.A.,Glassock,R.J.&Dixon,F.J.1967.The role of anti-glomerularbasement membrane antibody in the pathogenesis of human glomerulonephritis.JExp Med,126,989-1004.

  Li,T.,Dilillo,D.J.,Bournazos,S.,Giddens,J.P.,Ravetch,J.V.&Wang,L.X.2017.Modulating IgG effector function by Fc glycan engineering.Proc NatlAcad Sci U S A,114,3485-3490.

  Lu,L.L.,Chung,A.W.,Rosebrock,T.R.,Ghebremichael,M.,Yu,W.H.,Grace,P.S.,Schoen,M.K.,Tafesse,F.,Martin,C.,Leung,V.,Mahan,A.E.,Sips,M.,Kumar,M.P.,Tedesco,J.,Robinson,H.,Tkachenko,E.,Draghi,M.,Freedberg,K.J.,Streeck,H.,Suscovich,T.J.,Lauffenburger,D.A.,Restrepo,B.I.,Day,C.,Fortune,S.M.&Alter,G.2016.A Functional Role for Antibodies in Tuberculosis.Cell,167,433-443 e14.

  Meng,L.,Forouhar,F.,Thieker,D.,Gao,Z.,Ramiah,A.,Moniz,H.,Xiang,Y.,Seetharaman,J.,Milaninia,S.,Su,M.,Bridger,R.,Veillon,L.,Azadi,P.,Kornhaber,G.,Wells,L.,Montelione,G.T.,Woods,R.J.,Tong,L.&Moremen,K.W.2013.Enzymaticbasis for N-glycan sialylation:structure of rat alpha2,6-sialyltransferase(ST6GAL1)reveals conserved and unique features for glycan sialylation.J BiolChem,288,34680-98.

  Natsume,A.,Wakitani,M.,Yamane-Ohnuki,N.,Shoji-Hosaka,E.,Niwa,R.,Uchida,K.,Satoh,M.&Shitara,K.2005.Fucose removal from complex-typeoligosaccharide enhances the antibody-dependent cellular cytotoxicity ofsingle-gene-encoded antibody comprising a single-chain antibody linked theantibody constant region.J Immunol Methods,306,93-103.

  Negi,V.S.,Elluru,S.,Siberil,S.,Graff-Dubois,S.,Mouthon,L.,Kazatchkine,M.D.,Lacroix-Desmazes,S.,Bayry,J.&Kaveri,S.V.2007.Intravenousimmunoglobulin:an update on the clinical use and mechanisms of action.J ClinImmunol,27,233-45.

  Nimmerjahn,F.,Gordan,S.&Lux,A.2015.FcgammaR dependent mechanisms ofcytotoxic,agonistic,and neutralizing antibody activities.Trends Immunol,36,325-36.

  Nimmerjahn,F.&Ravetch,J.V.2008a.Anti-inflammatory actions ofintravenous immunoglobulin.Annu Rev Immunol,26,513-33.

  Nimmerjahn,F.&Ravetch,J.V.2008b.Fcgamma receptors as regulators ofimmune responses.Nat Rev Immunol,8,34-47.

  Ohmi,Y.,Ise,W.,Harazono,A.,Takakura,D.,Fukuyama,H.,Baba,Y.,Narazaki,M.,Shoda,H.,Takahashi,N.,Ohkawa,Y.,Ji,S.,Sugiyama,F.,Fujio,K.,Kumanogoh,A.,Yamamoto,K.,Kawasaki,N.,Kurosaki,T.,Takahashi,Y.&Furukawa,K.2016.Sialylationconverts arthritogenic IgG into inhibitors of collagen-induced arthritis.NatCommun,7,11205.

  Okazaki,A.,Shoji-Hosaka,E.,Nakamura,K.,Wakitani,M.,Uchida,K.,Kakita,S.,Tsumoto,K.,Kumagai,I.&Shitara,K.2004.Fucose depletion from human IgG1oligosaccharide enhances binding enthalpy and association rate between IgG1and FcgammaRIIIa.J Mol Biol,336,1239-49.

  Pfeifle,R.,Rothe,T.,Ipseiz,N.,Scherer,H.U.,Culemann,S.,Harre,U.,Ackermann,J.A.,Seefried,M.,Kleyer,A.,Uderhardt,S.,Haugg,B.,Hueber,A.J.,Daum,P.,Heidkamp,G.F.,Ge,C.,Bohm,S.,Lux,A.,Schuh,W.,Magorivska,I.,Nandakumar,K.S.,Lonnblom,E.,Becker,C.,Dudziak,D.,Wuhrer,M.,Rombouts,Y.,Koeleman,C.A.,Toes,R.,Winkler,T.H.,Holmdahl,R.,Herrmann,M.,Bluml,S.,Nimmerjahn,F.,Schett,G.&Kronke,G.2017.Regulation of autoantibody activity by the IL-23-TH17 axis determinesthe onset of autoimmune disease.Nat Immunol,18,104-113.

  Pincetic,A.,Bournazos,S.,Dilillo,D.J.,Maamary,J.,Wang,T.T.,Dahan,R.,Fiebiger,B.M.&Ravetch,J.V.2014.Type I and type II Fc receptors regulateinnate and adaptive immunity.Nat Immunol,15,707-16.

  Pucci,F.,Rickelt,S.,Newton,A.P.,Garris,C.,Nunes,E.,Evavold,C.,Pfirschke,C.,Engblom,C.,Mino-Kenudson,M.,Hynes,R.O.,Weissleder,R.&Pittet,M.J.2016.PF4 Promotes Platelet Production and Lung Cancer Growth.Cell Rep,17,1764-1772.

  Samuelsson,A.,Towers,T.L.&Ravetch,J.V.2001.Anti-inflammatory activityof IVIG mediated through the inhibitory Fc receptor.Science,291,484-6.

  Scallon,B.J.,Tam,S.H.,Mccarthy,S.G.,Cai,A.N.&Raju,T.S.2007.Higherlevels of sialylated Fc glycans in immunoglobulin G molecules can adverselyimpact functionality.Mol Immunol,44,1524-34.

  Schlothauer,T.,Herter,S.,Koller,C.F.,Grau-Richards,S.,Steinhart,V.,Spick,C.,Kubbies,M.,Klein,C.,Umana,P.&Mossner,E.2016.Novel human IgG1 andIgG4 Fc-engineered antibodies with completely abolished immune effectorfunctions.Protein Eng Des Sel,29,457-466.

  Schrijver,G.,Bogman,M.J.,Assmann,K.J.,De Waal,R.M.,Robben,H.C.,VanGasteren,H.&Koene,R.A.1990.Anti-GBM nephritis in the mouse:role ofgranulocytes in the heterologous phase.Kidney Int,38,86-95.

  Schwab,I.,Biburger,M.,Kronke,G.,Schett,G.&Nimmerjahn,F.2012.IVIg-mediated amelioration of ITP in mice is dependent on sialic acid andSIGNR1.Eur J Immunol,42,826-30.

  Schwab,I.,Mihai,S.,Seeling,M.,Kasperkiewicz,M.,Ludwig,R.J.&Nimmerjahn,F.2014.Broad requirement for terminal sialic acid residues andFcgammaRIIB for the preventive and therapeutic activity of intravenousimmunoglobulins in vivo.Eur J Immunol,44,1444-53.

  Schwab,I.&Nimmerjahn,F.2013.Intravenous immunoglobulin therapy:howdoes IgG modulate the immune system?Nat Rev Immunol,13,176-89.

  Shields,R.L.,Lai,J.,Keck,R.,O'connell,L.Y.,Hong,K.,Meng,Y.G.,Weikert,S.H.&Presta,L.G.2002.Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharideimproves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellulartoxicity.J Biol Chem,277,26733-40.

  Stadlmann,J.,Weber,A.,Pabst,M.,Anderle,H.,Kunert,R.,Ehrlich,H.J.,Peter Schwarz,H.&Altmann,F.2009.A close look at human IgG sialylation andsubclass distribution after lectin fractionation.Proteomics,9,4143-53.

  Sugimoto,I.,Futakawa,S.,Oka,R.,Ogawa,K.,Marth,J.D.,Miyoshi,E.,Taniguchi,N.,Hashimoto,Y.&Kitazume,S.2007.Beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase I cleavage by BACE1 enhances the sialylation of solubleglycoproteins.A novel regulatory mechanism for alpha2,6-sialylation.J BiolChem,282,34896-903.

  Tackenberg,B.,Jelcic,I.,Baerenwaldt,A.,Oertel,W.H.,Sommer,N.,Nimmerjahn,F.&Lunemann,J.D.2009.Impaired inhibitory Fcgamma receptor IIBexpression on B cells in chronic inflammatory demyelinatingpolyneuropathy.Proc Natl Acad Sci U S A,106,4788-92.

  Tackenberg,B.,Nimmerjahn,F.&Lunemann,J.D.2010.Mechanisms of IVIGefficacy in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy.J Clin Immunol,30 Suppl 1,S65-9.

  Tan,M.,Yan,H.B.,Li,J.N.,Li,W.K.,Fu,Y.Y.,Chen,W.&Zhou,Z.2016.ThrombinStimulated Platelet-Derived Exosomes Inhibit Platelet-Derived Growth FactorReceptor-Beta Expression in Vascular Smooth Muscle Cells.Cell PhysiolBiochem,38,2348-65.

  Wang,T.T.,Maamary,J.,Tan,G.S.,Bournazos,S.,Davis,C.W.,Krammer,F.,Schlesinger,S.J.,Palese,P.,Ahmed,R.&Ravetch,J.V.2015.Anti-HA Glycoforms DriveB Cell Affinity Selection and Determine Influenza Vaccine Efficacy.Cell,162,160-9.

  Wang,T.T.,Sewatanon,J.,Memoli,M.J.,Wrammert,J.,Bournazos,S.,Bhaumik,S.K.,Pinsky,B.A.,Chokephaibulkit,K.,Onlamoon,N.,Pattanapanyasat,K.,Taubenberger,J.K.,Ahmed,R.&Ravetch,J.V.2017.IgG antibodies to dengue enhancedfor FcgammaRIIIA binding determine disease severity.Science,355,395-398.

  Wang,X.,Vertino,A.,Eddy,R.L.,Byers,M.G.,Jani-Sait,S.N.,Shows,T.B.&Lau,J.T.1993.Chromosome mapping and organization of the human beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase gene.Differential and cell-typespecific usage of upstream exon sequences in B-lymphoblastoid cells.J BiolChem,268,4355-61.

  Washburn,N.,Schwab,I.,Ortiz,D.,Bhatnagar,N.,Lansing,J.C.,Medeiros,A.,Tyler,S.,Mekala,D.,Cochran,E.,Sarvaiya,H.,Garofalo,K.,Meccariello,R.,Meador,J.W.,3rd,Rutitzky,L.,Schultes,B.C.,Ling,L.,Avery,W.,Nimmerjahn,F.,Manning,A.M.,Kaundinya,G.V.&Bosques,C.J.2015.Controlled tetra-Fc sialylation of IVIgresults in a drug candidate with consistent enhanced anti-inflammatoryactivity.Proc Natl Acad Sci U S A,112,E1297-306.

  Woodard-Grice,A.V.,Mcbrayer,A.C.,Wakefield,J.K.,Zhuo,Y.&Bellis,S.L.2008.Proteolytic shedding of ST6Gal-I by BACE1 regulates theglycosylation and function of alpha4beta1 integrins.J Biol Chem,283,26364-73.

  Xiao,H.,Woods,E.C.,Vukojicic,P.&Bertozzi,C.R.2016.Precisionglycocalyx editing as a strategy for cancer immunotherapy.Proc Natl Acad SciU S A,113,10304-9.

  Yang,R.,Otten,M.A.,Hellmark,T.,Collin,M.,Bjorck,L.,Zhao,M.H.,Daha,M.R.&Segelmark,M.2010.Successful treatment of experimental glomerulonephritiswith IdeS and EndoS,IgG-degrading streptococcal enzymes.Nephrol DialTransplant,25,2479-86.

  Youings,A.,Chang,S.C.,Dwek,R.A.&Scragg,I.G.1996.Site-specificglycosylation of human immunoglobulin G is altered in four rheumatoidarthritis patients.Biochem J,314(Pt 2),621-30.

  Zhang,G.,Massaad,C.A.,Gao,T.,Pillai,L.,Bogdanova,N.,Ghauri,S.&Sheikh,K.A.2016.Sialylated intravenous immunoglobulin suppress anti-gangliosideantibody mediated nerve injury.Exp Neurol,282,49-55.

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