微生物菌群在急性胰腺炎中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及与微生物菌群在急性胰腺炎中的应用。
背景技术
急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一种可导致局部损伤、全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和器官衰竭的炎症性疾病。随着社会的不断发展和进步，人们生活水平的提高，高脂饮食，低运动量，过度工作压力，酗酒等饮酒习惯增加等原因，胰腺炎的发病率增加，导致急性胰腺炎的发病率增加。急性胰腺炎占急腹症的3％-10％，这是临床常见的急腹症。这种疾病对生理学有很大的破坏性。它具有起效快，发展迅速，风险高，死亡率高的特点。急性胰腺在急性期和其他的非急性胰腺炎型的急腹症鉴别相对困难，这会造成对诊断和治疗带来了延迟或耽误病情的情况，这样会给患者的生命安全构成了威胁。引发胰腺炎症反应和坏死过程的具体机制尚不清楚。
中华医学会胰腺外科学会修订了“急性胰腺炎的诊断和治疗指南’，(2014)，明确了急性胰腺炎的诊断定义:通过满足或满足以下条件诊断急性胰腺炎:腹痛符合AP；血清淀粉酶和/或脂肪酶活性超过正常上限的三倍；影像学检查符合AP影像学改变(LiPinski M,Rydzewska一Rosolowska A,Rydzewski A,et al.Fluid resuscitation in acutePancreatitis:normal saline or lactatedRinger7S solution.Wor1dJ Gastroenterol,2015，21(31):9367-9372.)。传统的诊断方法(如CT)需要很长时间，过程复杂，不利于及时，动态地监测疾病的变化。尤其是在基层医院临床应用中受到条件限制，CT扫描检查对影像医生读片的要求更高，有必要结合相应的临床症状来诊断疾病。已运用于临床的预后的评分系统很多，如格拉斯哥评分系统、阿帕奇综合肥胖评分(APACHE-O)，预后胰腺炎(POP)，急性生理和慢性健康评估II(APACHEII)，无害急性胰腺炎评分(HAPS)，急性胰腺炎严重程度的床边指标，E-胰腺炎(BISAP)，日本严重程度评分(JSS)等。但这些评分系统较为复杂、繁琐，且都有很高的假阳性率，并不被临床医生经常使用。因此在临床诊治当中，寻找合适的、便捷的预测AP患者生物学指标具有重要的意义。
肠道菌群被称为人类“第二指纹”，正常情况下，肠道菌群与宿主之间和平共生，处于平衡状态，一旦平衡被打破，肠道菌群结构出现紊乱，肠道微生物可通过多种途径影响人类健康(Janssen AW,Kersten S,et al.The role of the gut microbiota in metabolichealth[J].FASEB Journa1,2015,29(8):3111-3123.)，如胃肠道疾病如炎症性肠病、肠易激综合征、结肠癌等和胃肠外疾病如阿尔兹海默病、冠心病、肥胖、糖尿病等。目前对于急性胰腺炎患者的的微生物组特征的研究非常有限，本申请通过研究急性胰腺炎患者与健康受试者的微生物组特征，发现呈现显著性差异的微生物菌群，以期实现急性胰腺炎的诊断和治疗。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明的目的在于提供一种用于评估急性胰腺炎的微生物标志物及其应用，本发明的微生物标志物预测急性胰腺炎风险的灵敏性好，只需要获取微生物标志物的相对含量，作为协助诊断，指导微生物环境的调整，降低急性胰腺炎的风险。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种急性胰腺炎微生物标志物，所述微生物标志物为g_Ruminococcus_gauvreauii_group。
第二方面，本发明提供了一种检测第一方面所述的微生物标志物的试剂。
第三方面，本发明提供了一种第一方面所述的微生物标志物或第二方面所述的试剂的用途，所述用途包括用于构建预测急性胰腺炎风险的模型、制备诊断急性胰腺炎的产品。
优选地，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸。
优选地，所述模型的输入变量为第一方面所述的微生物标志物的丰度。
优选地，所述微生物标志物丰度的测定方法包括宏基因组测序、16S测序或qPCR定量检测中的任意一种或几种。
第四方面，本发明提供了一种诊断急性胰腺炎的产品，所述产品包括第二方面所述的试剂。
优选地，所述试剂包括检测第一方面所述的微生物标志物的特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
第五方面，本发明提供了第一方面所述的微生物标志物在制备预防急性胰腺炎的药物或食品中的用途。
优选地，所述药物或食品包括促进所述微生物标志物丰度增加的试剂。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了g_Ruminococcus_gauvreauii_group与急性胰腺炎相关，Ruminococcus_gauvreauii_group在急性胰腺炎患者中丰度显著降低，说明Ruminococcus_gauvreauii_group可作为检测靶标应用于急性胰腺炎的诊断和预测。
本发明提供了一种诊断急性胰腺炎的产品，所述产品能在疾病早期进行诊断，实现早期预警，提高患者的生活质量。
附图说明
图1是Ruminococcus_gauvreauii_group在急性胰腺炎患者中的丰度图。
图2是Ruminococcus_gauvreauii_group作为检测变量的诊断效能图。
具体实施方式
本发明通过将健康的人群和急性胰腺炎的人群作为对象，首次查明了细菌与急性胰腺炎的临床医学指标的相关性，并以此为基础提供了急性胰腺炎的早期诊断技术。为了评估微生物菌群能否作为急性胰腺炎的预测因子，本发明通过收集正常人群与急性胰腺炎的直肠棉拭子，综合分析16S rRNA测序、宏基因组测序和针对特定菌群的定量聚合酶链反应结果，发现与急性胰腺炎相关的微生物菌群，本发明通过16S rRNA测序，首次发现了g_Ruminococcus_gauvreauii_group的丰度在急性胰腺炎和正常人群中呈现显著性差异，说明g_Ruminococcus_gauvreauii_group可作为急性胰腺炎诊断的生物标志物。
在本发明的实施方式中，本发明通过以下步骤来诊断急性胰腺炎：在来自个体的核酸样本中，检测与急性胰腺炎的诊断相关的菌种所对应的一个或多个核酸片段。在特定的实施方式中，检测对应于Ruminococcus_gauvreauii_group的核酸片段。在实施本文描述的方法中，使用分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA方面的很多传统技术，这些技术是公知的。
下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
本文中术语“OTU”(操作分类单元)是指系统发生树中的末端叶(terminal leaf)，由特定的遗传序列以及与该序列在科、属、种或菌株水平上享有序列同一性的全体序列来定义。所述特定遗传序列可以是16S序列或16S序列的一部分，或者可以是在广泛存在于整个真细菌界的功能保守的管家基因。OTU之间具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。OTU经常通过比较生物体之间的序列来定义，序列同一性低于95％的序列不视为构成同一OTU的一部分，然而在本文所用，一个OTU标识可包含序列同一性为0至100％、25％至100％和50％至100％、优选70％至100％、75％至100％、77％至100％、80％至100％、81％至100％、82％至100％、83％至100％、84％、至100％、更优选85％至100％、86％至100％、87％至100％、88％至100％、89％至100％、90％至100％、91％至100％、92％至100％、93％至100％、94％至100％、95％至100％、96％至100％、97％至100％98％至100％和99％至100％的序列。
本文中，OTU代表此前已经归入或尚未归入属、种和/或株名的细菌，也即OTU或OTU标识等同于细菌的目、科、属、种或株，在进行生物信息学分析的过程中，通过OUT聚类，分析其代表的细菌的含量。
16S rRNA的“V1-V9区”指16S rRNA基因的第一至第九高变区，用于细菌样品的基因分型，这是普通技术人员众所周知的。一些实施方式中，用V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8和V9区中至少其一来表征微生物标志物。一些实施方式中，用V3和V4区来表征微生物标志物。
本文中检测微生物标志物的探针是与微生物标志物多核苷酸“特异性杂交”的寡核苷酸，其具有充分互补序列从而允许在本领域常用预定条件下与目标核苷酸序列杂交的寡核苷酸(有时称为“基本互补”)。尤其，该表述包括一寡核苷酸与本文所述单链DNA或RNA分子内所含基本上互补的序列杂交，基本上排除该寡核苷酸与非互补序列的单链核酸杂交。探针和引物的具体长度和序列取决于所需核酸靶标的复杂性以及反应条件(例如温度和离子强度)。总体来说，杂交条件是本领域所知的严格杂交条件。“严格”指核苷酸序列能够结合相关或非特异性序列的条件。例如，高温和低盐提高严格性，使得非特异性结合或低熔融温度的结合发生解离。一些实施方式中，与微生物标志物多核苷酸互补的寡核苷酸与微生物标志物多核苷酸至少95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。
作为一种可选择的实施方式，用于诊断对象急性胰腺炎的方法包括：分析对象测试样品的核酸；检测测试样品的核酸中一种或多种微生物和/或OTU的水平；当所述测试样品中一种或多种微生物和/或OTU的水平低于对照样品时诊断所述对象存在发生急性胰腺炎的风险；优选的，所述微生物标志物为g_Ruminococcus_gauvreauii_group。
另一实施方式中，用于诊断对象急性胰腺炎的方法包括：获取对象的样品；处理受试者样品以获取16S rRNA基因序列数据；检测样品中一种或多种微生物和/或OTU的水平，包括用生物信息学软件分析16S rRNA基因序列数据；并且当样品中一种或多种微生物和/或OTU的水平低于对照样品时诊断所述对象存在发生急性胰腺炎的风险；优选的，所述微生物标志物为g_Ruminococcus_gauvreauii_group。
如本文所用，“显著性差异”是指当测试样品中一种或多种微生物或OTU的水平相比对照样品按log2差异倍数计改变至少约1.2倍。“改变”一词包括测试样品中微生物或OTU水性相比对照样品升高或降低。一些实施方式中，测试样品与对照样品之间一种或多种微生物或一个或多个OTU水平的改变可以是按log2差异倍数计相对于对照样品的约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍或5倍及以上。
一些实施方式中，当测试样品中一种或多种微生物或一个或多个OTU的水平按log2差异倍数计相比对照样品高约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍或5倍及以上。
一些实施方式中，当测试样品中一种或多种微生物或一个或多个OTU的水平按log2差异倍数计相比对照样品低约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍或5倍及以上。
本文中使用的术语“样本”或“测试样本”指的是含核酸的任何液体材料或固体材料。在合适的实施方式中，测试样本从生物源获取(即，“生物样本”)，比如培养中的细胞，或者是来自动物且最优选地来自人类的组织样本。在示例性实施方式中，所述样本是直肠棉拭子。
本发明的方法和产品可以用来利用获取自个体的生物样本来检测与各种细菌有关的核酸。可以根据本领域的技术人员所熟知的任何方法将该核酸(DNA 或RNA)从所述样本中分离出来。可以通过标准步骤来获取生物样本并且可以立即使用所述生物样本，或者可以在适于该类型的生物样本的条件下储存该生物样本以备后续使用。
实施例1急性胰腺炎相关的微生物菌群的检测
1、样本的采集
收集20例健康人和60例急性胰腺炎患者的直肠棉拭子样本。患者资料统计如表1所示。
患者的纳入标准：符合2012年新亚特兰大急性胰腺炎分类标准。
患者的排除标准：无免疫缺陷、过敏、哮喘、结肠癌、糖尿病、HIV、炎症性肠病、肠易激综合症、肠胃炎、麻醉小肠结肠炎、和关节炎。
健康对照的纳入标准：无代谢、心脑血管和肠道疾病；没有怀孕，没有已知的过敏原；没有影响肠功能的药物治疗；不吃减肥或其他特定目的的饮食。
患者和健康对照排除标准：服用抗生素、益生菌、中草药和其他可能影响肠道菌群结构的物质。
表1患者资料
2、16S rRNA测序
2.1DNA的提取
使用DNA提取试剂盒自样本中提取细菌DNA，操作步骤按说明书进行。
2.2DNA样本纯度及浓度测定
利用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。
2.3PCR扩增及产物纯化
按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物，或合成带有错位碱基的融合引物。
为保证后续数据分析的准确性及可靠性，需满足两个条件，1)尽可能使用低循环数扩增；2)保证每个样本扩增的循环数一致。随机选取具有代表性的样本进行预实验，确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。
PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；
PCR仪：ABI
全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。
2.4荧光定量
将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。
2.5Miseq文库构建
1)通过PCR将Illumina官方接头序列添加至目标区域外端；
2)使用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物；
3)Tris-HCl缓冲液洗脱，2％琼脂糖电泳检测；
4)氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。
试剂：TruSeqTM DNA Sample Prep Kit
2.6Miseq测序
1)DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；
2)以DNA片段为模板，芯片上固定的碱基序列为引物进行PCR合成，在芯片上合成目标待测DNA片段；
3)变性、退火后，芯片上DNA片段的另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”；
4)PCR扩增，产生DNA簇；
5)DNA扩增子线性化成为单链；
6)加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；
7)用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；
8)将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；
9)统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。
3、数据分析
3.1数据预处理
MiSeq测序得到的是双端序列数据，首先根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接(merge)成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向，即为优化数据。
数据去杂方法和参数：
1)过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的reads，去除含N碱基的reads；
2)根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10bp；
3)拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；
4)根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2；
使用软件：FLASH、Trimmomatic。
3.2物种注释与评估
使用Usearch进行OTU聚类分析，OTU(Operational Taxonomic Units)是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元(品系，属，种、分组等)设置的统一标志。要了解一个样本测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行聚类(cluster)。通过聚类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。可根据不同的相似度水平，对所有序列进行OTU划分，通常对在97％的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。
软件平台：Usearch(vsesion 7.0http://drive5.com/uparse/)
分析步骤如下：
对优化序列提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量；
去除没有重复的单序列；
按照97％相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。
采用RDP classifier贝叶斯算法对97％相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类学水平：domain(域)，kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。
3.3物种差异分析
运用生物信息学分析方法分析物种差异分析根据得到的群落丰度数据，检测不同组(或样本)微生物群落表现出的丰度差异。物种差异性分析的内容包括：组间差异显著性检验、Lefse多级物种差异判别分析。本项目使用组间差异显著性检验进行差异物种的筛选。
组间差异显著性检验根据得到的群落丰度数据，运用严格的统计学方法可以检测不同组(样本)微生物群落中表现出的丰富度差异的物种，进行假设性检验，评估观察到的差异的显著性。分析可选择域、界、门、纲、目、科、属、种、OTU等不同分类水平。
1)Wilcox秩和检验(Wilcoxon rank-sum test)，也叫曼-惠特尼U检验(Mann–Whitney U test)，是两组独立样本非参数检验的一种方法。其原假设为两组独立样本来自的两总体分布无显著差异，通过对两组样本平均秩的研究来实现判断两总体的分布是否存在差异，该分析可以对两组样本的物种进行显著性差异分析，并对P值进行多种方法的校正。
2)多重检验校正，即对P值进行多重检验校正方法为"fdr"。
3)双尾检验，用于指定所求置信区间的类型，选择双尾检验(求置信区间)。
4)CI计算方法，即计算置信区间的方法，方法为DP：Welch’s confidenceinverted。置信度选择：0.95。
运用DP的方法计算影响大小(effect size)，即mean1–mean2；运用Welch T检验的方法计算置信区间，筛选标准P<0.05。
软件：R的stats包和python的scipy包。
4、结果
结果显示，与对照组相比，Ruminococcus_gauvreauii_group的丰度在急性胰腺炎的患者中显著下调，差异具有统计学意义(P<0.0001)，提示Ruminococcus_gauvreauii_group可以作为生物标志物应用于急性胰腺炎的诊断。
实施例2 Ruminococcus_gauvreauii_group的诊断效能
根据Ruminococcus_gauvreauii_group的相对含量，使用SPSS绘制受试者工作特征曲线(ROC)，计算二项精确置信空间，分析Ruminococcus_gauvreauii_group用于急性胰腺炎诊断的灵敏性和特异性。
ROC曲线以及特征参数分别如图2和表2～3所示，曲线下面积为0.904，最佳临界点的阈值为109.5，该点的敏感性为0.833，特异性为0.85，具有较高的敏感性和特异性，说明将Ruminococcus_gauvreauii_group应用于急性胰腺炎的诊断具有较高的敏感性、特异性和准确性。基于本研究的发现，可通过调整Ruminococcus_gauvreauii_group的丰度来预防或治疗急性胰腺炎。
表2曲线下面积检验结果变量:Ruminococcus_gauvreauii_group
a.在非参数假设下
b.零假设：实面积＝0.5
表3曲线的坐标检验结果变量:Ruminococcus_gauvreauii_group
注：a.最小界限值是最小观测检验值减1，最大界限值是最大观测检验值加1。所有其它的界限值都是两个邻近的观测检验值的平均值。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
