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一种茶叶籽酚酸的HPEF提取方法

2022-12-30 10:48:12

一种茶叶籽酚酸的HPEF提取方法

  技术领域

  本发明属于茶叶籽深加工技术领域,具体涉及一种茶叶籽酚酸的HPEF提取方法。

  背景技术

  茶树(Camellia sinensis(L.)O.Ktze.)为山茶科山茶属植物,起源于我国云贵高原。茶树叶子、果实等植物材料富含茶多酚。酚类化合物是植物中一种重要的次生代谢产物,其分子结构中含有若干个酚性羟基基团,一般分为酚酸类、黄酮类、单宁类、黄烷醇类和苷类等。《中华人民共和国药典》说明茶叶籽酚酸类化合物具有降血脂、抗凝、抗氧化、利胆、抗癌等作用,已有报道采用高效液相色谱法测定茶叶籽单个组分的含量。茶叶籽中的活性酚酸类物质是多羟基化合物,它的结构特点决定酚酸易溶或可溶于水、醇类、醚类、酮类、酯类等,因此,溶剂提取法主要有水溶剂提取和有机溶剂提取两种。除此之外,还有微波辅助提取、超声波辅助提取、生物酶解提取、超临界流体萃取和膜技术提取等(《一种从火炭母中提取酚酸类化合物的方法》,专利号:201710418772.0;《柑橘皮渣酚酸防降解绿色高效超声波提取方法》,专利号:201710432484.0;《薰衣草中的酚酸类化合物及其制备方法和用途》,专利号:201710131035.2)。茶叶籽酚酸类在生物体中除作结构材料和能源性材料外,更重要地,还参与了生命现象中细胞的各种活动。酚酸广泛应用于食品、纺织、化妆品和医药领域等领域,其在生物学上的重要意义决定了它在食品及医药领域有广阔的前景。

  高压脉冲电场(HPEF)法是近年发展起来的一种新技术,其机理是利用细胞膜电穿孔原理在瞬间使细胞破壁,造成细胞膜电位混乱,细胞壁和细胞膜受到可逆或小可逆的破坏,从而令细胞组分流出,具有处理时间短、能耗低、较不易引起目的产物变性等优点。以提高茶叶籽酚酸抗氧化活性为目的的HPEF提取方法,能够克服常规乙醇水提取对活性物质带来的不利影响;利用HPEF提取方法能够加强与样品相接触的溶剂,并破坏其中茶叶籽中的细胞组分,将所需化合物从样品基体中分离,从而进入溶剂中(《一种采用高压脉冲电场提取马齿苋多糖的方法》,专利号:201310569144.4;《一种柑橘精油的提取方法》,专利号:201610121908.7;《一种高压脉冲电场辅助亚临界流体萃取米糠油的方法》,专利号:201410289492.0;《一种从牛蒡根中提取牛蒡多糖的方法》,专利号:201510389114.4)。

  发明内容

  为了解决现有茶叶籽酚酸提取方法效率低、纯度不高、成本高,从而导致酚酸产品DPPH自由基清除能力较低的问题,本发明提供了一种茶叶籽酚酸的HPEF提取方法,不仅提高了提取效率,还提高了产品得率、纯度以及DPPH自由基清除能力。

  本发明采用的技术方案如下:

  一种茶叶籽酚酸的HPEF提取方法,包括以下步骤:

  (1)原料处理:将茶叶籽干燥后粉碎过筛得到茶叶籽粉末,再将其溶于乙醇水溶液得到混合物;

  (2)HPEF提取:将所述混合物在功率400~600W、电场强度20~30KV/cm、脉宽7~11μs、频率40~68Hz的条件下HPEF处理2~6h,减压过滤、滤渣洗涤后得茶叶籽酚酸粗品;

  (3)树脂吸附:将所述茶叶籽酚酸粗品稀释后利用大孔树脂吸附并进行水浴振荡,将吸附得到的大孔树脂过滤并洗涤,待树脂滤干后利用55~65%乙醇动态洗脱,洗脱液浓缩后真空冷冻干燥,得到茶叶籽酚酸。

  本发明通过大量试验,发现不同原料中的酚酸,由于其溶出速率及干扰组分存在差异,且意外发现采用HPEF提取方法来提取茶叶籽中的酚酸不仅大大提高了提取效率,还提高了产品得率、纯度以及DPPH自由基清除能力,非常适合工业化大规模生产应用。

  步骤(1)中,将茶叶籽干燥至恒重并使其含水率低于0.05%,再粉碎并过90~110目筛得到茶叶籽粉末。

  优选地,步骤(1)中,所述的乙醇水溶液的体积浓度为45~55%。以茶叶籽粉末的质量计,所述乙醇水溶液的用量为1mg:(50~70)mL。实验表明,在优选的乙醇水溶液的用量和浓度条件下,茶叶籽酚酸的提取效率更高。

  优选地,步骤(2)中,所述HPEF处理的条件为:功率450~550W、电场强度24~26KV/cm、脉宽8~10μs、频率50~60Hz。实验表明在优选的HPEF参数条件下,提取过程中溶出的杂质成分少,溶出的有效组分较高。

  步骤(2)中,在0.01MPa条件下减压过滤50~70min,得到的滤渣利用体积浓度为45~55%的乙醇水溶液洗涤2~3次,合并滤渣即得茶叶籽酚酸粗品。以滤渣的质量计,所述乙醇水溶液的用量为0.001g:(30~80)mL。

  步骤(3)中,所述茶叶籽酚酸粗品加水稀释得到浓度为9.5~10.5mg/mL的溶液。所述水浴振荡的条件为:然后在20~30℃恒温水浴中振荡7~9h,振荡频率为1000~1400r/min。

  步骤(3)中,所述大孔树脂吸附的流速为2.0~4.0BV/h,吸附时间为1.0~3.0h。所述动态洗脱的速率为2.0~4.0BV/h。

  与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:

  (1)本发明的提取方法适宜工业化生产,提取率高,进一步提高了产品的得率和纯度;

  (2)本发明方法得到的茶叶籽酚酸的DPPH自由基清除能力比传统乙醇水溶液提法提高1.37~2.08倍,明显提高了产品的DPPH自由基清除能力;

  (3)本发明所使用的溶剂等试剂具有无毒、无害、用量少、成本低的特点,其本发明工艺简单、无环境污染,具有高效、省时和成本低等优点,是一种绿色环保、前景广阔的茶叶籽酚酸提取技术。

  附图说明

  图1为本发明提取茶叶籽酚酸的纯度、得率与清除DPPH自由基能力结果示意图。

  具体实施方式

  为了便于理解本发明,下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述,但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

  除非另有定义,下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的,并不是旨在限制本发明的保护范围。除有特别说明,本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。

  实施例1

  (1)原料处理:

  称取茶叶籽置于55℃烘箱中烘至近干,然后置于110℃的恒温恒湿干燥器内烘至恒重,过100目筛后,得到茶叶籽粉末(产物一A),备用;

  (2)HPEF提取:

  按照以mg计茶叶籽粉末的质量与以mL计乙醇水溶液的体积比1:60的比例,取步骤(1)得到的产物一A,置于体积浓度50%的乙醇水溶液中,在功率500W、电场强度25KV/cm、脉宽9μs、频率60Hz的处理条件下,用HPEF处理设备(购自孚光精仪(中国)有限公司)处理4h,在SHZ-D(III)循环水真空泵0.01MPa条件下减压过滤1.0h,滤渣用浓度为50%的乙醇提取溶剂洗涤3次,以g计滤渣的质量与以mL计提取溶剂的体积之比为0.001:50g/mL,洗涤后的滤渣合并,得到茶叶籽酚酸粗产品(产物二A);

  (3)树脂吸附:

  将步骤(2)得到的产物二A加水配制成10.0mg/mL的溶液,用Daion HP20大孔树脂进行吸附,流速为3.0BV/h,吸附时间为3.0h,然后在TS-100B恒温振荡器水浴中振荡8h,保持水浴温度恒定为25℃,振荡频率为1200r/min,得到产物三A;

  (4)成品制备:

  将步骤(3)的吸附产物三A后的Daion HP20大孔树脂过滤,过滤后的树脂用蒸馏水洗涤两次,待树脂滤干后用体积浓度60%的乙醇进行动态洗脱,其洗脱速率为2.0BV/h,洗脱液在60℃条件下浓缩到原有体积的10%,然后在-20℃温度和0.1MPa压力条件下进行真空冷冻干燥,得到茶叶籽酚酸产品(产物四A)。

  实施例2

  (1)原料处理:

  称取茶叶籽置于55℃烘箱中烘至近干,然后置于110℃的恒温恒湿干燥器内烘至恒重,过100目筛后,得到茶叶籽粉末(产物一B),备用;

  (2)HPEF提取:

  按照以mg计茶叶籽粉末的质量与以mL计乙醇水溶液的体积比1:60的比例,取步骤(1)得到的产物一B,置于体积浓度50%的乙醇水溶液中,在功率600W、电场强度20KV/cm、脉宽7μs、频率50Hz的处理条件下,用HPEF设备(孚光精仪(中国)有限公司的HPEF处理设备)处理4h,在SHZ-D(III)循环水真空泵0.01MPa条件下减压过滤1.0h,滤渣用浓度为50%的乙醇提取溶剂洗涤3次,以g计滤渣的质量与以mL计提取溶剂的体积之比为0.001:50g/mL,洗涤后的滤渣合并,得到茶叶籽酚酸粗产品(产物二B);

  (3)树脂吸附:

  将步骤(2)得到的产物二B加水配制成10.0mg/mL的溶液,用Daion HP20大孔树脂进行吸附,流速为3.0BV/h,吸附时间为3.0h,然后在TS-100B恒温振荡器水浴中振荡8h,保持水浴温度恒定为25℃,振荡频率为1200r/min,得到产物三B;

  (4)成品制备:

  将步骤(3)的吸附产物三B后的Daion HP20大孔树脂过滤,过滤后的树脂用蒸馏水洗涤两次,待树脂滤干后用体积浓度60%的乙醇进行动态洗脱,其洗脱速率为2.0BV/h,洗脱液在60℃条件下浓缩到原有体积的10%,然后在-20℃温度和0.1MPa压力条件下进行真空冷冻干燥,得到茶叶籽酚酸产品(产物四B)。

  实施例3

  (1)原料处理:

  称取茶叶籽置于55℃烘箱中烘至近干,然后置于110℃的恒温恒湿干燥器内烘至恒重,过100目筛后,得到茶叶籽粉末(产物一C),备用;

  (2)HPEF提取:

  按照以mg计茶叶籽粉末的质量与以mL计乙醇水溶液的体积比1:60的比例,取步骤(1)得到的产物一C,置于体积浓度50%的乙醇水溶液中,在功率400W、电场强度30KV/cm、脉宽11μs、频率50Hz的处理条件下,用HPEF设备(孚光精仪(中国)有限公司的HPEF处理设备)处理4h,在SHZ-D(III)循环水真空泵0.01MPa条件下减压过滤1.0h,滤渣用浓度为50%的乙醇提取溶剂洗涤3次,以g计滤渣的质量与以mL计提取溶剂的体积之比为0.001:50g/mL,洗涤后的滤渣合并,得到茶叶籽酚酸粗产品(产物二C);

  (3)树脂吸附:

  将步骤(2)得到的产物二C加水配制成10.0mg/mL的溶液,用Daion HP20大孔树脂进行吸附,流速为3.0BV/h,吸附时间为2.0h,然后在TS-100B恒温振荡器水浴中振荡8h,保持水浴温度恒定为25℃,振荡频率为1200r/min,得到产物三C;

  (4)成品制备:

  将步骤(3)的吸附产物三C后的Daion HP20大孔树脂过滤,过滤后的树脂用蒸馏水洗涤两次,待树脂滤干后用体积浓度60%的乙醇进行动态洗脱,其洗脱速率为2.0BV/h,洗脱液在60℃条件下浓缩到原有体积的10%,然后在-20℃温度和0.1MPa压力条件下进行真空冷冻干燥,得到茶叶籽酚酸产品(产物四C)。

  实施例4

  (1)原料处理:

  称取茶叶籽置于55℃烘箱中烘至近干,然后置于110℃的恒温恒湿干燥器内烘至恒重,过100目筛后,得到茶叶籽粉末(产物一D),备用;

  (2)HPEF提取:

  按照以mg计茶叶籽粉末的质量与以mL计乙醇水溶液的体积比1:60的比例,取步骤(1)得到的产物一D,置于体积浓度50%的乙醇水溶液中,在功率400W、电场强度20KV/cm、脉宽7μs、频率40Hz的处理条件下,用HPEF设备(孚光精仪(中国)有限公司的HPEF处理设备)处理4h,在SHZ-D(III)循环水真空泵0.01MPa条件下减压过滤1.0h,滤渣用浓度为50%的乙醇提取溶剂洗涤3次,以g计滤渣的质量与以mL计提取溶剂的体积之比为0.001:50g/mL,洗涤后的滤渣合并,得到茶叶籽酚酸粗产品(产物二D);

  (3)树脂吸附:

  将步骤(2)得到的产物二D加水配制成10.0mg/mL的溶液,用Daion HP20大孔树脂进行吸附,流速为3.0BV/h,吸附时间为1.0h,然后在TS-100B恒温振荡器水浴中振荡8h,保持水浴温度恒定为25℃,振荡频率为1200r/min,得到产物三D;

  (4)成品制备:

  将步骤(3)的吸附产物三D后的Daion HP20大孔树脂过滤,过滤后的树脂用蒸馏水洗涤两次,待树脂滤干后用体积浓度50%的乙醇进行动态洗脱,其洗脱速率为2.0BV/h,洗脱液在60℃条件下浓缩到原有体积的10%,然后在-20℃温度和0.1MPa压力条件下进行真空冷冻干燥,得到茶叶籽酚酸产品(产物四D)。

  对比例

  (1)原料处理:

  称取茶叶籽置于55℃烘箱中烘至近干,然后置于110℃的恒温恒湿干燥器内烘至恒重,过100目筛后,得到茶叶籽粉末(产物一E),备用;

  (2)传统乙醇水提取:

  按照以mg计茶叶籽粉末的质量与以mL计乙醇水溶液的体积比1:60的比例,取步骤(1)得到的产物一E,置于圆底烧瓶中,然后加入体积浓度50%的乙醇水溶液,在80℃恒温水浴中浸提1h,在SHZ-D(III)循环水真空泵0.01MPa条件下减压过滤1.0h,滤渣用浓度为50%的乙醇提取溶剂洗涤3次,以g计滤渣的质量与以mL计提取溶剂的体积之比为0.001:50g/mL,洗涤后的滤渣合并,得到茶叶籽酚酸粗产品(产物二E);

  (3)树脂吸附:

  将步骤(2)得到的产物二E加水配制成10.0mg/mL的溶液,用Daion HP20大孔树脂进行吸附,流速为3.0BV/h,吸附时间为3.0h,然后在TS-100B恒温振荡器水浴中振荡8h,保持水浴温度恒定为25℃,振荡频率为1200r/min,得到产物三E;

  (4)成品制备:

  将步骤(3)的吸附产物三E后的Daion HP20大孔树脂过滤,过滤后的树脂用蒸馏水洗涤两次,待树脂滤干后用体积浓度60%的乙醇进行动态洗脱,其洗脱速率为2.0BV/h,洗脱液在60℃条件下浓缩到原有体积的10%,然后在-20℃温度和0.1MPa压力条件下进行真空冷冻干燥,得到茶叶籽酚酸产品(产物四E)。

  性能测定:

  采用以下方法和条件测定根据上述实施例1~4制备得到的茶叶籽酚酸的得率、纯度以及DPPH自由基清除能力。(抗氧化活性)

  测定酚酸得率与纯度:采用Folin-酚法测定上述实施例1~4制得的茶叶籽酚酸产品中酚酸的纯度,测定的条件为:准确称取一定质量的酚酸产品,加水溶解后定容成一定体积得样品溶液,吸取样品溶液1mL,加入1mL蒸馏水、1mL Folin-酚试剂、3mL 10%的Na2CO3,使用紫外可见分光光度计测定其在波长为750nm处的吸光值,代入标准回归方程计算出所述酚酸产品中的酚酸含量,进一步计算得到酚酸的纯度和得率。

  酚酸得率(mg/g)=酚酸产品中的酚酸量(mg)/原料总量(g)。

  测定酚酸清除DPPH自由基能力:在1mL不同浓度的样品溶液中加入1mL浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液,在370℃暗处放置20min,以甲醇为空白,于517nm处测定吸光度Ai,在1mL浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液中加入1mL的甲醇混合,在黑暗中37℃放置20min,以甲醇为空白在517nm处测定吸光度A0;取1mL样品溶液与1mL甲醇混合,在37℃暗处放置20min,以甲醇为空白在517nm分别测定其吸光度Aj。将实验重复三次,求平均值后计算DPPH自由基基清除率(%)={[A0-(Ai-Aj)/A0]}×100%。不同提取物清除自由基能力采用清除的IC50值表示,计算出自由基清除率为50%时所需提取物浓度(IC50),按式计算IC50=50%×加入的DPPH质量/加入的试样溶液中溶质质量。

  测定结果如图1所示,由图1可知,在DPPH自由基体系中,本发明方法提取得到的茶叶籽酚酸的IC50为46.23~70.23μg/mL,而对比例中提取得到的茶叶籽酚酸的IC50为82.13μg/mL。由此可知,本发明方法制备得到的茶叶籽酚酸的DPPH自由基清除能力比传统70%乙醇水提法提高1.37~2.08倍,本发明方法明显提高了提取的茶叶籽酚酸的DPPH自由基清除能力。

  综上所述,根据本发明方法制备得到的茶叶籽酚酸具有抗氧化、增强机体免疫功能及抗肿瘤等活性,可在食品、医药及烟草领域中应用。

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