甘珀酸在制备抗寨卡病毒药物中的应用
技术领域
本发明涉及药物应用技术领域，更具体地，涉及甘珀酸在制备抗寨卡病毒药物中的应用。
背景技术
甘珀酸(carbenoxolone)为甘草次酸的半琥珀酸酯二钠盐，甘草次酸是甘草酸及其盐(甘草甜素)水解后脱去2分子葡萄糖醛酸产生的化合物，是甘草最主要的化学成分，主要存在于甘草的根茎和根部中。甘珀酸的化学分子式为：C34H48O7Na2，分子量：614.7，甘珀酸为无色粉末，无味，溶于水形成微黄色液体。
甘珀酸的通常医用用途有两种：1、作为缝隙连接阻断剂，用于减少细胞间的物质传导，主要用于心脏、胚胎、肿瘤等实验性研究。2、甘珀酸可通过抑制11β-羟化类固醇脱氢酶(11β-HSD)提高内源性糖皮质激素的活性，从而增强糖皮质激素的作用，具有较强的抗炎活性，在临床上主要用于治疗慢性胃炎、慢性消化性溃疡。
寨卡病毒(Zikavirus,ZIKV)归类于黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)，为单股正链RNA病毒，直径约20nm，是一种通过蚊虫进行传播的虫媒病毒。目前，基于内部基因核苷酸序列研究，寨卡病毒可分为三个基因型：东非型、西非型和亚洲型。寨卡病毒最早于1947年在非洲乌干达的恒河猴体内被发现，长期以来活动比较隐匿，2015年以前爆发疫情主要分布在非洲、东南亚和太平洋岛国。但在2015至2016年大约一年左右的时间里，寨卡病毒在南美地区(尤其是巴西、哥伦比亚、委内瑞拉等地)爆发流行，并快速传播到亚洲、欧洲，有蔓延全球之势。
人感染寨卡病毒后主要引起一种轻微的病症，疾病症状与诸如登革热等其它虫媒病毒感染类似，多数寨卡病毒病患者会出现轻微发热和皮疹，另有一些患者可能还会出现结膜炎、肌肉和关节疼痛。这些症状通常在2～7天后消失，预后良好，极少引起死亡。然而，寨卡病毒肆虐的巴西自2015年10月以来婴儿小头畸形病例激增，已报道的发病率比往年高出数十倍。巴西当地婴儿小头畸形症和寨卡病毒感染存在时间和空间上的联系，在缺乏其他病因假设的情况下，寨卡病毒是很可疑的致畸原因。因此，世界卫生组织2016年2月1日将与寨卡病毒感染可能相关的小头畸形和其他神经系统疾病聚集性病例确定为“国际关注的突发公共卫生事件”。目前尚无特异、有效的抗病毒治疗措施在临床上用于抗寨卡病毒，也缺乏安全、有效的疫苗用于预防寨卡病毒感染。因此，高度重视对寨卡病毒的研究，积极研发有效抑制寨卡病毒感染的药物具有现实的重要性和紧迫性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中缺乏有效抑制寨卡病毒的药物的缺陷，提供甘珀酸在制备抗寨卡病毒的药物中的应用。
本发明的首要目的是提供一种用于治疗寨卡病毒的药物。
本发明的第二个目的是提供甘珀酸在抗寨卡病毒中的应用。
本发明的第三个目的是提供甘珀酸在治疗寨卡病毒引起的小头畸形症的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
一种抗寨卡病毒药物，包括甘珀酸，或者其药学上可以接受的盐。
本发明通过以不同浓度的甘珀酸作用于已经感染了寨卡病毒的细胞，来获得甘珀酸对病毒的抑制效率，实验中甘珀酸的使用浓度均在使细胞在90％以上存活率的浓度范围内进行，即排除了甘珀酸浓度过高而对实验数据的分析产生的影响，结果表明，在25μM的甘珀酸浓度下，甘珀酸对寨卡病毒的抑制率达到99％以上，说明可以用甘珀酸抑制寨卡病毒，且效果突出。
即本发明还提供甘珀酸制备抗寨卡病毒的药物中的应用。
另外，本发明还研究了甘珀酸药学上可以接受的盐对寨卡病毒的抑制作用，结果也发现其药学上可以接受的盐，例如甘草甜素，18β-甘草次酸均对寨卡病毒有很好地抑制作用，因此本发明还提供甘珀酸其药学上可以接受的盐在制备抗寨卡病毒的药物中的应用。
明显的，含有甘珀酸、或者其药学上可以接受的盐的药物组合物在制备抗寨卡病毒的药物中的应用也属于本发明要保护的内容。
优选的，所述药学上可以接受的盐包括但不限于甘草甜素、18β-甘草次酸。
本发明首次发现，甘珀酸对寨卡病毒具有突出的抑制效果。尽管，甘珀酸与甘草甜素、18β-甘草次酸在结构上存在一定的共同结构，而已知甘草甜素、18β-甘草次酸均可以抑制多种病毒，但是甘珀酸还具备独特的C3一羟基端成酯结构，在我们的实验中发现，甘珀酸(CBX)抑制寨卡病毒的效果相比于甘草甜素(GA)和18β-甘草次酸(18β-GRA)要更显著，这表明甘珀酸的C3一羟基端成酯结构使甘珀酸相比于其它甘草酸类化合物，具备更显著的抗寨卡病毒能力。
具体地，上述应用，是指制备常规药用制剂的形式来使用，所述的常规药用制剂可以单独含有活性成分甘珀酸，也可以除含有甘珀酸外，还含有药学上可以接受的载体，如适合于肠胃内和肠胃外给药的油剂，或者无机的固体或者液体赋形剂；该药用制剂的剂型可以是片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、滴剂、注射剂、乳及或者颗粒剂。
优选的，上述寨卡病毒有多个基因型病毒株，主要为东非型、西非型和亚洲型。
更优选的，所述寨卡病毒为亚洲型。
具体的，所述抗寨卡病毒是指抑制寨卡病毒感染细胞，或者直接杀伤寨卡病毒。
更优选的，所述细胞为白蚊伊蚊细胞(C6/36)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、人肺癌上皮细胞(A549)、人单核细胞(THP-1)、人神经干细胞(hNSCs)、人原代巨噬细胞
另外，研究者研究发现：寨卡病毒与登革病毒虽然相似，但是致病机理并不相同。寨卡病毒对神经细胞和生殖细胞都有高度侵染性，并导致新生儿出生缺陷以及睾丸萎缩等，但登革病毒不会导致此类似病症。正在我们的研究中发现甘珀酸并不影响登革病毒入侵宿主细胞的过程，但能够有效阻断寨卡病毒的入侵，说明甘珀酸抗寨卡的分子机制与抗登革的机制并不相同。
本发明还通过构建ZIKV感染的动物模型，发现ZIKV会引起动物小头畸形，且感染了ZIKV的动物的脑发育出现明显迟缓，通过动物给药甘珀酸能够显著改善感染ZIKV动物的脑发育迟缓现象。
因此，本发明还能够提供一种用于治疗寨卡病毒引起的小头畸形症的药物，包括甘珀酸，或者其药学上可以接受的盐。
本发明同时能够提供甘珀酸，或者其药学上可以接受的盐在制备治疗寨卡病毒引起的小头畸形症的药物中的应用。
优选的，所述药学上可以接受的盐包括但不限于甘草甜素、18β-甘草次酸。
具体地，上述应用，是指制备常规药用制剂的形式来使用，所述的常规药用制剂可以单独含有活性成分甘珀酸，也可以除含有甘珀酸外，还含有药学上可以接受的载体，如适合于肠胃内和肠胃外给药的油剂，或者无机的固体或者液体赋形剂；该药用制剂的剂型可以是片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、滴剂、注射剂、乳及或者颗粒剂。
优选的，上述寨卡病毒有多个基因型病毒株，主要为东非型、西非型和亚洲型。
更优选的，所述寨卡病毒为亚洲型。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过对寨卡病毒的体外抑制实验证实了甘珀酸对寨卡病毒具有很好的抑制作用，本发明还通过构建ZIKV感染的动物模型，发现ZIKV会引起动物小头畸形，且感染了ZIKV的动物的脑发育出现明显迟缓，通过动物给药甘珀酸能够显著改善感染ZIKV动物的脑发育迟缓现象。从本质上证明了该药物在治疗寨卡病毒感染疾病中具有广泛的应用前景。同时，甘珀酸来源于甘草，资源十分丰富，获取方便；本发明能够为临床治疗由寨卡病毒引起的疾病提供很好的后选药物，具有十分良好的应用前景。
附图说明
图1为A549细胞在不同浓度的甘珀酸中存活率；
图2为A549细胞在不同浓度的甘草甜素中存活率；
图3为A549细胞在不同浓度的18β-甘草次酸中存活率；
图4为甘珀酸对ZIKV感染A549细胞的抑制作用；
图5为甘珀酸对ZIKV感染Vero细胞的抑制作用；
图6为甘草甜素对ZIKV感染A549细胞的抑制作用；
图7为18β-甘草次酸对ZIKV感染A549细胞的抑制作用；
图8为甘珀酸对ZIKV的直接杀伤作用；
图9为ZIKV感染乳鼠的死亡率和疾病评分结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明实施例中所使用到的研究材料均可以从市场上买到。实验中的A549细胞和Vero细胞均购买于美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)；甘珀酸购买于Sigma公司(C4790-1G)；甘草甜素购买于Aladdin公司(G111376-1g)；18β-甘草次酸购买于Aladdin公司(G109797-1g)；MTT试剂盒购于Sigma公司；胎牛血清(Hyclone，USA)，细胞培养板购买于上海圣纳堡生物科技有效公司；DMEM培养基购买于美国GIBCO公司。
实施例1甘珀酸对A549细胞的毒性实验
包括以下步骤：
1、接种A549细胞：用含5％胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液，以每孔2000～3000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100μl。
2、培养A549细胞：在37℃，5％CO2培养条件下，培养1天。
3、加入甘珀酸：吸弃每个孔中的DMEM培养基，向各个孔中加入100μl用含5％胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度(10μM，25μM，50μM，100μM，200μM)的甘珀酸(CBX)，对照孔加入不含药物的5％胎牛血清的DMEM培养基100μl。
4、呈色：培养24小时后，每孔加MTT溶液10μl，在37℃，5％CO2培养条件下继续孵育4小时，然后终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
5、测光吸收值：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果见表1。
表1不同浓度的甘珀酸对A549细胞的毒性实验
实验结果见图1。由图1甘珀酸对A549的细胞毒性实验可知，在0μM，10μM，25μM，50μM，100μM，200μM甘珀酸浓度下，A549细胞的平均存活率分别为100％，99.24％，98.01％，93.06％，91.62％，78.41％。
实施例2甘草甜素对A549细胞的毒性实验
包括以下步骤：
1、接种A549细胞：用含5％胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液，以每孔2000～3000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100μl。
2、培养A549细胞：在37℃，5％CO2培养条件下，培养1天。
3、加入甘草甜素：吸弃每个孔中的DMEM培养基，向各个孔中加入100μl用含5％胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度(10μM，25μM，50μM，100μM，200μM)的甘草甜素(GA)，对照孔加入不含药物的5％胎牛血清的DMEM培养基100μl。
4、呈色：培养24小时后，每孔加MTT溶液10μl，在37℃，5％CO2培养条件下继续孵育4小时，然后终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
5、测光吸收值：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果见表2。
表2不同浓度的甘草甜素对A549细胞的毒性实验
实验结果见图2，由图2甘草甜素对A549的细胞毒性实验可知，在0μM，10μM，25μM，50μM，100μM，200μM甘草甜素浓度下，A549细胞的平均存活率分别为100％，96.91％，95.26％，95.06％，90.74％，77.36％。
实施例3 18β-甘草次酸对A549细胞的毒性实验
包括以下步骤：
1、接种A549细胞：用含5％胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液，以每孔2000～3000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100μl。
2、培养A549细胞：在37℃，5％CO2培养条件下，培养1天。
3、加入18β-甘草次酸：吸弃每个孔中的DMEM培养基，向各个孔中加入100μl用含5％胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度(10μM，25μM，50μM，100μM，200μM)的18β-甘草次酸(18β-GRA)，对照孔加入不含药物的5％胎牛血清的DMEM培养基100μl。
4、呈色：培养24小时后，每孔加MTT溶液10μl，在37℃，5％CO2培养条件下继续孵育4小时，然后终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
5、测光吸收值：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果见表3。
表3不同浓度的18β-甘草次酸对A549细胞的毒性实验
实验结果见图3。由图3可知，在0μM，10μM，25μM，50μM，100μM，200μM 18β-甘草次酸浓度下，A549细胞的平均存活率分别为100％，97.32％，96.50％，95.06％，90.43％，79.32％％。
实施例4甘珀酸对ZIKV感染A549细胞的抑制作用
ZIKV MOI＝1感染A549细胞，实验步骤如下：
1、种植细胞：在24孔细胞培养板中接种A549细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80～90％)，吸出培养基，接入病毒样品100μl，37℃吸附1小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。不加或加入用含5％胎牛血清的DMEM培养基稀释的指定浓度(25μM，50μM)的甘珀酸，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24小时，收集各个孔中的上清，再根据空斑试验检测病毒滴度。
表4不同浓度的甘珀酸对ZIKV感染A549细胞的抑制实验
2、空斑试验：
采用ZIKV敏感的A549细胞进行空斑试验，即把A549细胞接种于12孔板，24h后依次接种400μl含2％FBS培养基10倍稀释的ZIKV上清液，稀释度为10-1～10-10，每个稀释度2个副孔，置于37℃，5％CO2培养箱培养吸附1h，然后加入600μl甲基纤维素覆盖液(含2％胎牛血清的DMEM)，37℃，5％CO2培养箱培养，4～5天左右观察结果。
实验结果见图4。由图4甘珀酸对ZIKV感染A549细胞的抑制作用可知，在0μM，25μM，50μM浓度的甘珀酸下，甘珀酸对ZIKV的抑制率分别为0％，99.95％，99.99％。
实施例5甘珀酸对ZIKV感染Vero细胞的抑制作用
ZIKV MOI＝1感染Vero细胞，实验步骤如下：
1、种植细胞：在24孔细胞培养板中接种Vero细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80～90％)，吸出培养基，接入病毒样品100μl，37℃吸附1小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。不加或加入用含5％胎牛血清的DMEM培养基稀释的指定浓度(25μM，50μM)的甘珀酸，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24小时，收集各个孔中的上清，再根据空斑试验检测病毒滴度。
表5不同浓度的甘珀酸对ZIKV感染Vero细胞的抑制实验
2、空斑试验：
采用ZIKV敏感的Vero细胞进行空斑试验，即把Vero细胞接种于12孔板，24h后依次接种400μl含2％FBS培养基10倍稀释的ZIKV上清液，稀释度为10-1～10-10，每个稀释度2个副孔，置于37℃，5％CO2培养箱培养吸附1h，然后加入600μl甲基纤维素覆盖液(含2％胎牛血清的DMEM)，37℃，5％CO2培养箱培养，4～5天左右观察结果。
实验结果见图5。由图5甘珀酸对ZIKV感染Vero细胞的抑制作用可知，在0μM，25μM，50μM的浓度下，甘珀酸对ZIKV的抑制率分别为0％，99.94％，99.99％。
实施例6甘草甜素对ZIKV感染A549细胞的抑制作用
ZIKV MOI＝1感染A549细胞，实验步骤如下：
1、种植细胞：在24孔细胞培养板中接种A549细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80～90％)，吸出培养基，接入病毒样品100μl，37℃吸附1小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。不加或加入用含5％胎牛血清的DMEM培养基稀释的指定浓度(25μM，50μM)的甘草甜素，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24小时，收集各个孔中的上清，再根据空斑试验检测病毒滴度。
表6不同浓度的甘草甜素对ZIKV感染A549细胞的抑制实验
2、空斑试验：
采用ZIKV敏感的Vero细胞进行空斑试验，即把Vero细胞接种于12孔板，24h后依次接种400μl含2％FBS培养基10倍稀释的ZIKV上清液，稀释度为10-1～10-10，每个稀释度2个副孔，置于37℃，5％CO2培养箱培养吸附1h，然后加入600μl甲基纤维素覆盖液(含2％胎牛血清的DMEM)，37℃，5％CO2培养箱培养，4～5天左右观察结果。
实验结果见图6。由图6甘草甜素对ZIKV感染A549细胞的抑制作用可知，在0μM，25μM，50μM浓度的甘草甜素下，甘草甜素对ZIKV的抑制率分别为0％，93.30％，99.59％。
实施例7 18β-甘草次酸对ZIKV感染A549细胞的抑制作用
ZIKV MOI＝1感染A549细胞，实验步骤如下：
1、种植细胞：在24孔细胞培养板中接种A549细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80～90％)，吸出培养基，接入病毒样品100μl，37℃吸附1小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。不加或加入用含5％胎牛血清的DMEM培养基稀释的指定浓度(25μM，50μM)的18β-甘草次酸，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24小时，收集各个孔中的上清，再根据空斑试验检测病毒滴度。
表7不同浓度的18β-甘草次酸对ZIKV感染A549细胞的抑制实验
2、空斑试验：
采用ZIKV敏感的A549细胞进行空斑试验，即把A549细胞接种于12孔板，24h后依次接种400μl含2％FBS培养基10倍稀释的ZIKV上清液，稀释度为10-1～10-10，每个稀释度2个副孔，置于37℃，5％CO2培养箱培养吸附1h，然后加入600μl甲基纤维素覆盖液(含2％胎牛血清的DMEM)，37℃，5％CO2培养箱培养，4～5天左右观察结果。
实验结果见图7。由图7 18β-甘草次酸对ZIKV感染A549细胞的抑制作用可知，在0μM，25μM，50μM浓度的18β-甘草次酸下，18β-甘草次酸对ZIKV的抑制率分别为0％，93.03％，99.58％。
实施例8甘珀酸对ZIKV的直接杀伤作用
实验步骤如下：
1、将甘珀酸(50μM)与ZIKV病毒液直接混合，于37℃，5％CO2的培养箱中分别放置1h、6h、12h，再根据空斑试验检测病毒残留的滴度。
表8甘珀酸(50μM)对ZIKV的直接杀伤作用
2、空斑试验：
采用ZIKV敏感的Vero细胞进行空斑试验，即把Vero细胞接种于12孔板，24h后依次接种400μl含2％FBS培养基10倍稀释的ZIKV上清液，稀释度为10-1～10-10，每个稀释度2个副孔，置于37℃，5％CO2培养箱培养吸附1h，然后加入600μl甲基纤维素覆盖液(含2％胎牛血清的DMEM)，37℃，5％CO2培养箱培养，4～5天左右观察结果。
实验结果见图8。由图8甘珀酸(50μM)对ZIKV的直接抑制作用可知，在1h、6h、12h的作用时间下，甘珀酸对ZIKV的抑制率分别为59.34％，72.87％，80.44％。
实施例9甘珀酸显著降低ZIKV感染乳鼠的死亡率和疾病评分
一、寨卡感染的乳鼠模型的构建，实验步骤如下：
1.选择乳鼠年龄为1-2天的Balb/c窝鼠(母鼠与乳鼠在同一窝)，给乳鼠腹腔接种50ul/只ZIKV(1×105PFU/ml)，给药组在接种病毒后第2天，每隔两天给乳鼠注射5mg/kg或者10mg/kg的CBX进行治疗，健康组乳鼠注射相应剂量的1×PBS。
2.每天观察乳鼠的发病情况，称重，记录疾病评分和生存率。根据乳鼠在感染8、10、12和14天后的发病情况统计疾病评分，评分标准为：0分代表无疾病表现；1分代表后肢无力或行走姿势异常；3分代表后肢瘫痪；4分代表四肢都瘫痪；5分代表死亡。
3.解剖感染第10天的乳鼠脑，比较不同组之间乳鼠脑的形态及脑组织重量。
4.乳鼠的发病高峰期在感染后的第8天左右开始出现后肢瘫痪的症状，发育迟缓，头部较小，损伤严重。因此，该模型适用于研究ZIKV感染导致的新生儿神经系统损伤。
表9实验乳鼠模型实验分组
实验结果见图9，通过统计给药组和感染组乳鼠的生存率发现，感染组的乳鼠从感染第10天开始出现死亡的情况，到感染18天后乳鼠全部死亡，而给药组乳鼠的死亡时间明显晚于不给药组，直到感染的28天后，给药组乳鼠的存活率能达到56％(5mg/kg给药组)和70％(10mg/kg给药组)(图9A)。
本实验还统计了各组乳鼠的疾病评分状况，根据乳鼠发病表现比如行动迟缓、行走姿势异常以及四肢瘫痪等症状进行系统评分，发现给药组的乳鼠疾病评分情况明显比感染组乳鼠低，并且CBX治疗后，能够非常有效的控制乳鼠的发病情况，10mg/kg CBX处理组甚至能将疾病评分控制在1分以下(图9B)。
由于ZIKV感染会导致严重的小头畸形，因此我们进一步解剖了乳鼠的脑组织进行观察和称量，发现ZIKV感染后的乳鼠脑明显比Mock组乳鼠的脑轻，出现脑发育迟缓的现象，但CBX治疗组乳鼠的症状明显得到改善(图9C)。以上结果说明CBX能够有效地挽救ZIKV感染的乳鼠的生存率，并且控制疾病的进程。
