一种大鲵抗氧化肽及其制备方法
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种大鲵抗氧化肽及其制备方法。
背景技术
中国大鲵(Andrias davidianus)属于脊索动物门，两栖纲，素有“活化石”之称，现属于我国二类野生保护动物。大鲵肌肉蛋白富含18种氨基酸，必需氨基酸占总氨基酸44.08％，是一种富含多种氨基酸的优质动物蛋白，被誉为“水中人参”。农业部规定养殖大鲵可作为食物资源进行合理开发，随着人工繁殖和育苗等关键技术的突破，大鲵养殖逐渐规模化，大鲵资源出现供大于求的问题。除直接食用或进行粗加工外，对大鲵资源进行深度开发相对较少，利用大鲵肌肉开发研究活性肽产品几乎没有，因此制约了大鲵产业的发展。
为了促进大鲵产业的发展，大鲵资源的深入开发研究和高值化利用已成为必须解决的问题。湖北世厚耀榜纪田农业发展有限公司在专利CN107074901中公布了从大鲵骨提取的小分子肽及其提取方法。该专利是将大鲵清洗粉碎，获得大鲵骨，蒸煮获得大鲵骨汤；对大鲵骨汤进行磁化，依次向其加入第一酶制剂，第二酶制剂和第三酶制剂，获得酶解液；向其加入蛋白分离液，用酒精激活离心后的上清液，冷却离心分离得到大鲵小分子肽(80-1000Da)。但上述技术方案并未评价小分子肽的活性功能和鉴定所得多肽的氨基酸序列。
因此，研究大鲵抗氧化肽及其制备方法具有较长远的科学理论指导和较高的经济价值意义。
发明内容
本发明的目的在于：
为解决现有技术中对大鲵资源进行深度开发相对较少，利用大鲵肌肉开发研究活性肽产品几乎没有，导致大鲵资源被浪费的问题，提供一种大鲵抗氧化肽及其制备方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种大鲵抗氧化肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)大鲵肌肉组织捣碎和高温高压蒸煮处理；
(2)采用复合酶(中性蛋白酶和菠萝蛋白酶)酶解大鲵肌肉，得到酶解产物；
(3)微滤和超滤去除酶解液中未通过的大分子物质；
(4)将滤液依次经过葡萄糖凝胶G-50和G-25进行二次分离纯化；
(5)将(4)中滤液经反相高效液相色谱层析RP-HPLC分离纯化，冷冻干燥。
(6)将上述纯化得到的组分采用LC-MS/MS鉴定其氨基酸序列。
其中，步骤(1)具体为：以人工养殖大鲵肌肉为原料，用组织捣碎机搅打成肉糜后，经高温高压对肌肉蛋白组织进行熟化处理。熟化处理条件为121℃高温高压处理10min。
步骤(2)具体为：将熟化的物料冷却至50℃，加入复合蛋白酶对其进行酶解。
其中，所述的酶解条件为料液比1:4，酶解温度50℃，自然pH，酶添加量2000～4000U/g(以鲜肉质量计)，复合酶比例(中性蛋白酶:菠萝蛋白酶)1:1～1:4，酶解4～8h后，煮沸(100℃)灭酶15min后冷却至室温。5000～10000r/min离心10～15min，取上层清液，得酶解液。
步骤(3)具体为：上述酶解液经过两次微滤处理(0.45μm和0.22μm)收集滤液，再进行超滤。经0.3kDa,2kDa,5kDa及20kDa不同分子量的卷式聚砜超滤膜进行超滤，对分离获得的不同分子量的组分进行抗氧化活性测定，将抗氧化活性强的0.3kDa～2kDa组分收集，冷冻干燥待用；
步骤(4)具体为：将步骤(3)得到的抗氧化活性最强的组分经二次凝胶色谱层析柱分离。首先选用凝胶柱规格为1.6×70cm，凝胶介质为Sephadex G-50，样品溶液浓度20mg/mL，以去离子水作为洗脱液，控制流速1.2～1.5mL/min，通过自动部分收集器分管收集，每5min收集一管，每管约4mL，共96管，分别测每管的A280nm值，得到含有3个峰值的洗脱曲线，代表3个组分，合并峰值对应的洗脱液，冷冻干燥。通过DPPH自由基清除实验检测和比较，确定抗氧化活性最强组分。将抗氧化性最强的组分再采用凝胶介质为Sephadex G-25的凝胶柱进行二次分离纯化，样品溶液浓度20mg/mL，以去离子水作为洗脱液，控制流速1.2～1.5mL/min，通过自动部分收集器分管收集，每5min收集一管，每管约4mL，共96管，分别测每管的A280nm值，得到含有3个峰值的洗脱曲线，合并峰值对应的洗脱液，分别测定3个组分的DPPH自由基清除能力；收集清除自由基能力最强的洗脱液组分，冷冻干燥待用；
步骤(5)具体为：将上述层析处理后抗氧化活性最高的组分经反相高效液相色谱层析RP-HPLC进一步分离纯化，所用色谱柱为Spursil C18-EP，进样体积15μL，流速为0.5mL/min，梯度洗脱条件如下：
其中流动相A：水/乙腈(95/5,v/v)，流动相B：乙腈/水/三氯乙酸为(70/30/0.1,v/v)
步骤(6)具体：为将上述纯化得到的组分采用LC-MS/MS鉴定其氨基酸序列，色谱柱采用ACQUITY UPLCTM BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)。离子化方式ESI+，质荷比(离子质量与电荷的比值，m/z)采集范围200～1000m/z，扫描速度4000Da/s，MS级数二级。样品的预处理条件为溶解在流动相B缓冲液(80％ACN-20％H2O-0.1％TFA)，浓度2mg/mL，离心(10000r/min，10min)，脱盐过滤。本发明得到序列明确的大鲵抗氧化活性多肽，其氨基酸序列为Val-Pro-Val-Leu-Pro，其中的Val、Pro和Leu均为疏水性氨基酸，分子量为523.67Da。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明大鲵肌肉抗氧化肽具有较高的安全性、抗氧化活性强和易于吸收等优点，可以作为食品、药品及保健品的原辅料使用，使大鲵资源得到了充分的开发和利用，为产业的发展提供了有效保障，具有较长远的科学理论指导意义和较高的经济价值意义。
本发明得到序列明确的大鲵抗氧化活性多肽，其氨基酸序列为Val-Pro-Val-Leu-Pro，其中的Val、Pro和Leu全为疏水性氨基酸，分子量为523.67Da，为食品抗氧化肽的鉴定提供理论依据，填补了目前没有利用大鲵肌肉开发研究活性肽产品的空白，克服了该技术难关。
附图标记说明
图1为多肽序列Val-Pro-Val-Leu-Pro的抗氧化肽分子结构式；
图2为多肽序列Pro-Ser-Phe的抗氧化肽分子结构式；
图3为多肽序列Leu-Glu-Leu的抗氧化肽分子结构式；
图4为多肽序列Leu-Ala-Glu的抗氧化肽分子结构式。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
(1)酶解：以人工养殖大鲵肌肉为原料，先切成5×5cm的小块，再用组织捣碎搅机打成肉糜，按1:4料液比加入纯净水于121℃的高温高压下蒸煮10min，肌肉蛋白组织熟化结束后冷却至50℃，自然pH，复合酶添加量为2000U/g(以鲜肉质量计)，复合酶比例为1:1(中性蛋白酶添加量1000U/g，菠萝蛋白酶添加量1000U/g)，置于50℃水浴锅中搅拌保温4h后，沸水(100℃)灭酶15min，5000r/min于离心机中离心10min，取上层清液，得酶解液。
(2)超滤：将制备的大鲵肌肉酶解液经0.3kDa,2kDa,5kDa及20kDa不同分子量的卷式聚砜超滤膜进行超滤得到5个组分。在2mg/mL浓度下，0.3kDa～2kDa的DPPH自由基清除率为96.42％，高于其他超滤组分，将该组分冷冻干燥待用。
(3)二次凝胶色谱凝胶柱分离：将冷冻后样品溶解后上样到凝胶色谱层析柱SephadexG-50，以去离子水作为洗脱液，控制流速1.5mL/min，每5min收集一管，每管约4mL，共96管，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱液得到3个组分，分别为F-1，F-2和F-3。其中40～55管的组分F-2有最高的DPPH自由基清除率，高达92.33％。F-2再采用Sephadex G-25凝胶进行二次分离纯化，洗脱条件与上述相同，收集洗脱液得到3个组分，分别为F-2-1,F-2-2和F-2-3，分别测定3个组分的DPPH自由基清除能力，组分F-2-1,F-2-2和F-2-3DPPH自由基清除分别为76.42％，84.33％和93.12％，将F-2-3(53～61管)冷冻干燥待用。
(4)反相高效液相色谱层析纯化：将F-2-3经反相高效液相色谱层析Spursil C18-EP进行分离纯化，流动相为5％-35％的乙腈梯度洗脱，进样体积15μL，流速为0.5mL/min，于220nm处检测样品出峰，收集样品峰，冷冻干燥，将出现的峰采用LC-MS/MS鉴定其氨基酸序列。
实施例2：
(1)酶解：以人工养殖大鲵肌肉为原料，先切成5×5cm的小块，用组织捣碎机搅打成肉糜，按1:4料液比加入纯净水于121℃的高温高压下蒸煮10min，肌肉蛋白组织熟化结束后冷却至50℃，自然pH，复合蛋白酶添加量为3000U/g(以鲜肉质量计)，复合酶比例为1:3(中性蛋白酶添加量750U/g，菠萝蛋白酶添加量2250U/g)，置于50℃水浴锅中搅拌保温6h后，沸水(100℃)灭酶15min，8000r/min于离心机中离心12min，取上层清液，得酶解液。
(2)超滤：将制备的大鲵肌肉酶解液经0.3kDa,2kDa,5kDa及20kDa不同分子量的卷式聚砜超滤膜进行超滤得到5个组分。在2mg/mL浓度下，0.3kDa～2kDa的DPPH自由基清除率为94.21％，高于其他超滤组分。将该组分冷冻干燥待用。
(3)二次凝胶色谱凝胶柱分离：将冷冻后样品溶解后上样到凝胶色谱层析柱SephadexG-50，以去离子水作为洗脱液，控制流速1.3mL/min，每5min收集一管，每管约4mL，共96管，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱液得到3个组分，分别为F-1，F-2和F-3。其中43～53管的组分F-2有最高的DPPH自由基清除率，高达90.83％。将F-2再采用SephadexG-25凝胶进行二次分离纯化，洗脱条件与上述相同，收集洗脱液得到3个组分，分别为F-2-1,F-2-2和F-2-3，分别测定3个组分的DPPH自由基清除能力，组分F-2-1,F-2-2和F-2-3DPPH自由基清除分别为73.14％，85.27％和92.57％，将F-2-3(51～65管)冷冻干燥。
(4)反相高效液相色谱层析纯化：将F-2-3经反相高效液相色谱层析Spursil C18-EP进行分离纯化，流动相为5％-35％的乙腈梯度洗脱，进样体积15μL，流速为0.5mL/min，于220nm处检测样品出峰，收集样品峰，冷冻干燥，将出现的峰采用LC-MS/MS鉴定其氨基酸序列。
实施例3：
(1)酶解：以人工养殖大鲵肌肉为原料，先切成5×5cm的小块，用组织捣碎机搅打成肉糜，按1∶4料液比加入纯净水于121℃的高温高压下蒸煮10min，肌肉组织蛋白熟化结束后冷却至50℃，自然pH，复合酶添加量为4000U/g(以鲜肉质量计)，复合酶比例为1∶4(中性蛋白酶添加量800U/g，菠萝蛋白酶添加量3200U/g)，置于50℃水浴锅中搅拌保温8h后，沸水(100℃)灭酶10min，10000r/min于离心机中离心15min，取上层清液，得酶解液。
(2)超滤：将制备的大鲵肌肉酶解液经0.3kDa，2kDa，5kDa及20kDa不同分子量的卷式聚砜超滤膜进行超滤得到5个组分。在2mg/mL浓度下，0.3kDa～2kDa的DPPH自由基清除率为95.06％，高于其他超滤组分。将该组分冷冻干燥待用。
(3)二次凝胶色谱凝胶柱分离：将冷冻后样品溶解后上样到凝胶色谱层析柱Sephadex G-50，以去离子水作为洗脱液，控制流速1.2mL/min，每5min收集一管，每管约4mL，共96管，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱液得到3个组分，分别为F-1，F-2和F-3。其中42～52管的组分F-2有最高的DPPH自由基清除率，高达91.27％。将F-2再采用SephadexG-25凝胶进行二次分离纯化，洗脱条件与上述相同，收集洗脱液得到3个组分，分别为F-2-1，F-2-2和F-2-3，分别测定3个组分的DPPH自由基清除能力，组分F-2-1，F-2-2和F-2-3DPPH自由基清除分别为69.89％，82.13％和91.79％，将F-2-3(55～68管)冷冻干燥。
(4)反相高效液相色谱层析纯化：将抗氧化活性强组分F-2-3经反相高效液相色谱层析Spursil C18-Ep进行分离纯化，流动相为5％-35％的乙腈梯度洗脱，进样体积15μL，流速为0.5mL/min，于220nm处检测样品出峰，收集样品峰，冷冻干燥，将出现的峰采用LC-MS/MS鉴定其氨基酸序列。
优选地，通过本发明的技术方案，在实验实测中共分离得到了包括本发明的抗氧化肽在内的4条抗氧化肽，经计算，其多肽序列结构特性参数如表1所示：
表1多肽序列结构特性参数
其中，序列VPVLP中Val、Pro和Leu全为疏水性氨基酸；序列PSF中Pro为疏水性氨基酸，位于中间的Ser为亲水性氨基酸，Phe为芳香族氨基酸；序列LEL中疏水性氨基酸Leu位于两端，亲水性氨基酸Glu位于中间；序列LAE中Leu和Ala为疏水性氨基酸，Glu为亲水性氨基酸，PI值和MW值较低。
上述4条抗氧化肽的化学分子结构式如图1-图4所示。
研究表明，疏水性氨基酸不仅本身具有一定的抗氧化活性，而且由疏水性氨基酸组成的肽类往往具有更强的抗氧化活性，带有芳香族氨基酸的多肽可显著提高抗氧化能力和较强的ACE抑制活性。在已有的抗氧化性验证试验中，发现纯化肽与合成肽对DPPH自由基清除率分别为80.52±0.67％和81.44±0.43％，均表现出良好的抗氧化活性。因此，许多研究表明分子量较低的小肽(500Da以下)具有更显著的功能话性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
