一株粪肠球菌及其在水质改良和水产养殖中的应用
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体涉及一株粪肠球菌及其在水质改良和水产养殖中的应用。
背景技术
近年来，我国水产养殖业发展迅猛，养殖企业为满足日益增长的水产品消费需求、增加水产养殖动物生产量，在动物饲粮内加入了抗生素，为整个水产养殖行业的发展带来了巨大贡献。但随着时间的推移，抗生素使用带来的食品安全问题日益显现，已经引起世界范围内的高度关注，饲料安全等同于食品安全的概念成为普遍共识。人们开始纷纷寻求其它的替代品和替代技术，以保证畜牧业生产的效率与效益不受影响。
益生菌作为抗生素的一种替代品，越来越受到人们的重视。益生菌是指有利于维持肠道内的微生态平衡的微生物及其代谢产物，其可通过进入并定植于宿主的消化道，促进肠道有益微生物的繁殖，抑制有害微生物生长，调节宿主肠道菌群平衡，从而改善宿主的健康。水产养殖中常用的益生菌有光合细菌、芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、蛭弧菌、硝化细菌等。
在水产养殖过程中可以将益生菌作为饲料对养殖动物进行喂养或者加入到水体中，不仅能起到改善和优化养殖水体环境的作用，还有利于促进养殖生物的健康成长以及提高其抗疾病的能力，这一优势对水产养殖的生物来说无疑是有重大作用和影响的。具体功效为：
(1)抑制体内肠道致病菌，在进行水产养殖的时候把益生菌作为饵料的调剂品直接喂养水生物，或者直接投入到水中让水生物自己摄取。这时进入到养殖水生物肠道的益生菌的数量就会不断增加，随着益生菌数量的不断增多，通过发挥分泌抑菌的物质和竞争氧气和生长因子等营养物质的机理，当中还能分泌和代谢出有益水生物成长的多种维生素来调节微生态生物的营养物质，能有效抑制住肠道内有害的微生物菌群。
(2)提高生物体的免疫力作用，益生菌通过刺激生物体的免疫力器官激发吞噬细胞的活性或者产生干扰素的方式达到提高生物体抗病的能力。益生菌还能通过分泌一种裂解酶来控制寄生虫在细胞壁中繁殖，进而达到减少和避免水生物受到寄生虫的危害。
(3)有利于水体物质的循环，在高密度的养殖中不免会产生大量的排泄物，导致水体富营养化的现象，对养殖水生物有害的物质提供了繁殖生长的环境，此时就会破坏整个水体的微循环系统，进而造成养殖生物的死亡。在益生菌中的硝化、硫化等净水微生物发挥其氧化或者硫化以及解磷的作用下，能对有机物进行分解，作为养殖生物饵料的藻类得到了益生菌分解出来的无机盐等营养物质的滋养，得以繁殖，藻类在光合作用下产生的氧气又能使得养殖生物和有机物的分界提供了保障，进而促进水生态的良性循环，有效改善水体环境。
因此，近些年对于益生菌的筛选成为本领域内的研究热点，也对水产饲料配方的改进具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株新型粪肠球菌及其在水质改良和水产养殖中的应用。所述粪肠球菌筛选自水质恶化水体中幸存的“耐病”南美白对虾的肠道，能够有效抑制病原菌，提高水产动物的免疫力和抗病力，促进水产动物生长，还能高效净化水体，可广泛应用于水产养殖领域。
本发明一方面提供了一株粪肠球菌，命名为粪肠球菌CD03(Enterococcusfaecalis%20CD03)，已于2020年4月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC%20NO:M%202020089。
本发明一方面提供了所述粪肠球菌在净化水体中的应用。
本发明一方面提供了所述粪肠球菌在水产养殖中的应用。
本发明还提供了一种复合微生态制剂，包含所述粪肠球菌。
所述复合微生态制剂还包含地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、双歧杆菌、屎肠球菌、乳酸片球菌、嗜酸乳杆菌中的任意一种或两种或多种的组合。
所述复合微生态制剂中粪肠球菌的活菌量不低于109CFU/g。
本发明还提供了所述复合微生态制剂在净化水体中的应用。
本发明还提供了所述复合微生态制剂在水产养殖中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的粪肠球菌CD03能够显著降低水体的化学需氧量，加快有机质的降解，降解率高达90％以上，有利于净化养殖水体，改善养殖环境。该菌能有效抑制副溶血弧菌、哈维氏弧菌等病原菌，减少养殖动物病害发生的几率，同时还能作为饲料添加剂，显著提高养殖动物对饲料的利用率，促进动物生长。与对照组相比，添加了粪肠球菌CD03的益生菌组中南美白对虾的增重率、特定生长率、细胞密度、吞噬活性、呼吸爆发活力、酚氧化酶活力和酸性磷酸酶活性分别提高了31.9％、21.9％、32.2％、60.1％、13.8％和10.2％，而累计死亡率下降了46.6％。此外，本发明提供的粪肠球菌CD03还可以应用于鱼类、虾蟹等水产动物的饲料中，能够使水产动物的主要免疫指标值普遍提高18-35％，全周期存活率提高22-39％，生长率提高17-29％，饲料系数降低9-15％。本发明所述粪肠球菌CD03作为益生菌在水产养殖业中应用前景广阔。
具体实施方式
本发明实施例中选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
其中实施例中选用的培养基，具体配方如下：
MRS培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、酵母粉5g、吐温80lml、磷酸二氢钾2g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000ml，pH7.0±0.2，115℃灭菌20min，固体培养基是在液体培养基的基础上加入1.6％的琼脂配制而成。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂18g/L，121℃灭菌30min。
选择性液体培养基：牛肉膏3.0g，胰蛋白胨6.3g，葡萄糖5.4g，磷酸氢二钾0.6g，磷酸二氢钾0.4g，碳酸氢钠0.32g，硫酸镁0.1g，氯化铵0.5g，纯水1000ml。
选择性固体培养基：牛肉膏3.0g，胰蛋白胨6.3g，葡萄糖5.4g，磷酸氢二钾0.6g，磷酸二氢钾0.4g，碳酸氢钠0.32g，硫酸镁0.1g，氯化铵0.5g，琼脂18g，蒸馏水1000ml。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1菌株的分离、筛选与鉴定
1、样品
采集自江苏一规模化养虾厂的南美白对虾肠道，所述南美白对虾为因水质变化大量死亡后幸存的“耐病”南美白对虾。
2、菌株的分离与纯化
用无菌水冲洗对虾体表的杂物并用酒精喷洒之后在超净台取对虾肠道(含内容物)；将剪碎的肠道加入无菌生理盐水中，其中含无菌玻璃珠，30℃条件下摇床恒温培养，转速160r/min，8h后取上清液涂布MRS平板(添加了溴甲酚紫)，30℃恒温培养48h，挑取能够使平板由紫色变为黄色的单菌落于MRS平板划线培养进一步纯化菌种。
挑选长势良好的单菌落接种到100ml选择性液体培养基中，转速160r/nin，30℃条件下摇床恒温培养24h，重复驯化富集3次。将富集菌液梯度稀释后涂布于选择性固体培养基，30℃条件下恒温培养24h，从固体培养基上挑选5个长势良好的单菌落接种到LB液体培养基中，30℃条件下摇床恒温培养18h，然后将菌液保存于30％甘油中，并置于-80℃冰箱中保存。这5个菌落分别命名为CD01，CD02，CD03，CD04，CD05。
3、检测潜在目的菌株在降解水体中有机质、降低化学需氧量COD方面的能力
所谓化学需氧量(COD)，是在一定的条件下，采用一定的强氧化剂处理水样时，所消耗的氧化剂量。它是表示水中还原性物质多少的一个指标。水中的还原性物质有各种有机物、亚硝酸盐、硫化物、亚铁盐等，但主要的是有机物。
因此，化学需氧量(COD)又作为衡量水中有机物质含量多少的重要指标。化学需氧量越大，说明水体受有机物的污染越严重。
将CD01、CD02、CD03、CD04、CD05五株菌分别接种于1.5ml液体LB培养基中，转速160r/min，30℃条件下摇床恒温培养16h，将菌株活化。下一步将活化菌株按照1:1000体积比例加入到150ml实验室养殖污水中，养殖污水初始COD为50mg/L。室温下静置24h后，用重铬酸钾法结合滴定检测水体中的COD，进而评价上述菌株对水体中有机质的降解能力，结果如表1所示。
表1潜在目的菌株对有机质的降解能力
注：+表示有机质的降解能力。
由表1的结果可知，本发明筛选到的五株菌都可以有效降低实验室污水的COD，从而说明所述五株菌菌可有效降解水体中的有机质，其中CD03菌株对有机质的降解能力最强。
4、菌株的鉴定
将菌株CD03接种于MRS液体培养基中，30℃培养18h，转速为160r/min；将菌液梯度稀释后涂布于MRS平板，挑选长势良好单菌落进行鉴定。
(1)菌株CD03生物学特性：显微镜下观察呈单个、菌体为球形且无菌膜、无鞭毛、无芽孢、直径约0.3～1.0μm；在MRS平板上生长良好，为革兰氏阳性菌，兼性厌氧。
(2)生理生化鉴定
参照东秀珠等(2001)《常见细菌系统鉴定手册》、RE布坎南等(1984)《伯杰氏细菌鉴定手册》和凌代文主编的《乳酸菌分类鉴定和实验方法》中的生理生化实验，对所获得的活性菌株CD03进行生理生化实验以鉴定其种属，结果见表2。
表2菌株CD03的部分生理生化特征
(3)分子鉴定
将CD03菌株用MRS肉汤培养基活化培养至对数生长期，使用细菌DNA基因组提取试剂盒提取CD03菌株的基因组DNA。利用提取的基因组DNA为模板，对CD03菌株的16S rDNA进行PCR扩增，得到的PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，并进行测序。将测序所得的基因序列在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对分析，可以看出CD03菌株与粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的序列同源性达到98.6％。
结合CD03菌株的形态特征、生理生化特征和分子鉴定结果，申请人确定CD03菌株为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，命名为粪肠球菌CD03(Enterococcus faecalisCD03)，已于2020年4月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2020089。
实施例2粪肠球菌CD03对实验室养殖污水的净化效果
将CD03菌株用MRS肉汤培养基活化培养至对数生长期，将菌液高速离心获得菌体，用pH为7.4的PBS清洗菌体，并调节菌体浓度到1.0×1010CFU/ml。将上述菌液进行梯度稀释，得到菌体浓度分别为1.0×104CFU/ml，1.0×105CFU/ml，1.0×106CFU/ml，1.0×107CFU/ml，1.0×108CFU/ml，1.0×109CFU/ml的菌液，按照1:100体积比例将上述不同浓度的菌液加入到200ml实验室养殖污水中(初始COD值为220mg/L)，室温下静置24h后，分别检测水体中的终止COD值，计算出有机质降解率，结果如表3所示。
有机质降解率＝(初始COD值-终止COD值)/初始COD值×100％。
表3不同浓度的粪肠球菌CD03菌液对实验室养殖污水的净化效果
由表3可知，按照1：100体积比例将菌液和实验室污水混合，当菌液浓度超过1.0×107CFU/ml，即实际工作浓度超过1.0×105CFU/ml时，粪肠球菌CD03即可高效去除实验室污水中的有机质，有机质降解率高于90％，效果显著。
实施例3粪肠球菌CD03在污染海水净化中的应用
1、菌粉的制备
将粪肠球菌CD03进行活化，扩大培养，经液态发酵、离心、浓缩、冻干，制成活菌含量约为1010CFU/g的菌粉。
2、实验过程
将取自山东沿海某生活排污口附近海域的海水，等量倒入6个大小相同的水族箱，每个水族箱中的海水量约150L，对照组和实验组各3个平行，分别检测各组水体中的初始COD值。然后按终浓度为1.0×105CFU/ml的比例向实验组水体中添加上述粪肠球菌CD03菌粉，对照组不添加。实验水温为26～28℃，实验期间使用相同设备往水体内不间断曝气。24h后分别测定水体中的终止COD值，将3个平行组的检测值取平均值，用于计算有机质降解率，具体结果见表4。
有机质降解率＝(初始COD值-终止COD值)/初始COD值×100％。
表4粪肠球菌CD03对污染海水的净化效果
从表4的实验结果可知，添加粪肠球菌CD03菌粉处理24h后，实验组污染海水中有机质降解率高达85.58％，远远高于对照组。海水污染是水产动物疾病发生的重要原因之一，也是水产养殖面临的一个难题。本发明提供的粪肠球菌CD03能有效降低污染海水的COD，对有机质的降解效果显著，可以用于解决水产养殖中因水体污染过高而导致的一系列问题。
实施例4粪肠球菌CD03的耐酸耐碱性能
将粪肠球菌CD03菌种接种于液体MRS培养基，经过24h培养活化后，再分别接种于pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH5.0、pH6.5、pH7.0、pH8.5、pH9.5等8种不同pH的液体培养基中，连续培养24h，然后用倍比稀释培养法检测。
结果显示：粪肠球菌CD03菌株的最适宜生长pH为7.5，但在pH3.0到pH9.5范围内均能有效生长，只是生长能力受到不同程度的抑制。其中，在pH7.5条件下培养24h后，活菌数高达3.3×1010CFU/ml，而在pH3.0条件下培养活菌数仅为约105CFU/ml，在pH9.5条件下培养活菌数约为2.8×1010CFU/ml。由此可见，本发明提供的粪肠球菌CD03具有很强的耐酸、耐碱能力，效果显著。
实施例5粪肠球菌CD03对常见水产致病菌的抑制作用
申请人以南美白对虾养殖中常见的副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)为指示菌，检测粪肠球菌CD03对致病菌的拮抗作用。
将指示菌分别接种于营养肉汤培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，pH7.2-7.4)，30℃恒温培养24h备用。将粪肠球菌CD03接种于MRS液体培养基中，30℃恒温培养24h备用。用乳酸调MRS液体培养基的pH值，使其与粪肠球菌CD03发酵液的pH值相同，将其作为对照。用无菌涂布器将0.1mL指示菌培养液均匀涂抹在固体LB培养基上，待平板干后用金属管均匀地打孔，孔径为10mm±0.1mm，再用无菌镊子将孔内琼脂块挑出，然后用热玻棒封底。在各孔中分别加入粪肠球菌CD03发酵液和对照液，30℃培养24h，观察有无抑菌环，并测定对照与粪肠球菌CD03发酵液的抑菌直径，具体结果见表5。
表5粪肠球菌CD03的抑菌效果
从表5的数据可以看出，本发明提供的粪肠球菌CD03菌液对致病菌副溶血弧菌和哈维氏弧菌都有较强的抑制作用，抑菌圈直径超过2cm，其中该菌株对副溶血弧菌的抑制作用更强，取得了意料不到的技术效果。
实施例6粪肠球菌CD03对南美白对虾生长、免疫及抗病力的影响
实验设对照组和实验组，每组分别设置三个平行。每个平行南美白对虾30尾(初始体重3.20±0.08)。其中，对照组为以酪蛋白和明胶为蛋白源的半精制饲料为基础饲料，益生菌组是在基础饲料中按2.51‰的质量比添加实施例3所述粪肠球菌CD03菌粉(1010CFU/g)，混合均匀投喂南美白对虾。养殖实验在室内海水系统开展，共进行6周，每天投饵一次，每天换水50％，海水盐度28-30ppt，pH 8.0±0.3，水温22-25℃，溶氧充足。
养殖实验结束后，对南美白对虾进行计数并称重，计算其增重率、特定生长率。每个平行中随机取6尾南美白对虾，注射器吸取南美白对虾血液，1:1加入抗凝剂，取一部分抗凝血液直接用于计数血细胞，测定吞噬活性、呼吸爆发活力；另一部分抗凝血液离心10min(3000×g，4℃)收集血细胞沉淀，继而超声破碎后，再次离心10min(3000×g，4℃)所得上清液为血细胞破碎上清液(CLS)，用于酚氧化酶(PO)活力和酸性磷酸酶(ACP)活力的测定。以副溶血弧菌弧菌为病原菌，肌肉注射南美白对虾，进行2周的观察，统计累积死亡率，具体结果见表6。
表6粪肠球菌CD03对南美白对虾生长、免疫及抗病力的影响
注：不同的字母表示差异显著(P＜0.05)。
从表6的结果可以看出，与对照组相比，添加了粪肠球菌CD03的益生菌组中南美白对虾的增重率、特定生长率、细胞密度、吞噬活性、呼吸爆发活力、酚氧化酶活力和酸性磷酸酶活性分别提高了31.9％、21.9％、32.2％、60.1％、13.8％和10.2％，而累计死亡率下降了46.6％。从而说明本发明所述粪肠球菌CD03对南美白对虾的生长有显著的促进作用，并且可以有效提高南美白对虾的免疫力及对副溶血弧菌的抵抗能力，因此可以作为益生菌广泛应用于南美白对虾的养殖生产过程中。
此外，本发明提供的粪肠球菌CD03还可以应用于鱼类、虾蟹等水产动物的饲料中，能够使水产动物的主要免疫指标值普遍提高18-35％，全周期存活率提高22-39％，生长率提高17-29％，饲料系数降低9-15％。
综上，本发明提供的粪肠球菌CD03耐酸、耐碱性强，能有效解决养殖水体污染的问题，还能有效抑制病原菌，减少南美白对虾等水产动物疾病发生的几率。同时，粪肠球菌CD03还能作为饲料添加剂，在显著提高养殖动物对饲料的利用率的同时，促进养殖动物生长，有助于提高水产养殖户的经济效益。所述粪肠球菌可单独使用，还可以与地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、双歧杆菌、屎肠球菌、乳酸片球菌、嗜酸乳杆菌中的任意一种或两种或多种进行组合制备复合微生态制剂，广泛应用于水质净化和水产饲料领域，应该前景广阔。
