一种高耐盐性乳酸菌发酵生产酱油的方法
技术领域
本发明涉及食品发酵工程技术领域，具体涉及一种高耐盐性乳酸菌发酵生产酱油的方法。
背景技术
酱油是我国的传统发酵调味品，是一种以大豆、小麦、麸皮等为原料，由多种微生物共同作用经长期发酵而形成的具有独特风味的调味品。酱油已经是日常生活中不可或缺的调味品之一，人们对于酱油的滋味、香气的要求也越来越高。
乳酸菌已经应用于酱油发酵过程中，不同的乳酸菌能分解酱油中不同的氨基酸，酱油乳酸菌中的代表性的有嗜盐片球菌、酱油微球菌和植物乳杆菌等。这些乳酸菌耐乳酸的能力不太强，因此不会产过量乳酸使得酱醅pH过低而造成酱醅质量下降。但是酱油酿造过程中盐浓度较高，高盐浓度是乳酸菌发酵过程中的一个主要环境应力。不同的乳酸菌的耐盐能力不同，在酱油发酵过程中，即使是耐盐性较高的乳酸菌也无法避免随着发酵而活菌数降低的问题。
溶液盐浓度增加会导致溶液的渗透压升高，而菌体为维持正常膨压，往往会启动自身的抗逆保护性物质，这类物质被称为相容性溶质。相容性物质是嗜盐菌中的重要抗逆保护性物质，然而实际生产中并没有通过添加相容性溶质有效提高发酵过程中乳酸菌的耐盐性的应用，是为了防止增加发酵产品的毒性。尤其是人们日常生活中酱油的摄入量较多且长时间持续摄入，因此酱油发酵过程中对于添加物质更要谨慎，避免对人体健康造成不良影响。专利CN%20105361062%20B公开了一种提高乳杆菌耐盐能力的方法，通过在发酵物中添加四氢嘧啶、甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸或脯氨酸进行发酵，可使乳酸菌在在盐亚致死浓度下活菌数提高1倍左右，但是酱油中添加的氨基酸和嘧啶摄入量过多，可能会对人体造成一定的毒性，或者影响人体免疫力，安全性仍存在一定的问题。现有的筛选高耐盐性乳酸菌菌株的方法，工作量大，且成本较高。因此，需要找到一种更加安全的提高乳酸菌耐盐性的方法，使得在酱油酿造过程中乳酸菌菌株能够存活，即能够适应酱油酿造工艺，能够在高盐含量环境中存活，从而能满足不同酱油酿造工艺的使用需要。
发明内容
为了解决现有的技术问题，本发明提供了一种高耐盐性乳酸菌发酵生产酱油的方法，通过制备乳酸菌相容性溶质，并添加至酱油发酵过程中，实现提高乳酸菌耐盐性，并缩短酱油发酵时间，改善酱油的品质及风味。
本发明的技术方案是：一种高耐盐性乳酸菌发酵生产酱油的方法，包括以下步骤：
S1、混合培养基配置，配置含盐量10％的MRS液体培养基，在培养基中添加相容性溶质组合物并混合均匀，得到混合培养基，相容性溶质组合物在混合培养基中的浓度为6～10g/L；
所述相容性溶质组合物包括氨基酸组合物和酶组合物，氨基酸组合物包括脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和色氨酸中的至少两种，酶组合物包括谷氨酰胺转氨酶、乳酸脱氢酶和磷酸果糖激酶中的至少一种；相容性溶质组合物中氨基酸组合物和酶组合物的质量比为(1.5～3):1；所述氨基酸组合物中，按重量比计算，脯氨酸：丙氨酸：天冬氨酸：苏氨酸：色氨酸为1:(0.3～0.8):(0～0.8):(0～0.5):(0～0.3)；所述酶组合物中，按重量比计算，谷氨酰胺转氨酶:乳酸脱氢酶:磷酸果糖激酶为1:(0～0.5):(0～0.3)；
S2、预培养，将培养至对数期的乳酸菌接种至混合培养基中，30～35℃恒温培养24～72h；
所述乳酸菌包括嗜盐片球菌、酱油微球菌、乳酸乳球菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌，按重量比计算，嗜盐片球菌：酱油微球菌：乳酸乳球菌：乳酸片球菌：植物乳杆菌为1:(0.5～1):(0.3～0.5):(0.2～0.5):(0.3～0.8)；
S3、收集乳酸菌菌体，将预培养之后的乳酸菌进行离心收集，得到乳酸菌菌体，并使用0.075M的PBS缓冲液冲洗3次，弃上清；
离心收集的转速为6000rpm，时间为10～20min，温度为4～10℃；PBS缓冲液的体积与乳酸菌菌体的质量比为(50～80)ml:1g；
S4、收集耐盐性应答反应物质，将洗涤后的乳酸菌菌体进行超声破碎，离心收集超声破碎后的上清液，进行膜过滤除菌，得到耐盐性应答反应物质；
超声破碎的功率为300～350W，超声5s，停止5s，超声时间为30～50min；收集超声破碎后的上清液的离心转速为12000～15000rpm，时间为10～15min，温度为4～10℃；膜过滤孔径为0.22μm；
S5、制曲，将小麦炒制后，进行破碎制成小麦粉，豆粕进行润水；豆粕润水后进行连续蒸料，蒸料温度为130℃，时间为5～15min；将蒸好的豆粕与小麦粉按重量比(1.2～1.6):1进行混合，同时添加乳酸，调节豆粕和小麦粉混合物的pH为5.5～6.0，之后接入米曲霉，入池发酵制得醅曲；
S6、制酱醪，将制好的醅曲与浓度为20～25g/100ml的盐水进行混合，然后泵入发酵罐，制得酱醪，醅曲与盐水的重量比为1:(1.5～1.8)；
S7、发酵，将S4制备的耐盐性应答反应物质、乳酸菌发酵菌株和酵母添加到发酵罐中，进行发酵，发酵温度保持15～20℃，发酵时间为10天，然后升温至27～30℃，发酵60天，再降温至20～25℃，发酵10天，得到成熟酱醪；
所述耐盐性应答反应物质、乳酸菌发酵菌株、酵母和酱醪的质量比为1:(28～35):(300～500):(1000～12000)；所述乳酸菌发酵菌株包括嗜盐片球菌、酱油微球菌、乳酸乳球菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌中的至少一种；所述酵母为鲁氏酵母和球似酵母的混合酵母菌粉，按重量比计算，鲁氏酵母：球似酵母为(5～6):(1～2)；
S8、压榨灭菌，将成熟酱醪按照压榨工序进行压榨得到生酱油，生酱油经硅藻土和微孔膜过滤后，再进行灭菌，灭菌后移入沉淀罐中静置存放，沉淀30天，进行分装；
所述硅藻土的细度为10#，95℃；微孔膜的粒径为0.45μm；灭菌温度为95℃，灭菌时间为20～30min。
当培养基中含盐量较高时，细胞外渗透压升高，乳酸菌通过积累相容性溶质组合物来维持细胞正常的渗透压，改变糖酵解代谢途径等调节胞内代谢平衡，维持乳酸菌的正常生长，以实现乳酸菌提高耐盐性。本发明中采用高盐培养基预培养乳酸菌，使得乳酸菌诱导产生一系列的胁迫应答反应，激活参与乳酸菌相关代谢途径的各种酶类及相关物质，将乳酸菌中这些与耐盐性相关的被激活的物质，即耐盐性应答反应物质，进行收集，并用于酱油发酵过程中，显著提高乳酸菌的耐盐性，从乳酸菌中提取，安全，无毒无害，且防止酱油中额外添加的氨基酸等物质含量过多而对人体造成不良影响。本发明通过相容性溶质组合物增加乳酸菌耐盐性，使得酱油发酵时间显著缩短，且风味和品质更好。
采用上述技术方案，本发明实现的有益效果如下：
(1)本发明通过高盐培养基预培养乳酸菌，超声破碎收集耐盐性应答反应物质，并用于酱油发酵过程中，食品安全性高，避免过多添加物对人体造成不良影响，显著增强乳酸菌的耐盐性，显著缩短酱油发酵时间，改善酱油的风味和品质。
(2)原料易得，制备方法简单，有利于生产应用。
(3)不需要筛选新的菌种，即可实现乳酸菌的高耐盐性，耗时短，大量节省了人力物力，成本低。
(4)将生酱油经硅藻土和微孔膜过滤后，再进行灭菌，存放沉淀，得到酱油成品，硅藻土和微孔膜过滤可以将生酱油中的部分杂质去除，且能将部分耐盐性应答反应物质进行过滤、吸附，进一步减少最终的酱油成品中的添加物质，使得酱油对于人体更加安全。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
一种高耐盐性乳酸菌发酵生产酱油的方法，包括以下步骤：
S1、混合培养基配置，配置含盐量10％的MRS液体培养基，在培养基中添加相容性溶质组合物并混合均匀，得到混合培养基，相容性溶质组合物在混合培养基中的浓度为8g/L；
所述相容性溶质组合物包括氨基酸组合物和酶组合物，相容性溶质组合物中氨基酸组合物和酶组合物的质量比为2:1；氨基酸组合物包括脯氨酸、丙氨酸和天冬氨酸，质量比为1:0.5:0.3；酶组合物包括谷氨酰胺转氨酶和乳酸脱氢酶，质量比为1:0.2；
S2、预培养，将培养至对数期的乳酸菌接种至混合培养基中，33℃恒温培养36h；
所述乳酸菌包括嗜盐片球菌、酱油微球菌、乳酸乳球菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌，按重量比计算，嗜盐片球菌：酱油微球菌：乳酸乳球菌：乳酸片球菌：植物乳杆菌为1:0.8:0.4:0.3:0.5；
S3、收集乳酸菌菌体，将预培养之后的乳酸菌进行离心收集，得到乳酸菌菌体，并使用0.075M的PBS缓冲液冲洗3次，弃上清；
离心收集的转速为6000rpm，时间为15min，温度为6℃；PBS缓冲液的体积与乳酸菌菌体的质量比为70ml:1g；
S4、收集耐盐性应答反应物质，将洗涤后的乳酸菌菌体进行超声破碎，离心收集超声破碎后的上清液，进行膜过滤除菌，得到耐盐性应答反应物质；
超声破碎的功率为330W，超声5s，停止5s，超声时间为40min；收集超声破碎后的上清液的离心转速为13000rpm，时间为13min，温度为6℃；膜过滤孔径为0.22μm；
S5、制曲，将小麦炒制后，进行破碎制成小麦粉，豆粕进行润水；豆粕润水后进行连续蒸料，蒸料温度为130℃，时间为10min；将蒸好的豆粕与小麦粉按重量比1.4:1进行混合，同时添加乳酸，调节豆粕和小麦粉混合物的pH为5.8，之后接入米曲霉，入池发酵制得醅曲；
S6、制酱醪，将制好的醅曲与浓度为23g/100ml的盐水进行混合，然后泵入发酵罐，制得酱醪，醅曲与盐水的重量比为1:1.6；
S7、发酵，将S4制备的耐盐性应答反应物质、乳酸菌发酵菌株和酵母添加到发酵罐中，进行发酵，发酵温度保持18℃，发酵时间为10天，然后升温至28℃，发酵60天，再降温至23℃，发酵10天，得到成熟酱醪；
所述耐盐性应答反应物质、乳酸菌发酵菌株、酵母和酱醪的质量比为1:30:400:11000；所述乳酸菌发酵菌株包括酱油微球菌和植物乳杆菌中，质量比为1:2；所述酵母为鲁氏酵母和球似酵母的混合酵母菌粉，按重量比计算，鲁氏酵母：球似酵母为5:2；
S8、压榨灭菌，将成熟酱醪按照压榨工序进行压榨得到生酱油，生酱油经硅藻土和微孔膜过滤后，再进行灭菌，灭菌后移入沉淀罐中静置存放，沉淀30天，进行分装；
所述硅藻土的细度为10#，95℃；微孔膜的粒径为0.45μm；灭菌温度为95℃，灭菌时间为25min。
实施例2
一种高耐盐性乳酸菌发酵生产酱油的方法，包括以下步骤：
S1、混合培养基配置，配置含盐量10％的MRS液体培养基，在培养基中添加相容性溶质组合物并混合均匀，得到混合培养基，相容性溶质组合物在混合培养基中的浓度为10g/L；
所述相容性溶质组合物包括氨基酸组合物和酶组合物，相容性溶质组合物中氨基酸组合物和酶组合物的质量比为3:1；氨基酸组合物包括脯氨酸和丙氨酸，质量比为1:0.8；酶组合物为谷氨酰胺转氨酶；
S2、预培养，将培养至对数期的乳酸菌接种至混合培养基中，30℃恒温培养72h；
所述乳酸菌包括嗜盐片球菌、酱油微球菌、乳酸乳球菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌，按重量比计算，嗜盐片球菌：酱油微球菌：乳酸乳球菌：乳酸片球菌：植物乳杆菌为1:0.5:0.3:0.5:0.3；
S3、收集乳酸菌菌体，将预培养之后的乳酸菌进行离心收集，得到乳酸菌菌体，并使用0.075M的PBS缓冲液冲洗3次，弃上清；
离心收集的转速为6000rpm，时间为20min，温度为4℃；PBS缓冲液的体积与乳酸菌菌体的质量比为50ml:1g；
S4、收集耐盐性应答反应物质，将洗涤后的乳酸菌菌体进行超声破碎，离心收集超声破碎后的上清液，进行膜过滤除菌，得到耐盐性应答反应物质；
超声破碎的功率为300W，超声5s，停止5s，超声时间为30min；收集超声破碎后的上清液的离心转速为12000rpm，时间为10min，温度为4℃；膜过滤孔径为0.22μm；
S5、制曲，将小麦炒制后，进行破碎制成小麦粉，豆粕进行润水；豆粕润水后进行连续蒸料，蒸料温度为130℃，时间为15min；将蒸好的豆粕与小麦粉按重量比1.2:1进行混合，同时添加乳酸，调节豆粕和小麦粉混合物的pH为6.0，之后接入米曲霉，入池发酵制得醅曲；
S6、制酱醪，将制好的醅曲与浓度为25g/100ml的盐水进行混合，然后泵入发酵罐，制得酱醪，醅曲与盐水的重量比为1:1.5；
S7、发酵，将S4制备的耐盐性应答反应物质、乳酸菌发酵菌株和酵母添加到发酵罐中，进行发酵，发酵温度保持15℃，发酵时间为10天，然后升温至30℃，发酵60天，再降温至25℃，发酵10天，得到成熟酱醪；
所述耐盐性应答反应物质、乳酸菌发酵菌株、酵母和酱醪的质量比为1:35:300:1000；所述乳酸菌发酵菌株为嗜盐片球菌；所述酵母为鲁氏酵母和球似酵母的混合酵母菌粉，按重量比计算，鲁氏酵母：球似酵母为6:1；
S8、压榨灭菌，将成熟酱醪按照压榨工序进行压榨得到生酱油，生酱油经硅藻土和微孔膜过滤后，再进行灭菌，灭菌后移入沉淀罐中静置存放，沉淀30天，进行分装；
所述硅藻土的细度为10#，95℃；微孔膜的粒径为0.45μm；灭菌温度为95℃，灭菌时间为30min。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于删除S1-S4，从S5开始，S7为发酵，将相容性溶质组合物、乳酸菌发酵菌株和酵母添加到发酵罐中，进行发酵，发酵温度保持15℃，发酵时间为10天，然后升温至30℃，发酵60天，再降温至25℃，发酵10天，得到成熟酱醪；
所述相容性溶质组合物、乳酸菌发酵菌株、酵母和酱醪的质量比为1:35:300:1000；所述乳酸菌发酵菌株为嗜盐片球菌；所述酵母为鲁氏酵母和球似酵母的混合酵母菌粉，按重量比计算，鲁氏酵母：球似酵母为6:1；
所述相容性溶质组合物包括氨基酸组合物和酶组合物，相容性溶质组合物中氨基酸组合物和酶组合物的质量比为2:1；氨基酸组合物包括脯氨酸、丙氨酸和天冬氨酸，质量比为1:0.5:0.3；酶组合物包括谷氨酰胺转氨酶和乳酸脱氢酶，质量比为1:0.2。
空白对照
空白对照与实施例1的区别在于删除S1-S4，从S5开始，且S7中不添加耐盐性应答反应物质。
一、乳酸菌耐盐性分析试验
从实施例1、实施例2、对比例1、空白对照中步骤S7发酵的样品中各取0.5ml样液，取样，取样时间分别为发酵第10天、发酵第70天、发酵第80天，取样后加入4.5ml省力盐水，依次进行梯度稀释，稀释倍数为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，取合适的稀释梯度进行涂平板，每个梯度三次重复，计活菌数，结果如表1所示。
表1乳酸菌在酱油发酵过程中的活菌数(cfu/cm3)。
从表1结果可以看出，空白对照组和对比例1在发酵10天、第70天、第80天时，乳酸菌的活菌数均较少，而实施例1和实施例2的乳酸活菌数均较多，且数量增加速度快，说明实施例1和实施例2在酱油发酵过程中增殖速度快，活菌数多，进而说明实施例1和实施例2中乳酸菌的耐盐性高。
二、乳酸菌对酱油发酵时间的影响的试验
在酱油发酵过程中，分别对总酸、氨基态氮、还原糖含量进行测定，结果如表2-表4所示。其中发酵第71-120天的发酵条件相同。
表2酱油发酵过程中总酸含量(g/100ml)
表3酱油发酵过程中氨基态氮含量(g/100ml)
表4酱油发酵过程中还原糖含量(g/100ml)
从表2结果可以看出，酱油发酵过程中，实施例1和实施例2总酸含量和氨基态氮含量逐渐上升，还原糖含量逐渐减少，在第80天平稳；而对比例和空白对照在第50-70天逐渐平稳，且实施例1和实施例2的总酸含量、氨基态氮含量较高，还原糖含量较低，可能是因为实施例1和实施例2中乳酸菌更快的进行增殖、发酵，且乳酸菌活性高，数量多，发酵效果更好，所以产生乳酸更多，产生的氨基态氮含量更多，代谢的还原糖量更多，导致总酸量和氨基态氮量较高，且增长速度快，且还原糖量较少，且减少速度快。且实施例1和实施例2的总酸含量在1.1g/100ml以下，在第80天的氨基态氮含量达到1.10g/100ml左右，符合国标对总酸含量的要求，且氨基态氮含量显著高于一级酱油标准，说明酱油质量较好。
本公司通过空白对照组的方法进行发酵时，为了使发酵效果更好，酱油的品质更高，通常增加发酵时间，一般选择发酵100天。此外，从表2-4结果可以看出，空白对照组发酵在100天左右的时候，总酸、氨基态氮和还原糖的含量更稳定，发酵过程中的数值相对更好，且随着发酵时间的延长，含量的变化很小。因此，本发明的方法生产酱油，通过增加乳酸菌的耐盐性，并将其应用到酱油发酵过程中，可减少酱油的发酵时间。
此外，实施例1和实施例2中发酵80天的酱油的氨基态氮含量更高，提升酱油的鲜味，还原糖的含量保持在2～2.5g/100ml，使得酱油具有一定的甜味，使得酱油整体的口味鲜甜合适。
三、发酵后的酱油中组胺和酪胺的含量测定试验
分别取实施例1、实施例2、对比例1、空白对照发酵第80天的成熟酱醪的上清液，测定组胺和酪胺的含量，结果如表5所示。
表5成熟酱醪中组胺和酪胺含量(mg/L)
从表5可知，实施例1和实施例2的酱油成熟酱醪中组胺和酪胺的含量比对比例1和空白对照的含量低，说明实施例1和实施例2中提高乳酸菌耐盐性并用于发酵酱油的方法是安全的，不会增加组胺和酪胺这两种有害物质的量，可用于酱油发酵生产，且产物质量高。
四、酱油感官评价
分别取20ml实施例1、实施例2、对比例1、空白对照生产的酱油放置于50ml干净小烧杯中，然后由20名专业鉴评人员从色泽、香气、口感方面进行评鉴分析，具体结果如表6所示。
表6酱油的感官评价效果
从表6结果可知，实施例1和实施例2生产的酱油比对比例1、空白对照组的酱油更加鲜甜可口，颜色更红亮、有光泽，说明实施例1和实施例2可以改善酱油的风味和品质。
