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一种铂类化疗药物对心肌损伤程度的评价方法

2021-03-11 23:50:58

一种铂类化疗药物对心肌损伤程度的评价方法

  技术领域

  本发明属于铂类化疗药物的心肌毒性研究领域,具体涉及一种铂类化疗药物对心肌损伤程度的评价方法。

  背景技术

  化疗药物存在很多不良反应,如可引起肝肾、心脏、肺的不同程度的损害等,其中心肌毒性是肿瘤化疗中的常见并发症,心脏损害可表现为心电活动的异常、肢体导联低电压、心肌病变及心功能变化等。化疗药物均对心脏有不同程度的损害,其中以蒽环类抗肿瘤药(阿霉素、表阿霉素)对心脏的损伤程度最严重,既往的化疗药物心肌毒性研究也主要集中于这类药物,同时也有心脏毒性保护剂上市,右丙亚胺、磷酸肌酸钠、7-羟乙基芦丁等是治疗蒽环类抗肿瘤药物心肌毒性的药物。60年代顺铂的抗癌活性被发现以来,铂类药物在抗癌中的研究与应用得到了迅速的发展,铂类已成为许多恶性肿瘤化疗中不可或缺的药物。目前广泛应用的奥沙利铂属于第3代铂类药物,最显著的特点是不产生交叉性耐药,是铂类药物中对癌细胞杀伤作用最强的药物。

  奥沙利铂诱导肿瘤细胞的凋亡是通过损伤其DNA、抑制DNA和RNA 合成及触发机体的免疫学反应来完成。奥沙利铂在细胞内通过其代谢产物与 DNA交联,形成DNA复合物,进而终止肿瘤细胞的复制,导致细胞凋亡,称为是治疗大肠癌最有希望的抗肿瘤新药,尤其是对大肠癌细胞株及顺铂耐药的细胞株有显著的抑制作用。与卡培他滨及5-FU合用有明显的协同作用。同时对卵巢癌、淋巴瘤、非小细胞肺癌、头颈部肿瘤也有比较客观的疗效。

  奥沙利铂的主要不良反应为神经毒性反应、胃肠道反应、造血系统毒性、过敏反应,无明显耳毒性和肝、肾毒性等。奥沙利铂的剂量限制性反应是神经系统毒性反应,主要表现在外周感觉神经,如肢体末端感觉障碍或/ 和感觉异常。而关于奥沙利铂心肌毒性反应研究并不多,近年国际及国内文献报导奥沙利铂化疗可见部分心肌损害的病例,主要表现为心律失常及T波改变,发生率可达6.5%。也有文献报导发现铂类化疗的多器官毒性,包括心肌毒性。既往铂类药物治疗的不良反应研究多集中于神经毒性,造血系统毒性,而心肌毒性目前研究尚少,更是缺少一种成熟的评价奥沙利铂化疗药物心肌毒性的方法。

  发明内容

  本发明是为了克服现有技术中存在的缺点而提出的,其目的是提供一种铂类化疗药物对心肌损伤程度的评价方法。

  本发明是通过以下技术方案实现的:

  一种铂类化疗药物对心肌损伤程度的评价方法,包括以下步骤:

  (Ⅰ)建立奥沙利铂心肌毒性模型

  (ⅰ)选取实验动物,建立实验分组

  选取一定数量体重均一的小鼠,随机均分为4组,正常对照组、奥沙利铂组、奥沙利铂联合氟尿嘧啶组和氟尿嘧啶组,统一饲养,自由进食水,12 小时昼夜更替,适应性饲养一周后开始动物实验;

  (ⅱ)进行动物实验

  对正常对照组、奥沙利铂组、奥沙利铂联合氟尿嘧啶组和氟尿嘧啶组对应给药,建立模型;

  (Ⅱ)体重监测

  在进行动物实验的同时监测各组动物模型的体重变化;

  (Ⅲ)观察心肌结构的改变

  取动物实验后的各组小鼠的心脏组织制作石蜡切片并进行HE染色然后,观察各组小鼠的心肌结构;

  (Ⅳ)检测血清心肌损伤标志物的改变

  对各组模型小鼠血清中的CKMB、TNI、pro-BNP进行ELISA检测;

  (Ⅴ)检测心电图的改变

  对动物实验结束后的模型进行体表心电图的描记;

  (Ⅵ)检测超声心动图的改变

  对动物实验结束后的模型进行心脏超声的评价;

  (Ⅶ)检测线粒体结构与功能的改变

  分离各组模型小鼠的心肌线粒体,对线粒体进行电镜观察、膜电位的检测和ATP含量的测定,并对比各组心肌线粒体融合-分裂蛋白目的基因的表达以及心肌线粒体融合-分裂蛋白的表达;

  在上述技术方案中,所述步骤(ⅱ)进行动物实验时,以奥沙利铂6mg/kg 腹腔注射,每周2次,连续2周给药奥沙利铂组、奥沙利铂联合氟尿嘧啶组建立奥沙利铂心肌毒性模型;以氟尿嘧啶25mg/kg剂量在奥沙利铂注射第2 天腹腔注射奥沙利铂联合氟尿嘧啶组,每周2次,建立联合心脏毒性模型;以氟尿嘧啶25mg/kg剂量每周2次,连续2周给药氟尿嘧啶组建立氟尿嘧啶单药组模型。

  在上述技术方案中,所述石蜡切片HE染色的方法具体为:

  (ⅰ)取材和固定

  将小白鼠麻醉,快速打开腹腔及胸腔,剪取心脏,将取下的心脏组织迅速投入PBS液中使心脏泵出残余血液,将心脏投入10%多聚甲醛中固定时间为数小时至24小时;

  (ⅱ)制作切片

  经冲洗,脱水,透明,浸蜡,包埋,切片,贴片等过程制成切片。

  (ⅲ)HE染色

  经脱蜡,复水,染色,脱水,透明,封藏步骤进行HE染色。

  在上述技术方案中,所述CKMB、BNP、TNI的ELISA检测方法具体为:

  (ⅰ)将标准品工作液依次加入到前两列孔中,每个浓度的工作液并列加两孔,每孔100μL,待测样品加入到其他孔,每孔100μL,给酶标板覆膜, 37℃孵育90分钟;

  (ⅱ)弃去液体,甩干,不洗涤,每个孔中加入生物素化抗体工作液 100μL,混匀,酶标板加上覆膜,37℃温育1小时;

  (ⅲ)甩尽孔内液体,每孔加洗涤液350μL,浸泡1~2分钟,吸去或甩掉酶标板内的液体,在厚的吸水纸上拍干,重复此洗板步骤3次;

  (ⅳ)每孔加酶结合物工作液100μL,加上覆膜,37℃温育30分钟;

  (ⅴ)弃去孔内液体,甩干,洗板5次,方法同步骤(ⅲ);

  (ⅵ)每孔加90μL底物溶液,酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟;

  (ⅶ)每孔加终止液50μL,终止反应;

  (ⅷ)立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度;

  (ⅸ)计算每组复孔的平均OD值,绘出四参数逻辑函数的标准曲线。

  在上述技术方案中,所述对小鼠体表心电图的描记具体方法为:

  (ⅰ)麻醉

  按照5%水合氯醛按照6ml/kg的剂量腹腔注射,麻醉小鼠;

  (ⅱ)二导联电极连接:

  将小鼠仰面置于平板上,把红色电极和黄色电极分别刺入右上肢、左下肢皮下;

  (ⅲ)采集图像

  打开LabChart7.2生物信息采集系统,选择生物种类“mice”,进入信息采集通道1,设置相关参数:振幅10mv,放大比例2:1,采集速率1K/s;待图形稳定,记录30s,停止记录,保存图像。

  在上述技术方案中,所述对动物实验结束后的模型进行心脏超声的评价的具体方法为:

  (ⅰ)麻醉

  按照5%水合氯醛按照6ml/kg的剂量腹腔注射,麻醉小鼠;

  (ⅱ)备皮

  在小鼠胸前抹适量脱毛膏,放置3分钟后用纸巾即可褪去胸前鼠毛;

  (ⅲ)固定

  将小鼠与水平倾斜15度仰面固定于动物台,并确保四肢与电极接触良好,把心脏超声探头固定在左室长轴方向,调整探头位置,使左室长轴超声图像清晰;

  (ⅳ)采集图像

  使用vevo小动物高分辨率超声检测系统采集图像,测量左室收缩、舒张末期内径及前后壁厚度等数据。

  本发明的有益效果是:

  本发明提供了一种铂类化疗药物对心肌损伤程度的评价方法,具体为基于小鼠模型的奥沙利铂对于心肌损伤程度的评价方法。本发明建立奥沙利铂化疗心肌损伤小鼠模型来研究三代铂类药物的代表药物奥沙利铂的心脏毒性,能够为奥沙利铂在临床应用中心脏毒性的防治策略奠定基础,亦为后续奥沙利铂心脏毒性保护制剂的研究提供理论依据。

  附图说明

  图1是本发明实施例1中各组小鼠模型体重随给药时间的体重变化数据图;

  图2是本发明实施例1中各组小鼠模型小鼠心肌HE染色图(200X);

  图3是本发明实施例1中化疗后各组小鼠血清心肌损伤标志物变化的柱状图;

  图4是本发明实施例1中化疗干预后各组小鼠心电图的变化对比图(心电图放大比例2:1采样率1K/s);

  图5是本发明实施例1中化疗干预后各组小鼠的心脏超声图像;

  图6是本发明实施例1中化疗干预后各组小鼠的心脏超声相关参数的变化图;

  图7是本发明实施例1中各组小鼠化疗干预后心肌线粒体结构的电镜图;

  图8是本发明实施例1中各组小鼠心肌线粒体膜电位以及ATP含量的柱状图;

  图9是本发明实施例1中各组小鼠心肌线粒体融合-分裂蛋白目的基因的表达的柱状图;

  图10是本发明实施例1中各组小鼠心肌线粒体融合-分裂蛋白的表达;

  图11是本发明实施例1中各组小鼠心肌线粒体融合-分裂蛋白的表达的柱状图。

  其中:

  Control:对照组;

  OXL:奥沙利铂单药组;

  OXL+5FU:奥沙利铂和5-氟尿嘧啶联合组;

  5FU:氟尿嘧啶单药组。

  具体实施方式

  为了使本技术领域的人员更好地理解本发明技术方案,下面结合说明书附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明一种铂类化疗药物对心肌损伤程度的评价方法的技术方案。

  实施例1

  一种铂类化疗药物对心肌损伤程度的评价方法,包括以下步骤:

  (Ⅰ)建立奥沙利铂心肌毒性模型

  (ⅰ)选取实验动物,建立实验分组

  实验动物均购自北京维通利华实验动物技术公司,动物许可证号:SCXK (京)2016-0006。选取8周龄ICR小鼠32只,体重20±2g,随机均分为4 组:正常对照组(Control)、奥沙利铂组(OXL)、奥沙利铂联合氟尿嘧啶组 (OXL+5FU)、氟尿嘧啶组(5FU)。所有实验小鼠均统一饲养于天津市人民医院动物实验中心,自由进食水,12小时昼夜更替。适应性饲养一周后开始动物实验。

  (ⅱ)进行动物实验

  以奥沙利铂6mg/kg腹腔注射,每周2次,连续2周给药奥沙利铂组 (OXL)、奥沙利铂联合氟尿嘧啶组(OXL+5FU)建立奥沙利铂心肌毒性模型。以氟尿嘧啶25mg/kg剂量在奥沙利铂注射第2天腹腔注射给奥沙利铂联合氟尿嘧啶组(OXL+5FU),每周2次,建立联合心脏毒性模型,以氟尿嘧啶25mg/kg剂量每周2次,连续2周给药氟尿嘧啶组(5FU),建立氟尿嘧啶单药组模型。

  奥沙利铂和氟尿嘧啶的注射剂量根据《实验动物学·第2版》中人与动物换算公式计算得出。

  奥沙利铂临床中的应用剂量(按说明书)为130mg/m2。以身高174cm,体重70Kg的男性为标准,其体表面积为1.88m2,用药量为244.4mg。按照《实验动物学·第二版》中人与小鼠剂量换算比例知小鼠与人的体表面积比为1:387.9,通过计算得到小鼠奥沙利铂的用药剂量31.5mg/Kg。预实验的过程中,我们通过单次给药、连续给药、间隔给药的方式探索奥沙利铂化疗模型建立所需的最佳剂量。由于奥沙利铂具有很强的神经毒性,给药剂量过大则会出现小鼠四肢乏力、行动迟缓,进食水困难导致体重过轻,最后死亡。相反,给药剂量过小,虽然小鼠存活率很高,但是难以观测到奥沙利铂化疗小鼠的心脏毒性。经过不断的摸索以及借鉴Soichiro建模的方法,最终利用低剂量间隔给药(6mg/Kg腹腔注射,一周两次,连续两周)的方式顺利建立奥沙利铂化疗小鼠模型。

  (Ⅱ)体重监测

  在进行动物实验的同时监测各组动物模型的体重变化;

  从图1中可以看出,相较于Control组,OXL组、OXL+5FU组、FU组小鼠的体重随化疗的进行而减轻(P<0.05),特别是OXL+5FU组小鼠的体重下降最明显,下降幅度最大。

  (Ⅲ)观察心肌结构的改变

  取动物实验后的各组小鼠的心脏组织制作石蜡切片并进行HE然后,观察各组小鼠的心肌结构;

  石蜡切片的具体制作方法为:

  1.取材和固定:将小白鼠麻醉,快速打开腹腔及胸腔,剪取心脏。然后,将取下的心脏组织迅速投入PBS液中使心脏泵出残余血液。然后将心脏投入10%多聚甲醛中固定时间为数小时至24小时。

  2.制作切片:经冲洗,脱水,透明,浸蜡,包埋,切片,贴片等过程制成切片。

  3.HE染色:经脱蜡,复水,染色,脱水,透明,封藏等步骤进行HE 染色。

  图2是小鼠左心室心肌HE染色。Control组心肌纤维细胞排列整齐,胞核居中,横纹清楚,细胞膜完整,间质无异常渗出;OXL组和5FU组,与 Control组比较无明显差异;OXL+5FU组较Control组心肌纤维间隙略增大,部分心肌纤维化排列不规整,部分间质有炎性浸润。

  (Ⅳ)检测血清心肌损伤标志物的改变

  对各组模型小鼠血清中的CKMB、TNI、pro-BNP进行ELISA检测;

  CKMB、BNP、TNI的ELISA检测方法具体为:

  一、检测前准备:

  1.提前20分钟从冰箱中取出相关试剂并平衡至室温。读数前15分钟打开酶标仪预热。

  2.洗涤液:将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:24)。

  3.将标准品/样品稀释液1mL加入标准品中,室温静置10分钟,上下颠倒数次,待其充分溶解后,轻轻混匀,配成5000pg/mL的标准品工作液。然后根据以下浓度:5000,2500,1250,625,312.5,156.25,78.13,0pg/mL进行倍比稀释。

  4.生物素化抗体工作液:实验前计算实验所需用量(以100μL/孔计算),实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟,以生物素化抗体稀释液将100×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作浓度。

  5.酶结合物工作液:实验前计算当次实验所需用量(以100μL/孔计算),实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟,以酶结合物稀释液将100×浓缩HRP酶结合物稀释成1×工作浓度。

  二、具体检测操作步骤:

  1.将标准品工作液依次加入到前两列孔中,每个浓度的工作液并列加两孔,每孔100μL。待测样品加入到其他孔,每孔100μL(若样本浓度高于检测范围,需用标准品/样本稀释液稀释后取样)。给酶标板覆膜,37℃孵育90 分钟。

  2.弃去液体,甩干,不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL,混匀,酶标板加上覆膜,37℃温育1小时。

  3.甩尽孔内液体,每孔加洗涤液350μL,浸泡1-2分钟,吸去或甩掉酶标板内的液体,在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。

  4.每孔加酶结合物工作液100μL,加上覆膜,37℃温育30分钟。

  5.弃去孔内液体,甩干,洗板5次,方法同步骤3。

  6.每孔加90μL底物溶液(TMB),酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右。根据实际显色情况酌情缩短或延长,但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时,即可终止。

  7.每孔加终止液50μL,终止反应。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

  8.立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。

  9.计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的 OD值作为矫正值。以浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。

  图3所示为化疗后小鼠血清心肌损伤标志物的变化。与Control组相比, OXL组、5FU组、OXL+5FU组的血清CKMB、TNI、pro-BNP水平均有显著性升高(P<0.05),且OXL+5FU组的血清CKMB、TNI、pro-BNP水平均显著高于OXL组和5FU组(P<0.05)。

  (Ⅴ)检测心电图的改变

  对动物实验结束后的模型进行体表心电图的描记;

  对小鼠体表心电图的描记具体方法为:

  1.麻醉:按照5%水合氯醛按照6ml/kg的剂量腹腔注射,麻醉小鼠。

  2.二导联电极连接:将小鼠仰面置于平板上,把红色电极(NEG)和黄色电极(POS)分别刺入右上肢、左下肢皮下。

  3.采集图像:打开LabChart7.2生物信息采集系统,选择生物种类“mice”,进入信息采集通道1(CH1),设置相关参数“振幅10mv,放大比例2:1,采集速率1K/s”。待图形稳定,记录30s,停止记录,保存图像。

  图4为小鼠进行化疗干预后II导心电图的变化。每只小鼠均进行了心电图波形的记录,其中5FU组有1只小鼠出现了心律失常,OXL+5FU组有2 只小鼠出现了心律失常。心律失常主要表现为心率减慢和心律不齐。

  (Ⅵ)检测超声心动图的改变

  对动物实验结束后的模型进行心脏超声的评价;

  对小鼠心脏超声的评价的具体方法为:

  1.麻醉:按照5%水合氯醛按照6ml/kg的剂量腹腔注射,麻醉小鼠。

  2.备皮:在小鼠胸前抹适量脱毛膏,放置3分钟后用纸巾即可褪去胸前鼠毛。

  3.固定:将小鼠与水平倾斜15度仰面固定于动物台,并确保四肢与电极接触良好。把心脏超声探头固定在左室长轴方向,调整探头位置,使左室长轴超声图像清晰。

  4.采集图像:使用vevo小动物高分辨率超声检测系统采集图像,测量左室收缩/舒张末期内径及前后壁厚度等数据。

  图5为小鼠化疗干预后心脏超声的图像,图6为心脏超声相关参数的变化情况。OXL组、OXL+5FU组、5FU组的LVEF均较Control组有轻度降低(P<0.05),然而OXL组、OXL+5FU组、5FU组之间并无显著差异(P>0.05)。 OXL+5FU组的LVIDd、LVIDs、Lvmass均较Control组有显著性降低 (P<0.05)。

  (Ⅶ)检测线粒体结构与功能的改变

  分离各组模型小鼠的心肌线粒体,对线粒体进行电镜观察、膜电位的检测和ATP含量的测定,并对比各组心肌线粒体融合-分裂蛋白目的基因的表达以及心肌线粒体融合-分裂蛋白的表达;

  一、线粒体电镜:

  小鼠开胸后,迅速取出心脏,将左心室心肌切成1×1×1毫米的组织小块,立即投入预冷的2.5%戊二醛固定液中。从取出心脏到组织块投入固定液,整个过程时长保持在1分钟内最佳。将样本寄送上海诺辰生物技术公司处理。样本经戊二醛固定→二甲胂酸钠缓冲液洗涤→四氧化锇后固定→ddH2O 洗涤→梯度乙醇脱水→包埋→超薄切片→醋酸铀-枸橼酸铅双染色处理后在 JEM-1200EX透射电镜下观察拍片。

  二、线粒体膜电位的检测:

  1.JC-1工作液的准备:

  取50微升JC-1(200X)染色液和8000微升超纯水,充分溶解并混匀后,再加入2000微升染色缓冲液,即配制成JC-1(1X)检测工作液。检测线粒体膜电位前把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1染色缓冲液(1X)稀释5倍。

  2.阳性对照的准备:

  将CCCP(10mM)稀释成10μM,处理样本20分钟即可。

  a.于不透光的96孔板中,按照每10-100微克纯化的线粒体加入900微升JC-1(1X)检测工作液,充分混匀后待测。

  b.使用多功能酶标仪进行荧光检测。检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm,发射光设置为530nm;检测JC-1聚合物时,可以把激发光设置为525nm,发射光设置为590nm。

  三、ATP的测定:

  1.准备样品:每个样本取20毫克心肌组织,加入100微升裂解液,然后用玻璃匀浆器进行匀浆。充分匀浆以保证心肌组织被完全裂解。裂解后4℃ 12000g离心5分钟,取上清待测。

  2.准备标准曲线:

  冰盒上溶解ATP测定相关试剂,用ATP检测裂解液将标准溶液稀释成 0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10μM浓度梯度。实验测定中若ATP浓度过高或过低可适当调整该浓度梯度。

  3.检测工作液的配制:

  每个样品及标准品需至少配制100微升ATP检测工作液。将相关试剂在冰上溶解。取适量的ATP检测试剂,按照每100微升检测液加入900微升检测试剂稀释液的比例配制检测试剂工作液。ATP检测工作液可以置于冰盒中暂时保存。

  4.ATP浓度的测定:

  a.将100微升ATP检测工作液加入到不透光的96孔板内,室温静置5 分钟以消除96孔板内的ATP本底。

  b.每个检测孔加入20微升样品或标准品,迅速用微量移液枪混匀,间隔数秒后,用化学发光仪(luminometer)测定RLU值。

  四、蛋白浓度的测定:

  蛋白浓度的测定使用BCA蛋白测定试剂盒进行。具体步骤如下:

  1.配制工作液:根据标准品和样品数量,按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂(50:1)配制成BCA工作液,充分混匀(混合时可能会有浑浊,但混匀后就会消失)。BCA工作液室温24小时内稳定。

  2.稀释标准品:取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升(样品一般可用PBS稀释),使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20 微升加到96孔板的蛋白标准品孔中,加PBS补足至20微升。

  3.将样品作适当稀释(最好多做几个梯度,如作2倍、4倍、8倍稀释),加20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量样品时误差偏大,标准线前面的点可能不很准确,所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。

  4.各孔加入200微升BCA工作液,37℃放置15-30分钟。用酶标仪测定 A562nm,根据标准曲线计算出蛋白浓度。

  五、Western蛋白电泳:

  1.制样:从-80℃冰箱中取出相应组织样品放入冰盒,防止讲解。用Lysis buffer和5%巯基乙醇配制组织蛋白裂解液。将裂解液加入组织于冰上匀浆。匀浆后干式恒温器100℃加热5分钟使蛋白充分变性。4℃离心机13000转/ 分钟离心10分钟后取适量样本用酶标仪进行蛋白浓度测定。按照5X体系将loading buffer加入样本中。

  2.配胶:选取适宜厚度的玻璃板,组装电泳槽,用ddH2O验漏。根据不同蛋白分子量配制不同浓度的分离胶和浓缩胶。灌胶前加入TEMED并充分混匀。首先灌注下层分离胶,用ddH2O液封30分钟至分离线出现,从而使胶平面水平。倒掉液封的水,灌注上层浓缩胶,插入梳子,静置30分钟。

  3.加样:向两块玻璃板中间倒入电泳液(1X Running Buffer),拔去梳子,用微量移液枪吸取适量电泳液轻轻吹打加样孔。依次在各加样孔中加入彩色蛋白Marker或样品。

  4.电泳:正确组装电泳槽,确保正极对正极、负极对负极。向电泳槽内导入适量新鲜配制的电泳液,盖上电泳槽盖子。调整电压80V,开始电泳。电泳时间大概0.5~1.5小时,以溴酚蓝即将溢出分离胶为停止时间点。

  5.转膜:准备适当大小的PVDF膜,置入甲醇液中活化30秒。用塑胶铲轻轻撬开玻璃板,去除上层浓缩胶及多余的部分。将切好的胶放在用转膜液(1X Trans Buffer)润湿后的转膜夹上。按照“转膜夹黑面→海绵→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸→海绵→转膜夹白面”的顺序摆放。用玻璃棒轻轻排掉 FVDF膜和胶之间残留的气泡。转膜夹按照“黑面对黑面,白面对红面”的原则安装到电泳槽中。倒入适量新鲜配制的转膜液。电泳槽中放冰袋,电泳槽于4℃冰箱中110mA恒流转膜2.5~3小时。

  6.封闭:取出PVDF膜,在膜正面的右上角剪一缺口作为标记。根据样品蛋白分子量大小剪取适当大小的膜。将剪好的PVDF膜放入用5%脱脂牛奶配制好的封闭液中,正面朝上,于4℃摇床上孵育1小时。

  7.孵育一抗:用封闭液将一抗稀释成相应倍数,如1:5000,-20℃低温保存。将膜放入抗体孵育盒中,倒入适量复温的一抗,室温孵育1小时后转 4℃摇床孵育过夜。

  8.洗膜:回收一抗后,用PBST洗膜三次,每次10分钟。

  9.孵育二抗:将PVDF膜放入倒有二抗的孵育盒中,4℃摇床孵育1.5小时。

  10.洗膜:回收二抗后,用PBST洗膜三次,每次10分钟。

  11.显影:按照A液:B液1:1的比例配制适量发光液。将发光液均匀滴加到PVDF膜上,于凝胶成像系统上显影。

  六、引物引物合成:

  在GeneBank上查找相关目的基因的序列,用Primer软件设计引物后交由上海生工生物技术有限公司合成。

  Mfn1:

  上游引物:ATGGCAGAAACGGTATCTCCA

  下游引物:CTCGGATGCTATTCGATCAAGTT

  Mfn2:

  上游引物:CTGGGGACCGGATCTTCTTC

  下游引物:CTGCCTCTCGAAATTCTGAAACT

  Fis1:

  上游引物:TGTCCAAGAGCACGCAATTTG

  下游引物:CCTCGCACATACTTTAGAGCCTT

  OPA1:

  上游引物:TGGAAAATGGTTCGAGAGTCAG

  下游引物:CATTCCGTCTCTAGGTTAAAGCG

  Drp1:

  上游引物:CAGGAATTGTTACGGTTCCCTAA

  下游引物:CCTGAATTAACTTGTCCCGTGA

  Actin:

  上游引物:CCTCTATGCCAACACAGTGC

  下游引物:ATACTCCTGCTTGCTGATCC

  七、组织总RNA的提取:

  1.匀浆处理:

  每10-20mg组织加300μl裂解液RL(使用前请先检查是否已加入β- 巯基乙醇),用研磨杵将组织彻底研磨(如组织较难彻底研磨,可选用电动或玻璃匀浆器);随后向匀浆液中加入590μl RNase-Free ddH2O和10μl Proteinase K,混匀后56℃处理10-20min。

  注意:组织量一定不要超过20mg,否则将导致RNA得率和质量下降。

  2. 12000rpm(~13400×g)离心2-5min,取上清进行以下操作。

  3.缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇,混匀(此时可能会出现沉淀),得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中),12000 rpm(~13400×g)离心30-60sec,弃掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。

  4.向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1,12000rpm(~13400×g) 离心30-60sec,弃废液,将吸附柱放回收集管中。

  5.DNase I工作液的配制:取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free 离心管中,加入70μl RDD溶液,轻柔混匀。

  6.向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液,室温放置15min。

  7.向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1,12000rpm(~13400×g) 离心30-60sec,弃废液,将吸附柱放回收集管中。

  8.向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇),室温静置2min,12000rpm(~13400×g)离心30-60sec,弃废液,将吸附柱CR3放回收集管中。

  9.重复步骤8。

  10. 12000rpm(~13400×g)离心2min,倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

  注意:此步骤目的是将吸附柱CR3中残余的漂洗液去除,漂洗液的残留,可能会影响后续的RT等实验。

  11.将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-Free ddH2O,室温放置2min,12,000 rpm(~13400×g)离心2min,得到RNA溶液。

  注意:洗脱缓冲液体积不应少于30μl,体积过小影响回收效率。RNA 溶液请于-70℃保存。

  八、RNA浓度检测:

  纯度:OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的 RNA,OD260/OD280读数在1.8-2.1之间,比值为2.0是高质量RNA的标志。 OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品,假定在10mM Tris,pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯。浓度:取一定量的RNA提取物,用RNase-Free ddH2O稀释n倍,用 RNase-FreeddH2O将分光光度计调零,取稀释液进行OD260,OD280测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:

  终浓度(ng/μl)=(OD260)×(稀释倍数n)×40

  九、反转录的方法:

  1.计算RNA体积:以1微克模板RNA计算所需RNA的体积。

  2.将模板RNA、5X gDNA Buffer、Fast Quant Priermix、10X Fast RT Buffer、RNas-Free ddH2O在室温(15-25℃)解冻后迅速置于冰上。使用前涡旋震荡,离心机简短离心。

  3.配制gDNA去除反应体系:

  gDNA去除反应体系(10ul)

  

  5.将反转录反应体系加入到gDNA去除步骤的反应液中,充分混匀,42℃孵育15分钟,95℃孵育3分钟。

  6.可贮存于-20℃,以待用。

  十、RT-PCR的检测:

  1.引物的稀释:开盖前先4000转/分钟离心60秒,以防管壁上的OligoRNA散失。打开管盖,按照引物OD值将引物稀释2倍,混匀后冰上保存。

  2.室温下平衡2×SuperReal PreMix Plus、50×ROX Reference Dye、模板、引物和RNase-Free ddH2O,并混匀冰上保存。

  3.于冰上进行Real Time PCR反应液的配制。

  扩增反应体系

  

  图7为小鼠化疗干预后心肌线粒体结构的电镜表现,放大倍数约10000 倍。通过透射电镜观察线粒体发现对照组心肌细胞肌丝排列整齐,肌节规则,结构清晰,线粒体嵴正常,排列致密;OXL组和5FU组心肌肌节紊乱,核周隙增宽,线粒体轻度肿胀,嵴部分断裂;OXL+5FU组心肌肌节紊乱,核周隙增宽,线粒体轻-中度肿胀,嵴部分断裂或消失。

  表1为各组心肌线粒体的膜电位。OXL组、OXL+5FU组、5FU组的线粒体膜电位均较Control组有明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。并且 OXL+5FU组的膜电位较OXL组和5FU组更低(P<0.05)。

  表1线粒体膜电位(红/绿荧光值,)

  

  表2为各组心肌线粒体ATP的含量,图8为各组心肌线粒体膜电位以及ATP的含量的柱状图。OXL组、OXL+5FU组、5FU组的线粒体ATP含量均较Control组有明显减少,并且OXL+5FU组的线粒体ATP含量较OXL 组和5FU组更少。

  表2线粒体ATP含量

  

  图9为各组心肌线粒体融合-分裂蛋白目的基因的表达。OXL组、 OXL+5FU组、5FU组中,Mfn1、Mfn2、Opa1的目的基因表达量均比Control 组显著性降低(P<0.05),Drp、Fis1的目的基因表达量均比Control组显著性升高(P<0.05)。OXL+5FU组中,Mfn1、Mfn2、Opa1的目的基因表达量较OXL组显著降低(P<0.05),相反,Drp、Fis1的目的基因表达量较OXL 组及5FU组显著升高(P<0.05)。

  图10和图11为各组心肌线粒体融合-分裂蛋白的表达。OXL组、 OXL+5FU组、5FU组中,Mfn1、Mfn2、Opa1的蛋白表达量均比Control 组显著性降低(P<0.05),Drp、Fis1的蛋白表达量均比Control组显著性升高(P<0.05)。OXL+5FU组中,Mfn2、Opa1的蛋白表达量较OXL组和 OXL+5FU组显著降低(P<0.05),Mfn1仅较5FU组降低(P<0.05),相反, Drp、Fis1的蛋白表达量较OXL组及5FU组显著升高(P<0.05)。

  本发明通过间断低剂量腹腔给药奥沙利铂的方式(6mg/Kg奥沙利铂腹腔注射,一周两次,连续两周)可以建立奥沙利铂化疗心肌损伤小鼠模型;在该模型中,心肌损伤主要表现为CKMB、TnI、pro-BNP等血清心肌损伤标志物的升高以及射血分数LVEF的相对降低。

  奥沙利铂可能通过与细胞核DNA交联,阻碍DNA复制使线粒体融合蛋白Opa1、Mfn1、Mfn2表达降低,分裂蛋白Drp1、Fis1表达升高。线粒体融合-分裂平衡的失调会影响线粒体ATP生成等正常功能,并进一步诱导心肌细胞凋亡,最终导致心脏毒性的发生。

  本发明建立了一种铂类化疗药物对心肌损伤程度评价模型,在该模型中心肌损伤主要表现为CKMB、TnI、pro-BNP等血清心肌损伤标志物的升高 (P<0.05)以及射血分数EF的相对降低(P<0.05)。通过透射电镜观察奥沙利铂组心肌线粒体,发现该组心肌肌节紊乱,核周隙增宽,线粒体轻度肿胀,嵴部分断裂,说明经奥沙利铂干预后心肌线粒体有轻度损伤。奥沙利铂组 ATP含量及膜电位均较对照组减低(P<0.05),表明经奥沙利铂干预后线粒体功能有一定的降低。由于临床应用中奥沙利铂通常与氟尿嘧啶类药物联合使用,故本发明在建立奥沙利铂心肌损伤模型的同时,也观察了奥沙利铂与氟尿嘧啶联用时的心脏损伤情况。研究结果表明,奥沙利铂在与氟尿嘧啶联合应用时,对心肌损伤的程度显著大于奥沙利铂或氟尿嘧啶单独应用 (P<0.05),主要表现在联合组血清心肌损伤标志物CKMB、TnI、pro-BNP 水平、心律失常的发生率显著高于奥沙利铂/氟尿嘧啶单用组(P<0.05)。

  同时,由于线粒体融合和分裂的中断必然导致心肌细胞功能障碍,本发明也通过对心肌线粒体融合-分裂蛋白目的基因的表达以及心肌线粒体融合- 分裂蛋白的表达进行评价,从而判断出奥沙利铂化疗小鼠心肌线粒体的融合蛋白Opa1、Mfn1/2表达量相比对照组显著降低(P<0.05)。心肌细胞对线粒体融合异常高度敏感,既往研究通过下调Opa1抑制线粒体融合,最终导致了心肌扩张,严重限制了心肌的收缩功能。另外,Mfn1/Mfn2的缺失在成人心脏中可诱导线粒体碎片化,心肌细胞和线粒体功能迅速降低,最后形成致死性扩张型心肌病。在敲除心肌细胞特异性Mfn1的小鼠心脏中,线粒体小而呈球形,心脏整体功能和结构正常,线粒体呼吸功能也正常。Mfn1 缺失心肌细胞对氧化应激损伤的耐受性增强,这意味着Mfn1缺失导致的线粒体碎片化不足以导致心肌细胞和线粒体功能障碍。相反,Mfn2缺失的小鼠心肌细胞线粒体多形且大,心肌肥厚,心功能轻度降低。综上,奥沙利铂化疗小鼠心功能降低、心肌线粒体损伤可能与融合蛋白Opa1、Mfn1、Mfn2 的下降有关。奥沙利铂化疗小鼠心肌线粒体中分裂蛋白Fis1、Drp1的表达量较对照组显著升高(P<0.05)。线粒体分裂的破坏可导致线粒体募集和定位异常。心脏杂合子基因突变的Drp1(Drp1+/-)小鼠表现为左室功能障碍和心肌肥厚。通过siRNA抑制Drp1可以增加心肌细胞的收缩能力,降低Tau 指数(左室舒张时间常数,评价左室舒张功能的一个指标)。K+通道和胞浆 K+在心肌细胞动作电位持续时间中起关键作用,通过抑制Drp1抑制线粒体分裂,降低K+通道的表达,增加细胞质K+,可以延长心肌细胞的动作电位时程。Drp1突变小鼠所产生的扩张型心肌病,主要表现为双房、双室变薄,室腔增大,心肌钙化以及心肌肥厚,心脏功能表现为左室收缩压和收缩力下降,左室舒张末压升高。Drp1突变引起的扩张型心肌病可归因于线粒体分裂的损伤。因此,心肌细胞功能的维持需要正常的线粒体分裂。

  针对心肌线粒体融合-分裂失衡与细胞凋亡,本发明通过Western Blot 对心肌细胞凋亡过程中的核心蛋白分子Bax、Bcl-2、Caspase-3进行了检测。结果发现奥沙利铂化疗小鼠心肌细胞凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达升高 (P<0.05)。相反,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低(P<0.05)。由此可见,奥沙利铂致心肌损伤的分子生物学机制可能与心肌线粒体融合-分裂平衡失调最终导致心肌细胞凋亡有关。相反的,有效抑制心肌线粒体分裂蛋白Drp1、 Fis1的异常增多,可能有助于减轻奥沙利铂心肌损伤的程度。这为将来奥沙利铂心肌线粒体靶向保护药物的研发提供了一定的理论依据。

  申请人声明,以上所述仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,所属技术领域的技术人员应该明了,任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

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