一种水禽生物发酵饲料的研究方法
技术领域
本发明涉及水禽生物发酵饲料技术领域，具体为一种水禽生物发酵饲料的研究方法。
背景技术
粗饲料经过微生物发酵而制成的饲料为发酵饲料，粗饲料中富含纤维素，半纤维素，果胶物质，木质素等粗纤维和蛋白质，但难以被动物直接消化吸收，动物吃了会增加肠道负担，引起肠道疾病，该产品不但可以弥补常规饲料中容易缺乏的氨基酸，而且能使其它粗饲料原料营养成份迅速转化，达到增强消化吸收利用效果。
针对水禽生产中养殖环境污染，养殖中即将禁用的饲用抗生素等问题，水禽生物发酵饲料的开发具有广阔前景。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种水禽生物发酵饲料的研究方法，解决了水禽生产中养殖环境污染、养殖中即将禁用的饲用抗生素的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种水禽生物发酵饲料的研究方法，包括以下步骤：
S1发酵饲料配比
根据鸭营养需要，结合非常规饲料原料的开发利用，确定发酵饲料原料组成为玉米48％、麸皮12％、豆粕32％、菜粕8％；
S2菌群获取
芽孢杆菌和乳酸杆菌均从鸡粪、猪粪、鸭粪、鹅粪、发酵豆粕、发酵饲料和酸奶中初筛，根据溶钙圈与菌株直径比大的挑选，进行十次的接种，观察稳定性获得不同来源各20株菌，酵母菌从高活性干酵母粉中培养获得；
S3各菌生长特性测定
为了获得最终用于混合饲料发酵的各菌种的最佳种龄，进行了各菌种生长特性的测定；
S4混合饲料发酵条件确定
通过对不同含水、不同接种量以及菌种不同比例进行分批的梯度实验来获取最佳饲料发酵条件；
S5 Plackett-Burman试验设计
通过对S4获取的数据进行分析，以酸溶蛋白为指标，获取PH、含水量和温度的方程式，为实际生产提供依据。
(三)有益效果
本发明提供了一种水禽生物发酵饲料的研究方法。具备以下有益效果：
1、本发明，间接从牲畜中筛选和培育芽孢杆菌和乳酸杆菌，并以通过各种实验来获取饲料的最佳的发酵数据，可有效降低水禽在生产中养殖环境的污染和避免养殖中即将禁用的饲用抗生素的问题。
2、本发明，利用Plackett-Burman工具对不同实验的综合分析，使得在饲料配比和各菌比例确定下，获取PH、含水量和温度的方程式，为实际生产提供科学依据，提高发酵饲料的质量的同时，降低发酵饲料的生产成本。
附图说明
图1为本发明的各菌种生长曲线示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
如图1所示，一种水禽生物发酵饲料的研究方法，包括以下步骤：
S1发酵饲料配比
根据鸭营养需要，结合非常规饲料原料的开发利用，确定发酵饲料原料组成为玉米48％、麸皮12％、豆粕32％、菜粕8％；
S2菌群获取
2.1：芽孢杆菌的初筛和复筛
从鸡粪、猪粪、鹅粪、纳豆、发酵豆粕、发酵饲料中初筛，根据溶蛋白圈直径大的挑选，进行十次的接种，观察稳定性获得不同来源各20株。
初筛选取的芽孢杆菌株再次挑选，每种动植物各选取4个菌株，进行中性蛋白、酸性蛋白、纤维素酶和a-淀粉酶的测定。根据测定值选取酶活较高的菌种，进行划线培养，挑选单菌落进行耐高温(40℃、50℃、60℃)和耐酸(PH＝3、4、5、6、7)测定。筛选的芽孢杆菌为鸡硬3菌株，具体结果详见表1和表2；
表1芽孢杆菌酶活测定
表2芽孢杆菌耐酸、耐高温测定
2.2：乳酸杆菌的初筛和复筛
从鸡粪、猪粪、鸭粪、鹅粪、发酵豆粕、发酵饲料和酸奶中初筛，根据溶钙圈与菌株直径比大的挑选，进行十次的接种，观察稳定性获得不同来源各20株菌。
将筛选下来的菌根据溶钙圈与菌种直径比值大的，每种来源挑4个菌进行划线培养，挑单菌落进行液体培养，培养48h后进行PH测定。本实验中筛选的菌株来源于植物乳杆菌酸奶3，结果详见表3；
表3不同源乳酸菌PH值测定
2.3：酵母菌
从高活性干酵母粉中培养获得酵母菌；
S3各菌生长特性测定
为了获得最终用于混合饲料发酵的各菌种的最佳种龄，进行了各菌种生长特性的测定。将复筛留下的芽孢杆菌(鸡硬3)、乳酸菌(酸奶3)及酵母菌进行划线培养，选择单菌落进行液体培养。先配制100ml种子液体培养基、MRS液体培养基、土豆液体培养基分别取5ml分装到试管中，适量挑取芽孢杆菌、植物乳杆菌、酵母菌单个菌种接种于分装好的试管中，振荡摇匀，芽孢杆菌37℃和酵母菌28℃于振荡器中振荡12h，厌氧条件下植物乳杆菌放于37℃培养箱静置12h。在分装好的试管上标记0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h。将培养好的菌液分别吸取50μl于标记好的试管中，芽孢杆菌37℃、酵母菌28℃放于振荡器中，厌氧条件下植物乳杆菌静置于37℃培养箱中，分别按时间取出测量吸光度值。以时间为横座标，吸光度为纵座标绘制生长曲线。
由图1可知，芽孢杆菌0-10h为菌体快速生长期，10-12h菌体出现负增长，12-20h又出现快速生长，20h后菌体进入生长衰亡期，20h菌体数量达最高值。乳酸菌0-2h为菌体生长延滞期，2-12h为菌体快速生长期，12h后进入菌体生长衰亡期，12h为菌体数量最高值。酵母菌0-2h为菌体生长延滞期，2-8h为菌体快速生长期，8-10h菌体生长速度变慢，10-12h又恢复快速生长，12h为菌体数量最高值；
S4混合饲料发酵条件确定
4.1：不同含水量对混合饲料发酵效果的影响
将混合好的饲料(由玉米、麸皮、豆粕、菜粕组成)pH值调整为7.02，以同等质量分装至5个密封袋中，按照实验设计向全部袋中都加入10％(20ml)的菌液后，分别朝袋中加入40％(60ml)、50％(80ml)、60％(100ml)、70％(120ml)、80％(140ml)的超纯水，搅拌均匀后密封好，置于35℃的恒温培养箱中培养3天。上述所用菌液为复筛选出的芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌的培养24小时的菌液。于发酵后24h、48h、72h取样测定ph值、酸溶蛋白及还原糖；
表4不同含水量对芽孢杆菌发酵效果的影响
表5不同含水量对乳酸菌发酵效果的影响
表6不同含水量对酵母菌发酵效果的影响
4.2：不同接种量对混合饲料发酵效果的影响
将混合好的饲料pH值调整为7.02，以同等质量分装至6个密封袋中，按照实验设计朝接种量为5％的袋中加入10ml的菌液以及110ml的超纯水，接种量为10％的袋中加入20ml的菌液以及100ml的超纯水，接种量为15％的袋中加入30ml的菌液以及90ml的超纯水，接种量为20％的袋中加入40ml的菌液以及80ml的超纯水，接种量为25％的袋中加入50ml的菌液以及70ml的超纯水，接种量为30％的袋中加入60ml的菌液以及60ml的超纯水，搅拌均匀密封好置于35℃恒温培养箱中发酵3天。以上每种接种量饲料水分含量均相同，均为60％。于发酵后24h、48h、72h采样测定ph值、酸溶蛋白及还原糖；
表7不同接种量对芽孢杆菌发酵效果的影响
表8不同接种量对酵母乳酸菌发酵效果的影响
表9不同接种量对酵母菌发酵效果的影响
4.3：菌种不同比例对混合饲料发酵效果的影响
将复筛留下的各类菌种进行划线培养，选择单菌落进行液体培养(植酸乳杆菌培养24h，酵母菌和芽孢杆菌培养12h)，将培养好的菌液离心(3500r/min转8min)，倒出培养液，并用生理盐水离心洗涤两次后，继续加生理盐水震荡混匀。将混合好的饲料pH值调整为7.02(用稀氢氧化钠)，将样以同等质量分装至9个密封袋中，按照实验设计(正交设计)各袋中菌种接种量均为10％，但按表10的比例分配三种菌的比例，加入菌液及超纯水后，搅拌均匀密封好置于35℃恒温培养箱中发酵3天。于发酵后72h采样测定酸溶蛋白含量。结果见表11；
表10发酵过程中三种菌的比例
表11菌种不同比例对发酵效果的影响
根据含水量、接种量及菌种比例试验，确定生物发酵饲料最适含水量为50％、接种量为10％、芽孢杆菌：酵母菌：乳酸菌为3:1:2；
S5 Plackett-Burman试验设计
为了确定影响发酵效果的最关键的影响因素，将温度、水分、接种量、pH、菌种比等因素设置不同的梯度，结果表明以上因素中含水量、pH和温度是影响发酵效果的主要因素。具体结果见表12、表13；
表12Plackett-Burman试验设计及响应值
表13 Plackett-Burman试验设计回归分析结果
根据以上确定的含水量、pH和温度是影响发酵效果的主要因素，通过响应面试验以确定最适的含水量、pH和温度。以酸溶蛋白为主要指标，以还原糖为辅助指标得出最佳的反应条件为pH 7.200,含水量50.235％，培养温度40℃。并得出酸溶蛋白与含水量、pH和温度的方程式为：
酸溶蛋白＝-2.38952+0.30487*ph+0.029587*含水量+0.13388*温度。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
