一种用于增加烟草燃烧抽吸时口腔甜味、改善口腔舒适性的细菌制剂及烟草制品
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种用于增加烟草燃烧抽吸时口腔甜味、改善口腔舒适性的细菌制剂及烟草制品。
背景技术
甜是人感官感受中非常重要的一种口腔味觉感受。甜可给人带来愉悦的满足感。烟草通过燃烧时吸食摄入，甜味是烟草重要的口腔味觉特征之一。烟草在燃烧时，口腔感受到的甜味感受可给消费者带来愉悦和舒适感，烟草中常见的具甜味物质有：二氢弥核桃内脂类、糠醇类、糠醛类、呋喃类、酮类、醇类等化合物(闫克玉等，2008；赵铭钦， 2008)。口腔舒适性是卷烟感官舒适性的重要组成部分，烟气在口腔的刺感、辣感、灼烧感、干燥感、收敛/涩感、残留感等口腔舒适性指标会直接影响消费者对卷烟产品的喜好。
随着消费者对烟草制品感官感受越来越重视，为满足消费需求，烟草制品在制作时大多通过添加一些香精香料来增强烟草制品的口腔甜味，以提高烟草制品的吸食愉悦度和满足感。然而，香精香料在使用时，其配方、使用量较为复杂难以掌握，且通过香精香料赋予烟草制品的口腔甜味不够自然醇和。本研究组在之前的研究工作中虽然开发出了一些烟草用微生物，例如CN102499438、CN1074467707和CN107354109A中的赋香微生物制剂，但这些微生物菌株仅针对提升烟草香气品质，虽然其评吸香气科目下子项目中也包括“甜感”指标，但其指的是甜香感受，如烘焙糕点时鼻腔所感受到的甜香气息，但口腔并未有直接的甜味味觉，而鼻腔感受的各种香气和口腔所感觉到的甜味味觉是烟草吸食时两种完全不同的感官感受，即其不具有增加口腔甜味作用，而对于如何利用微生物增加烟草燃烧抽吸时自然的口腔甜味并整体改善口腔舒适性的定向研究尚未见报道。因此，开发新的细菌制剂以增加烟草燃烧抽吸时口腔甜味、改善口腔舒适性对于提高烟草原料品质具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种用于增加烟草燃烧抽吸时口腔甜味、改善口腔舒适性的细菌制剂及烟草制品，采用本发明所述的细菌制剂对烟草原料进行发酵后，可明显增加烟草原料燃烧抽吸时的口腔甜味，并整体改善口腔舒适性。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：
一种用于增加烟草燃烧抽吸时口腔甜味、改善口腔舒适性的细菌制剂，所述细菌制剂包括贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis) Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399；所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399均于2018年4月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号分别为：CGMCC No.15625、CGMCC No.15626和CGMCCNo.15627，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399的核苷酸序列分别如 SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399的质量比为(0.1～10)： (0.1～10)：1。
优选的，所述包含贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399的细菌制剂可制为湿菌体、菌液、粉剂或冻干粉。
一种燃烧抽吸时具有口腔甜味和口腔舒适性的烟草制品，将所述的细菌制剂喷施于烟草原料表面，发酵后经烘干处理得到。
优选的，所述烟草原料为单等级原料烟叶、卷烟掺配物和卷烟叶组中的一种或几种的混合物。
优选的，单等级原料烟叶为烤烟、白肋烟、香料烟或晒烟，卷烟掺配物为梗丝或再造烟叶。
本发明从增加烟草燃烧抽吸时口腔甜味、改善口腔舒适性的角度，发明了一种用于增加燃烧抽吸时烟草口腔甜味、改善口腔舒适性的细菌制剂，细菌制剂含有贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399菌株。研究结果表明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)YBN3和高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120在分别单独作用于烟草原料时，其功能是明显增加烟草燃烧抽吸时口腔甜味；而霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei)Y399在单独作用于烟草原料时，其功能为可明显改善口腔舒适性。可见虽然都是细菌发酵烟草原料，但是不同的菌株对烟草原料产生的作用是不同的。而经过本发明研究结果表明，采用本发明组合后的细菌制剂发酵烟草后，一方面烟草中的2-乙酰基呋喃、二氢猕猴桃内酯、5-甲基糠醛等增加口腔甜味的化学成分含量大大增加，另一方面燃烧抽吸时从感官角度能够明显增加烟草原料燃烧抽吸时的口腔甜味，并整体改善口腔舒适性。与现有技术相比，本发明首次使用细菌制剂来增加烟草燃烧抽吸时口腔甜味并整体改善口腔舒适性。
采用本发明的细菌制剂应用于烟草原料发酵，烟草原料燃烧抽吸时的口腔甜味品质明显提高，并整体改善口腔舒适性。该细菌制剂不仅使用方法简便，且口腔甜味自然，用于烟草生产，可提高烟草利用效率，降低烟草加工成本；并且本发明细菌制剂具有较好的通用性，对多种烟草原料燃烧抽吸时均有较好的增加口腔甜味，并整体改善口腔舒适性作用。
附图说明
图1为本发明细菌制剂发酵后烟草原料烟气的口腔味觉特征。
图2为本发明细菌制剂发酵后烟草原料烟气的口腔舒适性。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步详细说明。
本发明从烟叶中分离出贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌 (Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399三株菌株，并对其进行了如下保藏：
保藏日期：2018年4月18日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis) Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399的保藏编号分别为：CGMCC No.15625、CGMCC No.15626和CGMCC No.15627。
其中，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3的16S rRNA基因序列如SEQID No.1所示，高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120的其16S rRNA基因序列如SEQID No.2所示，霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399的16S rRNA基因序列如 SEQID No.3所示。
本发明为一种用于增加烟草燃烧抽吸时口腔甜味、改善口腔舒适性的细菌制剂，包括贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)Y120 和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei) Y399的质量比为(0.1～10)：(0.1～10)：1。
包含贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis) Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399的细菌制剂可制为湿菌体、菌液、粉剂或冻干粉。
烟草原料可为单等级原料烟叶(烤烟、白肋烟、香料烟或晒烟)、卷烟掺配物(梗丝、再造烟叶等)或卷烟叶组，或上述烟草成分的混合物。
实施例1
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis) Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399的分离、筛选与培养：
1、从新鲜烟叶中分离增加烟草燃烧抽吸时口腔甜味、改善口腔舒适性的菌株，其步骤为：将新鲜烟叶剪碎后混匀，称取10g加入90mL无菌水中，后逐级稀释，取各稀释度的悬液0.25mL涂布到改良LB固体培养基平板上，37℃恒温培养24h，挑取长势良好的单菌落，纯化后保藏于4℃冰箱。
改良LB液体培养基的成分为：胰蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 0.25％；pH 7.0。
改良LB固体培养基的成分为：胰蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 0.25％，琼脂1％；pH7.0；改良LB固体培养基可制成平板或斜面等。
若无特别说明，本发明中所有百分比均指质量百分比。
2、对筛选所得的所有纯培养菌株进行产酶活性试验。
产蛋白酶活性试验：将菌株点接于蛋白酶筛选培养基上进行培养，观察菌株周围如出现透明水解圈，表明菌株可产蛋白酶，测量并记录水解圈的大小。
产淀粉酶活性试验：将菌株点接于淀粉酶筛选培养基上进行培养，于平板上滴加碘液，使之铺满整个培养基，观察菌株周围如出现未染色透明水解圈，表明菌株可产淀粉酶，测量并记录水解圈的大小。
本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399产酶活性试验表明其均具备同时产蛋白酶和淀粉酶的能力。
蛋白酶筛选培养基成分为：酪蛋白1％，酵母膏0.5％，NaCl 0.4％，琼脂1％，pH7.2；
淀粉酶筛选培养基成分为：可溶性淀粉1％，蛋白胨0.5％，NaCl 0.5％，牛肉膏0.5％，琼脂1％，pH 7.0；
若无特别说明，本发明中所有百分比均指质量百分比。
3、对筛选所得的所有纯培养菌株进行烟草发酵初步试验，并根据烟草理化性质和对于烟草口腔甜味、口腔舒适性的评吸结果归类，最终筛选和确定的菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399。其中，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3和高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120在分别单独作用于烟草原料时，主要功能划分类别为可明显增加烟草燃烧抽吸时口腔甜味；霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399在单独作用于烟草原料时，主要功能划分类别为可明显改善口腔舒适性。
4、将所得的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399进行培养，其方法是：将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis)Y120 和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399分别接种至100mL的改良LB液体培养基中，于25℃～40℃，100rpm～200rpm恒温摇床振荡培养12h～48h，分别得到贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399的培养液；将所得的各菌株培养液在4℃条件下，以4000r/min～18000r/min离心5min～20min，弃上清液得到各湿菌体，进一步可制得粉剂或冻干粉，保藏于4℃冰箱备用。
实施例2
在具体实施时，将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399按照质量比(0.1～10)：(0.1～10)：1进行配比，即可得到本发明所述的细菌制剂。细菌制剂可制为湿菌体、菌液、粉剂或冻干粉。
1、将实施例1得到的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399按照质量比0.1:0.1:1的比例进行配比，称为细菌制剂1；
2、将实施例1得到的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399按照质量比3:5:1的比例进行配比，称为细菌制剂2；
3、将实施例1得到的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399按照质量比6:8:1的比例进行配比，称为细菌制剂3；
4、将实施例1得到的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YBN3、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y120和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)Y399按照质量比10:10:1的比例进行配比，称为细菌制剂4。
实施例3
将实施例2制备得到的细菌制剂用于烟草原料的发酵：将实施例2制备得到的细菌制剂，喷洒在烟草原料表面，在温度20℃～55℃，相对湿度30％～90％的条件下，恒温恒湿发酵20h～80h，发酵后经烘干处理，含水率在11％～15％之间，即获得用细菌制剂发酵的烟草原料。烟草原料可为单等级原料烟叶(烤烟、白肋烟、香料烟或晒烟)、卷烟掺配物(梗丝、再造烟叶等)、卷烟叶组，或上述烟草成分的混合物。
1、将实施例2制备得到的细菌制剂1用于烟草原料的发酵：将实施例2制备得到细菌制剂1喷洒在烟草原料表面，在温度20℃，相对湿度90％的条件下，恒温恒湿发酵 80h，发酵后经烘干处理，烘干至烟草原料的含水率为15％，即获得细菌制剂发酵的烟草原料。烟草原料为烟叶。
2、将实施例2制备得到的细菌制剂2用于烟草原料的发酵：将实施例2制备得到细菌制剂2喷洒在烟草原料表面，在温度55℃，相对湿度30％的条件下，恒温恒湿发酵 20h，发酵后经烘干处理，烘干至烟草原料的含水率为11％，即获得细菌制剂发酵的烟草原料。烟草原料为再造烟叶。
3、将实施例2制备得到的细菌制剂3用于烟草原料的发酵，将实施例2制备得到细菌制剂3喷洒在烟草原料表面，在温度38.5℃，相对湿度50％的条件下，恒温恒湿发酵50h，发酵后经烘干处理，烘干至烟草原料的含水率为13％，即获得细菌制剂发酵的烟草原料。烟草原料为梗丝。
实施例4
以实施例3得到的用本发明细菌制剂发酵的烟草原料(包含烟叶、再造烟叶等烟草成分的混合物)为实验样品，相同条件下，烟草原料不接种细菌制剂发酵而直接以相同量无菌水同等条件处理为对照样品，卷制成卷烟。由11名具有烟草行业卷烟感官评吸技术资格的感官评吸人员参照烟草行业标准《卷烟感官舒适性评价方法》YC/T 496-2014进行感官质量检验，检测烟气的口腔味觉特征和口腔舒适性，取平均结果，
(口腔味觉特征“酸、甜、苦”三项指标分值范围为0-5分，以0.5分为记分单位，取平均值；得分越高，各味觉程度越好。各项口腔舒适性指标分值范围为0-10分，以 0.5分为记分单位，取平均值；得分越高，各指标不舒适程度越轻)；采用气质联用 (GC/MS)分析引起烟草口腔甜味增加的致甜化学成分。
如图1所示，经本发明细菌制剂处理后的烟草原料燃烧抽吸时的口腔甜味明显增加，较对照样品提升29.20％，烟草口腔甜味自然。口腔苦味较对照样品下降5.69％；口腔酸味较对照样品提升6.17％分，变化不大。
如图2所示，经本发明细菌制剂处理后的烟草原料烟气的口腔整体舒适性明显好于对照样品，实验样品烟气在口腔的不舒适刺感、辣感、灼烧感、干燥感、收敛/涩感、残留感较对照明显减轻，口腔各项舒适性指标得分均明显高于对照样品。
表1本发明细菌制剂发酵后烟草原料燃烧抽吸时的致甜化学成分(μg/g)
由表1可知，引起烟草燃烧抽吸时口腔甜味增加的致甜化学成分在实验样品中总量有明显增加，较对照样品增幅为73.73％。其中，如2-乙酰基呋喃增加了87.13％，二氢猕猴桃内酯增加了28.73％，5-甲基糠醛增加了402.28％，其余的烟草致甜化学成分含量的增幅也在1.21％～108.86％。
序列表
<110> 陕西中烟工业有限责任公司
<120> 一种用于增加烟草燃烧抽吸时口腔甜味、改善口腔舒适性的细菌制剂及烟草制品
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1379
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽孢杆菌YBN3
<400> 1
ctcaccgact tcgggtgtta caaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg 60
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<210> 2
<211> 1363
<212> DNA
<213> 高地芽孢杆菌Y120
<400> 2
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<210> 3
<211> 1357
<212> DNA
<213> 霍氏肠杆菌Y399
<400> 3
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cttgacgtca tccccacctt cctccagttt atcactggca gtctcctttg agttcccggc 300
cggaccgctg gcaacaaagg ataagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatttc 360
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