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敲除猪异种抗原的基因的gRNA及其应用

2020-10-26 13:49:15

　　敲除猪异种抗原的基因的gRNA及其应用

　　技术领域

　　本申请涉及生物医药领域，具体的涉及特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA及其应用。

　　背景技术

　　目前，细胞、组织和/或器官移植是许多疾病(包括肾、心、肺、肝和其他器官疾病或皮肤损伤)的常规治疗选择。为了克服缺乏足够的移植物、无法满足临床需求的问题，出现了将来源于一种物种(例如，猪)的移植物移植到另一物种(例如，人类)的异种移植。但是，使用标准的未修饰的异种动物的移植物可能伴随严重的免疫排斥反应。

　　为了解决现有的异种移植治疗中出现的免疫排斥反应，可以通过基因编辑敲除编码某些引起免疫系统反应的蛋白的基因。

　　发明内容

　　本申请提供了一种特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，所述gRNA包含SEQ ID NO.6-7中任一项所示的核苷酸序列。本申请所述的gRNA显著提高了基因的敲除效率。使用本申请所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，可以使β4GalNT2基因的敲除效率达到至少20%以上(例如至少21%以上、22%以上、23%以上、24%以上、25%以上、26%以上、27%以上、28%以上、29%以上或更高)，与使用一种gRNA敲除相比，使用两种所述sgRNA时的敲除效率可以提高至少5%以上(例如，至少10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上40%以上、45%以上、50%以上或更高)。本申请所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA还可以和特异性靶向GGTA1和/或CMAH基因的gRNA共同用于基因敲除，可以使三个基因同时敲除的敲除效率达到至少10%以上(例如，至少11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上、16%以上、17%以上、18%以上、19%以上、20%以上、25%以上或更高)。

　　本申请还提供了编码所述gRNA的核酸分子、包括所述核酸分子或sgRNA的细胞、载体、载体转录物、试剂盒和/或系统，和根据所述gRNA制备的动物模型、细胞、组织和/或器官，以及他们的应用。

　　一方面，本申请提供了一种特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，其中所述gRNA特异性结合SEQ ID NO.1-2中任一项所示的核苷酸序列。

　　在某些实施方式中，所述gRNA包含SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列。

　　在某些实施方式中，所述gRNA包含SEQ ID NO.6-7中任一项所示的核苷酸序列。

　　在某些实施方式中，所述sgRNA包含5’-(X)n-SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列-骨架序列-3’，其中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。

　　在某些实施方式中，所述gRNA为单链向导RNA(sgRNA)。

　　另一方面，本申请提供了一种gRNA组合，其包括本申请所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，特异性靶向GGTA1基因的gRNA和特异性靶向CMAH基因的gRNA。

　　在某些实施方式中，所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA包含SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

　　在某些实施方式中，所述特异性靶向CMAH基因的gRNA包含SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。

　　另一方面，本申请提供了一种或多种分离的核酸分子，其编码本申请所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA。

　　另一方面，本申请提供了一种载体，其包含本申请所述的核酸分子。

　　在某些实施方式中，本申请的编码所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的一种和/或两种核酸分子，编码所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA的核酸分子，以及编码所述特异性靶向CMAH基因的gRNA的核酸分子位于同一载体中。

　　另一方面，本申请提供了细胞，其包含所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，所述的核酸分子，所述的载体，和/或所述的载体的体外转录产物。

　　另一方面，本申请提供了所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，所述的核酸分子，所述的载体，所述的载体的体外转录产物和/或所述的细胞在敲除β4GalNT2基因中的用途，或者在构建动物模型中的用途。

　　另一方面，本申请提供了一种β4GalNT2基因缺失细胞株，其是使用所述特异性靶向β4GalNT2基因的sgRNA，所述的核酸分子，所述的载体，所述的载体的体外转录产物和/或所述的细胞制备获得的。

　　另一方面，本申请提供了一种构建动物模型的方法，所述方法包括向动物的细胞施用至少两种特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，从而敲除β4GalNT2基因的全部或部分，其中所述gRNA特异性结合SEQ ID NO.1-2中任一项所示的核苷酸序列。

　　在某些实施方式中，所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA包含SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列。

　　在某些实施方式中，所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA包含SEQ ID NO.6-7中任一项所示的核苷酸序列。

　　在某些实施方式中，所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA包含5’-(X)n-SEQ IDNO.16所示的核苷酸序列-骨架序列-3’，其中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。

　　在某些实施方式中，所述gRNA为单链向导RNA(sgRNA)。

　　在某些实施方式中，所述方法包括以下步骤：使用一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述β4GalNT2基因内或其附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，从而使得所述β4GalNT2基因的一个或更多个外显子全部或部分缺失。

　　在某些实施方式中，所述方法还包括向动物的细胞施用特异性靶向GGTA1基因的gRNA，从而敲除GGTA1基因的全部或部分。

　　在某些实施方式中，所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA包含SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

　　在某些实施方式中，所述方法还包括向动物的细胞施用特异性靶向CMAH基因的gRNA，从而敲除CMAH基因的全部或部分。

　　在某些实施方式中，所述特异性靶向CMAH基因的gRNA包含SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。

　　在某些实施方式中，所述方法包括以下步骤：使用一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述GGTA1基因和/或所述CMAH基因内或其附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，从而使得所述GGTA1基因和/或所述CMAH基因的一个或更多个外显子全部或部分缺失。

　　在某些实施方式中，所述DNA核酸内切酶包括Cas核酸酶。

　　在某些实施方式中，所述Cas核酸酶包括Cas9核酸酶、其同源物、其天然存在分子的重组体、其密码子优化版本，和/或其经修饰版本。

　　在某些实施方式中，所述方法包括：a)提供一种细胞，所述细胞包含一种或多种包含本申请所述的载体或所述gRNA载体的体外转录产物;b)将所述细胞在培养液中进行培养;c)将培养后的细胞移植至受体雌性非人哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人哺乳动物的子宫中发育;和d)鉴定步骤c)的怀孕雌性的后代基因改造的非人哺乳动物中的种系传递。

　　在某些实施方式中，所述动物包括猪。

　　另一方面，本申请提供了根据本申请所述的构建动物模型的方法制备获得动物模型，其中所述动物不表达β4GalNT2基因和/或β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2。

　　在某些实施方式中，所述动物不表达GGTA1基因和/或αGal。

　　在某些实施方式中，所述动物不表达CMAH基因和/或Neu5Gc。

　　另一方面，本申请提供了一种制备动物模型的方法，所述方法包括：a)提供本申请所述的动物模型;b)将步骤a)获得的动物模型与其它动物交配或体外授精或对基于步骤a)获得的动物模型进一步进行基因编辑或将人组织、细胞移植至步骤a)获得的动物模型中，并进行筛选，得到的动物模型。

　　另一方面，本申请提供了根据所述制备动物模型的方法制备获得动物模型。

　　在某些实施方式中，所述动物包括猪。

　　另一方面，本申请提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其中所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于本申请所述的动物模型或其后代。

　　另一方面，本申请提供了一种组织或器官或其培养物，其中所述组织或器官或其培养物来源于所述的动物模型或其后代。

　　另一方面，本申请提供了一种特异靶向敲除β4GalNT2基因的CRISPR/Cas9系统，其包括使用含有本申请所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的DNA序列。

　　另一方面，本申请提供了一种能够特异性靶向β4GalNT2基因的核酸分子试剂盒，其中，所述试剂盒包括所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA。

　　另一方面，本申请提供了一种能够特异的靶向β4GalNT2基因的成套核酸分子，其中，所述成套核酸分子包括所述的特异性靶向β4GalNT2基因的sgRNA和Cas9 mRNA。

　　另一方面，本申请提供了所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述的组织或器官或其培养物在器官和/或组织移植产品开发，或者作为药理学、免疫学和医学研究的模型系统，或在验证、评价或研究免疫排斥反应中的应用。

　　另一方面，本申请提供了所述的动物模型在器官和/或组织移植产品开发，或者作为药理学、免疫学和医学研究的模型系统中的应用。

　　另一方面，本申请提供了所述的动物模型在验证、评价或研究免疫排斥反应方面的应用。

　　本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

　　附图说明

　　本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：

　　图1显示的是GGTA1-CRISPR/Cas9打靶载体的示意图。

　　图2显示的是CMAH-CRISPR/Cas9打靶载体的示意图。

　　图3显示的是β4GalNT2-CRISPR/Cas打靶载体的示意图。

　　具体实施方式

　　以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

　　术语定义

　　在本申请中，术语“单链断裂(SSB)”通常是指DNA分子的一条链被切割发生断裂的现象。当DNA双螺旋的两条链中只有一条具有缺陷时，另一条链可以用作模板来指导受损链的校正。DNA核酸内切酶可以引起单链断裂。

　　在本申请中，术语“双链断裂(DSB)”通常是指双股DNA分子的两条单链在同一位置被切割时发生的现象。双股断裂可诱发DNA修复，可能造成遗传重组，细胞也有一些系统作用于其他时候造成的双股断裂。双链断裂可在正常细胞复制周期中定期发生，也可以在某些情况下增强，例如紫外线、DNA断裂的诱导剂(例如，各种化学诱导剂)。许多诱导剂可以导致DSB在基因组中无差别地发生，并且DSB可以在正常细胞中有规律地诱导和修复。在修复过程中，可以完全保真地重建原始序列，但是，在某些情况下，会在DSB站点引入小的插入或缺失(称为“indels”)。在某些情形中，还可以在特定的位置特异性诱导双链断裂，其可以用于在选定的染色体位置引起定向或优先的基因修饰。在许多情况下，可以利用DNA修复(以及复制)过程中同源序列易于重组的趋势，这是基因编辑系统(如CRISPR)应用的基础。该同源性指导的修复用于将通过使用“供体”多核苷酸提供的目的序列插入所需的染色体位置。

　　在本申请中，术语“体外转录产物”通常是指通过DNA体外转录合成，或者在处理后变成信使RNA(mRNA)的产物。体外转录产物可包括前体信使RNA(前mRNA)和经处理的mRNA自身。在DNA链转录为转录产物后，新近合成的初级转录物可以以若干方式改性，以转化为它们的成熟功能形式，以产生不同的蛋白质和RNA(如mRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、miRNA等)。术语“体外转录产物”可包括外显子、内含子、5’UTR和3’UTR。

　　在本申请中，所述“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，用以将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。载体可涵盖除转基因插入序列和主链以外的额外特征：启动子、遗传标记、抗生素抗性、报告基因、靶向序列、蛋白质纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体具体地讲用于在靶细胞中表达转基因，且通常具有控制序列。本申请所述的载体可以是表达载体，可包括病毒载体(慢病毒载体和/或逆转录病毒载体)、噬菌体载体、噬菌粒、粘粒、cosmid、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)和/或质粒。

　　在本申请中，术语“猪”通常是指本领域中己知的任何猪，包括但不限于：野生猪、家养猪、迷你猪、野猪(Sus scrofa pig)、家猪(Sus scrofa domesticus pig)以及近亲交配猪。不受限制，所述猪可选自包含以下的组：兰德瑞斯猪(Landrace，也称为长白猪)、约克郡猪(Yorkshire)、汉普郡猪(Hampshire)、杜洛克猪(Duroc)、中国眉山猪(ChineseMeishan)、切斯特白猪(Chester White)、伯克希尔戈廷根猪(Berkshire Goettingen)、兰德瑞斯/约克郡/切斯特白猪、尤卡坦猪(Yueatan)、巴马香猪(Barna)、五指山猪(Wuzhishan)、西双版纳猪(Xi Shuang Banna)和皮特兰猪(Pietrain)。

　　在本申请中，术语“脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶”通常是指可水解DNA分子链内部的磷酸二酯键，从而生成寡核苷酸的酶。DNA核酸内切酶可包括不具碱基特异性的酶和能够识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶。

　　在本申请中，术语“Cas核酸酶”通常是指CRISPR相关核酸酶，一种DNA核酸内切酶，其可在特定的DNA序列处形成双链断裂。Cas核酸酶通常可以与CRISPR序列互补，能够使用CRISPR序列作为指导(guide)，从而识别和切割特定的DNA链。Cas核酸酶的实例可包括但不限于下组：Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csxl2)、CaslO、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4，和/或他们的同系物、或其修饰形式。

　　在本申请中，术语“Cas9核酸酶”也可称为，Csn1或Csx12，通常是指与II型CRISPR(有规律地间隔的短回文重复序列)自适应免疫系统相关的RNA引导的DNA核酸内切酶。Cas9核酸酶还可包括野生型蛋白质，直系同源物，及其功能性和非功能性突变体。所述Cas9核酸酶可源于任何合适的细菌。Cas9核酸酶通常包括RuvC核酸酶结构域和HNH核酸酶结构域，分别切割双链DNA分子的两条不同的链。已经在不同的细菌物种如嗜热链球菌(S.thermophiles)、无害利斯特氏菌(Listeria innocua)(Gasiunas，Barrangou etal.2012;Jinek，Chylinski et al.2012)和化脓性链球菌(S.Pyogenes)(Deltcheva，Chylinski et al.2011)中描述了Cas9核酸酶。例如，化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9蛋白，其氨基酸序列参见SwissProt数据库登录号Q99ZW2;脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号A1IQ68;嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号Q03LF7;金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号J7RUA5。

　　在本申请中，术语“gRNA”通常是指指导RNA(guide RNA)，一种RNA分子。在自然界中，crRNA和tracrRNA通常作为两个独立的RNA分子存在，组成gRNA。术语“crRNA”也称为CRISPR RNA，通常是指与所靶向的目标DNA互补的一段核苷酸序列，术语“tracrRNA”通常是指可与Cas核酸酶结合的支架型RNA。crRNA和tracRNA也可以融合成为单链，此时gRNA也可称为单链指导RNA(sgRNA)，sgRNA已成为本领域技术人员在CRISPR技术中使用的gRNA的最常见的形式，因此术语“sgRNA”和“gRNA”在本文中可具有相同的含义。sgRNA可以人工合成，也可以在体外或体内由DNA模板制备。sgRNA可以结合Cas核酸酶，也可以靶向目标DNA，其可引导Cas核酸酶切割与gRNA互补的DNA位点。gRNA与其相应的靶序列之间的互补程度至少为约50%。

　　在本申请中，术语“骨架序列”通常是指gRNA中，除识别或杂交靶序列的部分的其他部分，可包括sgRNA中gRNA配对序列与转录终止子之间的序列。骨架序列一般不会因为靶序列的变化而变化，也不影响gRNA对靶序列的识别。因此，骨架序列可以是现有技术中任何可行的序列。骨架序列的结构可参见如文献Nowak et al.Nucleic Acids Research2016.44:9555-9564中的Figure 1中A和B，Figure 3中A、B、C，以及Figure 4中A、B、C、D、E中所记载的除spacer序列之外的部分。

　　在本申请中，术语“靶核酸”、“靶核酸”和“靶区域”可以互换的使用，通常是指可以被gRNA识别的核酸序列，所述靶核酸可以指双链核酸，也可以指单链核酸。

　　在本申请中，术语“分离的核酸分子”通常是指从5’至3’末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物或其类似物。分离的核酸分子可以是从通常的或天然的环境中分离出的，也可以是人工合成的方式生产而成的。这种分离的核酸分子从其通常的或天然的环境中移出的或分离的，或者生产所述分子的方式使其不存在于其通常的或天然的环境中，其与通常的或天然的环境中的多肽、肽、脂质、糖类、其他的多核苷酸或其它材料分离。本申请中的分离的核酸分子可编码RNA，例如，可编码特异性靶向RPGR基因的gRNA。

　　在本申请中，术语“CMAH”通常是指编码胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMP-Neu5Ac羟化酶)的基因。功能性的胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶可以催化唾液酸N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)转化为N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。Neu5Gc残基是被人免疫系统识别的抗原表位或抗原。本申请所述胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶可包括全长蛋白、功能性片段、同源物和/或功能性变体(如，剪接变体)。本申请所述的CMAH基因的核苷酸序列包括其功能性变体、衍生物、类似物、同源物及其片段。猪CMAH蛋白的氨基酸序列可参见NCBI数据库的登录号NP_001106486.1下，猪CMAH核苷酸序列可参见NCBI数据库的登录号NM_001113015.1下。

　　在本申请中，术语“GGTA1”也可称为αGal、GGTA、GGTl、GT、αGT、GGTA 1，通常是指编码α1,3半乳糖基转移酶(αGal，GT)的基因。功能性α1,3半乳糖基转移酶可以催化在糖蛋白上形成半乳糖α1,3-半乳糖(αGal、Gal、Gal、gall、3gal或gal1-3gal)残基。半乳糖α1,3-半乳糖(αGal)残基是人免疫系统识别的抗原表位或抗原。本申请所述α1,3半乳糖基转移酶可包括全长蛋白、功能性片段、同源物和/或功能性变体(如，剪接变体)。本申请所述的GGTA1基因的核苷酸序列包括其功能性变体、衍生物、类似物、同源物及其片段。猪GGTA1蛋白的氨基酸序列可参见NCBI数据库的登录号NP_001309984.1下，猪GGTA1核苷酸序列可参见NCBI数据库的登录号NM_001323055.1下。

　　在本申请中，术语“β4GalNT2”通常是指编码β-1,4N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(β4GalNT2、β4GalNT2、βl,4GalNT2、β1,4GalNT2)的基因，功能性的β4GalNT2可产生Sda样聚糖。本申请所述的β-1,4N-乙酰氨基半乳糖转移酶2可包括全长蛋白、功能性片段、同源物和/或功能性变体(如，剪接变体)。本申请所述的β4GalNT2基因的核苷酸序列包括其功能性变体、衍生物、类似物、同源物及其片段。猪β4GalNT2蛋白的氨基酸序列可参见NCBI数据库的登录号NP_001231259.1下，猪β4GalNT2核苷酸序列可参见NCBI数据库的登录号NM_001244330.1下。

　　发明详述

　　一方面，本申请提供了一种特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，其中所述gRNA可以特异性结合SEQ ID NO.1-2中任一项所示的核苷酸序列。在某些情形中，所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA可特异性结合与SEQ ID NO.1-2中任一项所示的核苷酸序列具有至少70%(例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%)序列同一性的核苷酸序列。

　　在某些情形中，所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA可特异性结合与SEQ ID NO:1-2中任一项所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在某些情形中，所述gRNA可特异性结合与SEQ ID NO.1-2中任一项所示的核苷酸序列具有至少70%(例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%)序列同一性的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

　　本申请所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA可以与目标靶核酸中的序列结合。gRNA可以通过杂交(即碱基配对)以序列特异性的方式与靶核酸相互作用。所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的核苷酸序列可以根据目标靶核酸的序列而变化。

　　在本申请中，所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA可包含SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列：n1n2n3n4n5n6n7n8tcn11n12gn14n15can18n19n20，其中n1=c或g，n2=g或u，n3=a或u，n4=a或c，n5=c或g，n6=c或u，n7=a或u，n8=c或u，n11=a或u，n12=c或u，n14=a或c，n15=a或c，n18=c或g，n19=a或u，且n20=c或g。本申请中，所述gRNA可包括与SEQID NO.16中任一项所示的核苷酸序列具有至少70%(例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%)序列同一性的核苷酸序列。

　　在本申请中，所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA可包含SEQ ID NO.6-7中任一项所示的核苷酸序列。本申请中，所述gRNA可包括与SEQ ID NO.6-7中任一项所示的核苷酸序列具有至少70%(例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%)序列同一性的核苷酸序列。

　　在本申请中，所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA可包含骨架序列，本申请使用的骨架序列可以来自任何商购可得的质粒，只要其可实现Cas核酸酶的表达和gRNA的转录即可。例如，所述骨架序列可以是来自pX330的骨架序列。例如，所述骨架序列可以是SEQ IDNO:17所示的核苷酸序列。在本申请中，所述gRNA包含5’-(X)n-SEQ ID NO:16中所示的核苷酸序列-骨架序列-3’，其中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。例如，n为0。例如，本申请所述gRNA可包含5’-SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列-SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列-3’，或5’-SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列-SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列-3’。

　　在本申请中，所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA可以为单链向导RNA(sgRNA)。

　　另一方面，本申请提供了一种gRNA组合，其可包括本申请所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，特异性靶向GGTA1基因的gRNA和特异性靶向CMAH基因的gRNA。

　　在本申请中，所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA可包含SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。本申请中，所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA可包括与SEQ ID NO.9中任一项所示的核苷酸序列具有至少70%(例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%)序列同一性的核苷酸序列。

　　在本申请中，所述特异性靶向CMAH基因的gRNA可包含SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。本申请中，所述特异性靶向CMAH基因的gRNA可包括与SEQ ID NO.10中任一项所示的核苷酸序列具有至少70%(例如，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%)序列同一性的核苷酸序列。

　　另一方面，本申请提供了一种或多种分离的核酸分子，其可编码本申请所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA。

　　另一方面，本申请提供了一种载体，其可包含本申请所述编码特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的核酸分子。

　　当使用本申请的编码所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的两种核酸分子时，这两种核酸分子可以位于同一载体中，或者，也可以位于不同的载体中。例如，编码所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的两种核酸分子可以位于同一载体中。

　　在申请中，编码所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的一种和/或两种核酸分子，编码所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA的核酸分子，以及编码所述特异性靶向CMAH基因的gRNA的核酸分子中的每一个核酸分子可以位于1个、2个、3个或4个载体中。

　　在申请中，编码所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的一种和/或两种核酸分子，编码所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA的核酸分子，以及编码所述特异性靶向CMAH基因的gRNA的核酸分子中的每一个核酸分子可以位于不同的载体中。

　　在申请中，编码所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的一种和/或两种核酸分子，编码所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA的核酸分子，以及编码所述特异性靶向CMAH基因的gRNA的核酸分子中的其中两个可以位于同一载体中。

　　在申请中，编码所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的一种和/或两种核酸分子，编码所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA的核酸分子，以及编码所述特异性靶向CMAH基因的gRNA的核酸分子中的其中三个可以位于同一载体中。

　　在申请中，本申请的编码所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的一种和/或两种核酸分子，编码所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA的核酸分子，以及编码所述特异性靶向CMAH基因的gRNA的核酸分子可以位于同一载体中。

　　在本申请中，所述载体可以是任意可用于CRISPR/Cas的载体，例如，所述载体为PX330质粒。

　　另一方面，本申请提供了细胞，其可包含所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，所述的核酸分子，所述的载体，和/或所述的载体的体外转录产物。

　　另一方面，本申请提供了一种构建动物模型的方法，所述方法可包括向动物的细胞施用至少两种本申请所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，从而敲除β4GalNT2基因的全部或部分，其中所述gRNA特异性结合SEQ ID NO.1-2中任一项所示的核苷酸序列。

　　在本申请中，所述方法可包括以下步骤：使用一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述β4GalNT2基因内或其附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，从而使得所述β4GalNT2基因的一个或更多个外显子全部或部分缺失。

　　在本申请中，所述方法可包括向动物的细胞施用本申请所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA，从而敲除GGTA1基因的全部或部分。

　　在本申请中，所述方法可包括向动物的细胞施用本申请所述特异性靶向CMAH基因的gRNA，从而敲除CMAH基因的全部或部分。

　　在本申请中，所述方法还可包括以下步骤：使用一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述GGTA1基因和/或所述CMAH基因内或其附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，从而使得所述GGTA1基因和/或所述CMAH基因的一个或更多个外显子全部或部分缺失。

　　所述DNA核酸内切酶可以包括脱氧核糖核酸内切酶I，脱氧核糖核酸内切酶II，脱氧核糖核酸内切酶IV，限制性内切酶，UvrABC核酸内切酶，和/或工程化核酸酶。工程化核酸酶的例子有，包括但不限于，归巢核酸内切酶(也称为兆核酸酶或大范围核酸酶，Meganuclease)，锌指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)，转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector-based nuclease，TALEN)，规律性间隔的短回文序列重复簇(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)。

　　在本申请中，所述DNA核酸内切酶可以包括Cas核酸酶。在某些情形中，所述Cas核酸酶可以包括Cas9核酸酶、其同源物、其天然存在分子的重组体、其密码子优化版本，和/或其经修饰版本。

　　所述DNA核酸内切酶可以被修饰或未被修饰。同样，gRNA、crRNA、tracrRNA或sgRNA可以被修饰或未被修饰。本领域中存在许多已知并可被使用的修饰。例如，核苷酸的缺失、插入、转位、失活和/或激活。所述修饰可包括引入一个或多个突变(包括单个或多个碱基对改变)、增加发夹的数目、交联、断开具体的核苷酸段以及其他修饰。修饰可以包括包含至少一个非天然存在的核苷酸、或一个经修饰的核苷酸、或其类似物。所述核苷酸可以在核糖、磷酸和/或碱基部分处被修饰。

　　在本申请中，所述方法可包括：a)提供一种细胞，所述细胞包含一种或多种包含本申请所述的载体或所述gRNA载体的体外转录产物;b)将所述细胞在培养液中进行培养;c)将培养后的细胞移植至受体雌性非人哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人哺乳动物的子宫中发育;和d)鉴定步骤c)的怀孕雌性的后代基因改造的非人哺乳动物中的种系传递。

　　在本申请中，所述动物可包括猪。所述猪可以为本领域抑制的任何种类的猪，包括但不限于如上文定义的那些。例如，所述猪可以选自巴马猪、五指山猪和/或长白猪。

　　另一方面，本申请提供了根据本申请所述的构建动物模型的方法制备获得动物模型，其中所述动物不表达β4GalNT2基因和/或β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2。在某些情形中，所述动物可以不表达GGTA1基因和/或αGal。在某些情形中，所述动物可以不表达CMAH基因和/或Neu5Gc。

　　在本申请中，所述不表达β4GalNT2基因、GGTA1和/或CMAH通常是指所述基因的核苷酸序列的插入、中断或缺失，或涉及到该基因的转录和mRNA翻译为前体或成熟蛋白质的功能的降低或缺失，或者，编码具有比内源性氨基酸序列少的氨基酸残基的多肽或者不编码多肽。在本申请中，β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2、αGal和/或Neu5Gc的不表达涉及活性或水平的降低或消除。

　　可以通过多种方法检测基因或蛋白质的表达水平，包括在RNA水平的方法(包括通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)或通过Southern印迹、原位杂交的mRNA定量)和在蛋白质水平的方法(包括组织化学、免疫印迹分析和体外结合研究)。此外，可以通过本领域技术人员众所周知的ELISA技术来定量目的基因的表达水平。可以使用许多标准分析来完成定量测量。例如，可使用RT-PCR和包括RNA酶保护、Southern印迹分析、RNA斑点(RNAdot)分析在内的杂交方法测量转录水平。也可以使用免疫组织化学染色和流式细胞检测、Western印迹分析来评估是否存在β4GalNT2基因和/或β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2、GGTA1基因和/或αGal，和/或，CMAH基因和/或Neu5Gc。

　　另一方面，本申请提供了一种制备动物模型的方法，所述方法可以包括：a)提供本申请所述的动物模型;b)将步骤a)获得的动物模型与其它动物交配或体外授精或对基于步骤a)获得的动物模型进一步进行基因编辑或将人组织、细胞移植至步骤a)获得的动物模型中，并进行筛选，得到的动物模型。

　　另一方面，本申请提供了根据所述制备动物模型的方法制备获得动物模型。例如，所述动物可以包括猪。

　　另一方面，本申请提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其中所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物可以来源于本申请所述的动物模型或其后代。可以从非人类哺乳动物中分离细胞培养物，或从使用同样的构建体、经标准的细胞转染技术建立的细胞培养物中制备细胞培养物。

　　另一方面，本申请提供了一种组织或器官或其培养物，其中所述组织或器官或其培养物可以来源于所述的动物模型或其后代。

　　另一方面，本申请提供了一种特异靶向敲除β4GalNT2基因的CRISPR/Cas9系统，其可以包括使用含有本申请所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的DNA序列。

　　另一方面，本申请提供了一种能够特异性靶向β4GalNT2基因的核酸分子试剂盒，其中，所述试剂盒可以包括所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA。

　　另一方面，本申请提供了一种能够特异的靶向β4GalNT2基因的成套核酸分子，其中，所述成套核酸分子可以包括所述的特异性靶向β4GalNT2基因的sgRNA和Cas9核酸酶的mRNA。

　　另一方面，本申请提供了所述的动物模型在器官和/或组织移植产品开发，或者作为药理学、免疫学和医学研究的模型系统中的应用。

　　所述器官和/或组织移植产品包括移植、植入或输注到接受者对象的来自不同物种的细胞、组织或器官。特别地考虑其中接受者是人的移植。所述移植产品可以从具有降低的aGal、β-1,4N-乙酰氨基半乳糖转移酶2和Neu5Gc表达的转基因动物中分离出来。

　　所述器官和/或组织移植产品可以从产前、新生、未成熟或完全成熟的转基因动物中分离出来。移植材料可用作需要器官移植的人对象的临时或永久性器官替代物。

　　另一方面，本申请提供了所述的动物模型在验证、评价或研究免疫排斥反应方面的应用。当移植的组织、器官、细胞或材料不被接受者的身体接受时，则发生免疫排斥。在免疫排斥中，接受者的免疫系统攻击移植的材料。存在多种类型的免疫排斥并且其可以单独或一起发生。免疫排斥反应包括但不限于超急性排斥(HAR)、急性体液异种移植排斥反应(AHXR)、血小板减少症、急性体液排斥、超急性血管排斥、抗体介导的排斥反应和移植物抗宿主病。

　　评价、评估、分析、测量、量化或确定本领域中已知的排斥相关症状的任何方法可与本申请的组合物、试剂盒和方法一起使用。分析免疫排斥相关症状的方法可包括但不限于：包括具有血小板计数的CBC的实验室评估、凝血研究、肝功能测试、流式细胞术、免疫组织化学、标准诊断标准、免疫学方法、蛋白质印迹法、免疫印迹法、显微术、共聚焦显微术、透射电子显微术、IgG结合测定、IgM结合测定、表达测定、肌酐测定和吞体分离。

　　本申请还提供了以下实施方式：

　　1.一种特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，其中所述gRNA特异性结合SEQ ID NO.1-2中任一项所示的核苷酸序列。

　　2.根据实施方式1所述的gRNA，其中所述gRNA包含SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列。

　　3.根据实施方式1-2中任一项所述gRNA，其中所述gRNA包含SEQ ID NO.6-7中任一项所示的核苷酸序列。

　　4.根据实施方式1-3中任一项所述gRNA，其中所述sgRNA包含5’-(X)n-SEQ IDNO.16所示的核苷酸序列-骨架序列-3’，其中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。

　　5.根据实施方式1-4中任一项所述gRNA，其中所述gRNA为单链向导RNA(sgRNA)。

　　6.gRNA组合，其包括实施方式1-5中任一项所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，特异性靶向GGTA1基因的gRNA和特异性靶向CMAH基因的gRNA。

　　7.根据实施方式6所述的gRNA组合，其中所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA包含SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

　　8.根据实施方式6-7中任一项所述的gRNA组合，其中所述特异性靶向CMAH基因的gRNA包含SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。

　　9.一种或多种分离的核酸分子，其编码实施方式1-8中任一项所述gRNA。

　　10.载体，其包含实施方式9所述的核酸分子。

　　11.根据实施方式10所述的载体，其中编码所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的一种和/或两种核酸分子，编码所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA的核酸分子，以及编码所述特异性靶向CMAH基因的gRNA的核酸分子，其中，编码所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的一种和/或两种核酸分子位于同一载体中。

　　12.细胞，其包含实施方式1-8中任一项所述gRNA，实施方式9所述的核酸分子，实施方式10-11中任一项所述的载体，和/或实施方式10-11中任一项所述的载体的体外转录产物。

　　13.实施方式1-8中任一项所述gRNA，实施方式9所述的核酸分子，实施方式10-11中任一项所述的载体，实施方式10-11中任一项所述的载体的体外转录产物和/或实施方式12所述的细胞在敲除β4GalNT2基因中的用途，或者在构建动物模型中的用途。

　　14.一种β4GalNT2基因缺失细胞株，其是使用实施方式1-8中任一项所述sgRNA，实施方式9所述的核酸分子，实施方式10-11中任一项所述的载体，实施方式10-11中任一项所述的载体的体外转录产物和/或实施方式12所述的细胞制备获得的。

　　15.一种构建动物模型的方法，所述方法包括向动物的细胞施用至少两种特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，从而敲除β4GalNT2基因的全部或部分，其中所述gRNA特异性结合SEQ ID NO.1-2中任一项所示的核苷酸序列。

　　16.根据实施方式15所述的gRNA，其中所述gRNA包含SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列。

　　17.根据实施方式15-16中任一项所述的方法，其中所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA包含SEQ ID NO.6-7中任一项所示的核苷酸序列。

　　18.根据实施方式17所述的方法，其中所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA包含5’-(X)n-SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列-骨架序列-3’，其中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。

　　19.根据实施方式15-18中任一项所述的方法，其中所述gRNA为单链向导RNA(sgRNA)。

　　20.根据实施方式15-19中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：使用一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述β4GalNT2基因内或其附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，从而使得所述β4GalNT2基因的一个或更多个外显子全部或部分缺失。

　　21.根据实施方式15-20中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向动物的细胞施用特异性靶向GGTA1基因的gRNA，从而敲除GGTA1基因的全部或部分。

　　22.根据实施方式21所述的方法，其中所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA包含SEQID NO.9所示的核苷酸序列。

　　23.根据实施方式15-22中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向动物的细胞施用特异性靶向CMAH基因的gRNA，从而敲除CMAH基因的全部或部分。

　　24.根据实施方式23所述的方法，其中所述特异性靶向CMAH基因的gRNA包含SEQID NO.10所示的核苷酸序列。

　　25.根据实施方式15-24中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：使用一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述GGTA1基因和/或所述CMAH基因内或其附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，从而使得所述GGTA1基因和/或所述CMAH基因的一个或更多个外显子全部或部分缺失。

　　26.根据实施方式25所述的方法，其中所述DNA核酸内切酶包括Cas核酸酶。

　　27.根据实施方式26所述的方法，其中所述Cas核酸酶包括Cas9核酸酶、其同源物、其天然存在分子的重组体、其密码子优化版本，和/或其经修饰版本。

　　28.根据实施方式15-27中任一项所述的方法，所述方法包括：

　　a)提供一种细胞，所述细胞包含一种或多种包含实施方式10-11中任一所述的载体或所述gRNA载体的体外转录产物;

　　b)将所述细胞在培养液中进行培养;

　　c)将培养后的细胞移植至受体雌性非人哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人哺乳动物的子宫中发育;和

　　d)鉴定步骤c)的怀孕雌性的后代基因改造的非人哺乳动物中的种系传递。

　　29.根据实施方式15-28中任一项所述的方法，其中所述动物包括猪。

　　30.根据实施方式18-29中任一项所述的方法制备获得动物模型，其中所述动物不表达β4GalNT2基因和/或β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2。

　　31.根据实施方式30所述的动物模型，其中所述动物不表达GGTA1基因和/或αGal。

　　32.根据实施方式30-31中任一项所述的动物模型，其中所述动物不表达CMAH基因和/或Neu5Gc。

　　33.一种制备动物模型的方法，所述方法包括：

　　a)提供实施方式30-32中任一项所述的动物模型;

　　b)将步骤a)获得的动物模型与其它动物交配或体外授精或对基于步骤a)获得的动物模型进一步进行基因编辑或将人组织、细胞移植至步骤a)获得的动物模型中，并进行筛选，得到的动物模型。

　　34.根据实施方式33所述的方法制备获得动物模型。

　　35.根据实施方式34所述的动物模型，其中所述动物包括猪。

　　36.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其中所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于实施方式30-32和34-35中任一项所述的动物模型或其后代。

　　37.一种组织或器官或其培养物，其中所述组织或器官或其培养物来源于实施方式30-32和34-35中任一项所述的动物模型或其后代。

　　38.一种特异靶向敲除β4GalNT2基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，使用含有实施方式1-8中任一项所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的DNA序列。

　　39.一种能够特异性靶向β4GalNT2基因的核酸分子试剂盒，其中，所述试剂盒包括实施方式1-8中任一所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA。

　　40.一种能够特异的靶向β4GalNT2基因的成套核酸分子，其中，所述成套核酸分子包括实施方式1-8中任一项所述的sgRNA和Cas9 mRNA。

　　41.实施方式36所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物，实施方式37所述的组织或器官或其培养物在器官和/或组织移植产品开发，或者作为药理学、免疫学和医学研究的模型系统，或在验证、评价或研究免疫排斥反应中的应用。

　　42.实施方式30-32和34-35中任一项所述的动物模型在器官和/或组织移植产品开发，或者作为药理学、免疫学和医学研究的模型系统中的应用。

　　43.实施方式30-32和34-35中任一项所述的动物模型在验证、评价或研究免疫排斥反应方面的应用。

　　不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。

　　实施例

　　实施例1构建CRISPR/Cas9载体

　　首先根据GGTA1/CMAH/β4GalNT2基因的DNA序列，合成靶向GGTA1，CMAH和β4GalNT2基因的sgRNA(single guide RNA)，以pX330(Addgene plasmid 423230)为骨架质粒，分别构建GGTA1-CRISPR/Cas9载体、CMAH-CRISPR/Cas9载体和β4GalNT2-CRISPR/Cas9载体。

　　首先根据Genbank中公布的猪GGTA1、CMAH和β4GalNT2的基因序列，选取GGTA1基因的3号外显子exon3、CMAH基因的6号外显子exon6和β4GalNT2基因的8号外显子exon8作为CRISPR/Cas9靶点，根据cas9靶点设计原则：5’端为G，3’端为PAM序列(NGG)，设计靶向GGTA1的sgRNA序列为GAAAATAATGAATGTCAA(SEQ ID NO:9)，靶向CMAH的sgRNA序列为GAGTAAGGTACGTGATCTGT(SEQ ID NO:10)，以及靶向β4GalNT2的sgRNA1序列为GGTAGTACTCACGAACACTC(SEQ ID NO:6)和靶向β4GalNT2的sgRNA2序列为CTACCCTTTCTTGCCCAGAG(SEQ ID NO:7)。合成5’端磷酸化寡核苷酸链sgRNA序列。

　　将sgRNA序列克隆到pX330骨架载体上(对于靶向β4GalNT2基因，当两个sgRNA在同一载体中时，克隆的片段为U6启动子-β4GalNT2/sgRNA1-gRNA骨架-U6启动子-β4GalNT2/sgRNA2-gRNA骨架)，具体步骤如下：

　　1、用限制性内切酶BbsI消化1μg pX330质粒;

　　2、酶切的pX330质粒跑琼脂糖凝胶(琼脂糖凝胶浓度1%，即1g琼脂糖凝胶加入到100mL电泳缓冲液中)分离，用胶回收试剂盒(QIAGEN)纯化回收酶切产物;

　　3、将合成的5’端磷酸化寡核苷酸链sgRNA序列按照以下程序退火：

　　37℃30min

　　95℃5min然后以5℃/min的速率降至25℃。

　　4、按照以下体系启动连接反应：室温反应10min

　　5、用质粒安全核酸外切酶处理连接体系，去除错误链接质粒：

　　37℃反应30min

　　6、转化

　　(1)取50μL感受态细胞(TIANGEN)置于冰浴中;

　　(2)向装有感受态细胞的离心管中加入15μL步骤5得到的去除错误连接质粒溶液，混匀后在冰浴中静置30min;

　　(3)将冰浴30min的感受态细胞置于42℃水浴中60～90s，然后迅速转移至冰浴中，使细胞冷却2～3min;

　　(4)向离心管中加入900μL无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床150rpm振荡培养45min;

　　(5)将离心管放到离心机中12000rpm离心5min，然后弃去900μL上清，用剩余的100μL上清重悬感受态细胞沉淀，然后将重悬的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将感受态细胞涂布均匀;将涂布有感受态细胞的LB固体琼脂培养基倒置于37℃培养箱中培养12～16h。

　　7、小提质粒，测序，鉴定打靶质粒构建成功。

　　得到CRSAPR/Cas9打靶载体，载体分别命名为GGTA1-CRISPR/Cas9(图1，全核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)、CMAH--CRISPR/Cas9(图2，全核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)和β4GalNT2-CRISPR/Cas9(图3，全核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)，核苷酸序列如所示。

　　实施例2构建GGTA1/CMAH/β4GalNT2三基因敲除克隆

　　将GGTA1-CRISPR/Cas9打靶载体，CMAH-CRISPR/Cas9打靶载体和β4GalNT2-CRISPR/Cas9打靶载体同时转染雄性长白猪的胎儿成纤维细胞，通过G418筛选获得三基因敲除的单细胞克隆。具体步骤如下。

　　2.1猪原代成纤维细胞复苏

　　1、从液氮中取出冻存的原代猪成纤维细胞，在37℃水浴中解冻;

　　2、将解冻的细胞转入无菌的15mL离心管中，然后加入3mL细胞培养基，1500rpm离心5min;

　　其中，细胞完全培养基的配方为：16%胎牛血清(Gibco)+84%DMEM培养基(Gibco)，16%和84%为体积百分比。

　　3、弃去上清，加入2mL完全培养基重悬细胞沉淀，然后将重悬的细胞铺入6cm细胞培养皿中，补加2mL完全培养基，置于37℃，5%CO2(体积百分比)的恒温培养箱中进行培养;

　　4、将细胞培养至长满皿底90%左右时使用0.05%(5g/100mL)的胰蛋白酶将细胞消化下来，然后加入完全培养基终止消化，将细胞悬液转入15mL离心管中，1500rpm离心5min，弃去上清，使用2mL完全培养基重悬细胞，对细胞计数，将细胞总量调整至1.5×106以备下一步核转染实验。

　　2.2使用构建好的GGTA1-CRISPR/Cas9打靶载体，CMAH-CRISPR/Cas9打靶载体和β4GalNT2-CRISPR/Cas9打靶载体和tdTomato质粒(Clontech,PT4069-5)共转染猪原代成纤维细胞

　　使用哺乳动物成纤维细胞核转染试剂盒(Lonza)与Lonza NucleofactorTM2b核转仪进行核转染实验

　　1、配制核转染反应液，体系如下：

　　核转染基本溶液 82μL

　　补充成分 8μL

　　2、将构建好的三个质粒与Tdtomato质粒分别按照质量比5:1的比例加入本步骤1获得的100μL核转反应液中混匀，过程中注意切勿产生气泡;

　　3、将2.1制备得到的细胞悬液使用DPBS杜氏磷酸缓冲液(Gibco)洗两遍，37℃消化2min，用含体积百分比为10%胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化后，1500rpm离心5min，弃去上清，使用本步骤2中含有质粒的核转反应液重悬细胞，重悬过程中要避免气泡的产生;

　　4、将该核转体系小心加入到试剂盒带有的电转杯中，注意防止气泡。先用含有100μLPBS的电转杯放置于Lonza核转仪的杯槽内，选择U023核转程序调试程序后，将含有细胞的电转杯电击转染后立即在超净台内将电转杯中液体轻柔吸出，转入到1mL含体积百分比为16%胎牛血清的DMEM完全培养基中，轻轻混匀;

　　5、准备含8mL完全培养基的培养皿(10cm)若干，吸取核转后的细胞悬液加入含有完全培养基的培养皿中，混匀，在显微镜下观察细胞数量，计数，使得培养皿在显微镜下一个视野内约有50～60个细胞，其余皿均按照此细胞悬液最终用量加入，混匀后放置于37℃，5%CO2的恒温培养箱中进行培养。

　　2.3三基因敲除细胞系的筛选

　　1、将2.2所得细胞培养24h后将细胞培养基更换为含有1mg/mL G418的完全培养基，放置于37℃，5%CO2的恒温培养箱中进行培养，每2～3天更换一次细胞培养基，期间根据细胞生长状况逐渐降低G418的药物浓度，G418终浓度为0.3mg/mL，培养10～14天左右培养皿中会陆续长出G418抗性的单克隆细胞系;

　　2、使用克隆环挑取细胞系，将挑取的单克隆细胞系接种于铺有0.3mg/mLG418完全培养基的24孔板中，放置于37℃，5%CO2的恒温培养箱中进行培养，每2～3天换一次细胞培养基;

　　3、待24孔板的孔中细胞长满孔底，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，其中4/5细胞接种到含有0.3mg/mL G418完全培养基的12孔板或6孔板中(根据细胞量)，剩余的1/5的细胞留在24孔板中继续培养;

　　4、待12孔板或6孔板细胞铺满孔底后使用0.05%(5g/100mL)的胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90%胎牛血清+10%DMSO，体积比)将细胞冻存;

　　2.4三基因敲除细胞系的基因鉴定

　　1、待24孔板中细胞长满孔底后使用0.05%(5g/100mL)的胰蛋白酶消化并收集细胞，然后在细胞中加入25ml NP-40裂解液裂解细胞提取细胞基因组DNA，裂解程序为：55℃60min——95℃5min——4℃，反应结束后基因组DNA于-20℃保存;

　　2、针对GGTA1/CMAH/β4GalNT2基因靶点信息设计相应的PCR引物，PCR引物序列分别为：

　　GGTA1

　　正向引物为：5’-CCTTAGTATCCTTCCCAACCCAGAC-3’(SEQ ID NO:11)

　　反向引物为：5’-GCTTTCTTTACGGTGTCAGTGAATCC-3’(SEQ ID NO:12)

　　PCR目的产物长度为428bp;

　　CMAH

　　正向引物为：5’-CTTGGAGGTGATTTGAGTTGGG-3’(SEQ ID NO:13)

　　反向引物为：5’-CATTTTCTTCGGAGTTGAGGGC-3’(SEQ ID NO:14)

　　PCR目的产物长度为485bp;

　　β4GalNT2

　　正向引物为：5’-CCCAAGGATCCTGCTGCC-3’(SEQ ID NO:15)

　　反向引物为：5’-CGCCGTGTAAAGAAACCTCC-3’;(SEQ ID NO:8)

　　PCR目的产物长度为406bp;

　　3、使用PCR反应扩增GGTA1/CMAH/β4GalNT2靶点基因，PCR反应体系如下：

　　反应条件如下

　　CMAH靶点基因的扩增同上述步骤;β4GalNT2靶点基因的扩增同上述步骤。

　　4、将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳(1%，即1g琼脂糖凝胶加入到100mL电泳缓冲液中)，电泳结束后在紫外线下切下目的条带，然后使用胶回收试剂盒(QIAGEN)回收目的条带，并使用NanoDrop 200测定回收的PCR产物的浓度;

　　5、将回收的PCR产物使用TAKARA pMDTM 18-T Vector Cloning Kit链接T载体，T载体反应体系如下：

　　pMD18-T vector 1μL

　　胶回收PCR产物81.7ng*

　　ddH2O补齐体系至10uL

　　*注：TAKARA pMDTM 18-T Vector Cloning Kit说明书上对Insert DNA(本次为胶回收PCR产物)用量的要求0.1～0.3pM，本次选取0.2pM，用量计算方法为：Insert DNA的使用量(ng)=nmol数×660×Insert DNA的bp数。

　　T载体链接的反应条件为16℃反应30min;

　　6、将本步骤5所得的T载体链接产物使用感受态细胞(TIANGEN)进行转化，转化后将感受态细胞涂布于Amp抗性的LB琼脂固体培养基上，37℃恒温培养箱培养过夜;

　　从培养过夜的培养基上挑取单克隆菌落送测序公司进行测序，然后将测序结果与靶点GGTA1/CMAH/β4GalNT2信息进行比对，从而判断该细胞系是否为GGTA1/CMAH/β4GalNT2基因敲除细胞系。

　　实施例3使用单个sgRNA敲除β4GalNT2

　　按照实施例2的方法使用β4GalNT2的sgRNA(SEQ ID NO:6)构建β4GalNT2CRISPR/Cas9打靶载体，使用GGTA1的sgRNA(SEQ ID NO:9)构建CCTA1 CRISPR/Cas9打靶载体，构建双敲除β4GalNT2和GGTA1的巴马猪和五指山猪细胞克隆，测序，得到敲除效率和双敲除细胞克隆的基因型。

　　结果如表1-表4显示，使用单个β4GalNT2的sgRNA敲除β4GalNT2的效率为21.88%(巴马猪)和17.65%(五指山猪)。β4GalNT2和GGTA1双敲除的效率为21.88%(巴马猪)和13.24%(五指山猪)。

　　表1巴马猪双敲除效率

　　表2巴马猪双敲除细胞克隆基因型

　　表3五指山猪双敲除效率

　　表4五指山猪双敲除细胞克隆基因型

　　实施例4使用两个sgRNA敲除β4GalNT2

　　按照实施例2的方法使用β4GalNT2的2个sgRNA(SEQ ID NO:6和7)构建β4GalNT2CRISPR/Cas9打靶载体，使用GGTA1的sgRNA(SEQ ID NO:9)构建CCTA1 CRISPR/Cas9打靶载体，使用CMAH的sgRNA(SEQ ID NO:10)构建CMAH CRISPR/Cas9打靶载体，构建三敲除β4GalNT2、GGTA1和CMAH的长白猪细胞克隆，测序，得到敲除效率和三敲除细胞克隆的基因型。

　　结果如表5-表7显示，使用两个β4GalNT2的sgRNA敲除β4GalNT2的效率为30.51%(长白猪雄性)和39.21%(长白猪雌性)，与实施例3中使用1个sgRNA相比，β4GalNT2的敲除效率提高。β4GalNT2、GGTA1和CMAH三敲除的效率为25.42%(长白猪雄性)，高于实施例2中的双基因敲除效率。

　　表5长白猪雄性敲除效率

　　表6长白猪雄性三敲除细胞克隆基因型

　　表7长白猪雌性敲除效率

　　序列表

　　<110> 金佩奇生物科技(南京)有限公司

　　<120> 敲除猪异种抗原的基因的gRNA及其应用

　　<130> 0159-PA-003

　　<160> 17

　　<170> PatentIn version 3.5

　　<210> 1

　　<211> 20

　　<212> DNA

　　<213> Sus scrofa

　　<400> 1

　　ggtagtactc acgaacactc 20

　　<210> 2

　　<211> 20

　　<212> DNA

　　<213> Sus scrofa

　　<400> 2

　　ctaccctttc ttgcccagag 20

　　<210> 3

　　<211> 8868

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)

　　<220>

　　<223> β4GalNT2-CRISPR/Cas9 打靶载体

　　<400> 3

　　atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 60

　　atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 120

　　aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 180

　　aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 240

　　ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 300

　　ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 360

　　tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 420

　　ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 480

　　acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 540

　　gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 600

　　cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 660

　　aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 720

　　atgtgagggc ctatttccca tgattccttc atatttgcat atacgataca aggctgttag 780

　　agagataatt ggaattaatt tgactgtaaa cacaaagata ttagtacaaa atacgtgacg 840

　　tagaaagtaa taatttcttg ggtagtttgc agttttaaaa ttatgtttta aaatggacta 900

　　tcatatgctt accgtaactt gaaagtattt cgatttcttg gctttatata tcttgtggaa 960

　　aggacgaaac accggtagta ctcacgaaca ctcgttttag agctagaaat agcaagttaa 1020

　　aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct tttttgtttt 1080

　　agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgttt ttagcgcgtg cgccaattct 1140

　　gcagacaaat ggctctagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg 1200

　　atacaaggct gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt 1260

　　acaaaatacg tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg 1320

　　ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt 1380

　　atatatcttg tggaaaggac gaaacaccgc taccctttct tgcccagagg ttttagagct 1440

　　agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc 1500

　　ggtgcttttt tttactagag gtacccgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 1560

　　gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caatagtaac gccaataggg actttccatt 1620

　　gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 1680

　　atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattgtg 1740

　　cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 1800

　　ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 1860

　　ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg 1920

　　gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga 1980

　　ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 2040

　　cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg 2100

　　cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc gccccggctc 2160

　　tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt 2220

　　aattagctga gcaagaggta agggtttaag ggatggttgg ttggtggggt attaatgttt 2280

　　aattacctgg agcacctgcc tgaaatcact ttttttcagg ttggaccggt gccaccatgg 2340

　　actataagga ccacgacgga gactacaagg atcatgatat tgattacaaa gacgatgacg 2400

　　ataagatggc cccaaagaag aagcggaagg tcggtatcca cggagtccca gcagccgaca 2460

　　agaagtacag catcggcctg gacatcggca ccaactctgt gggctgggcc gtgatcaccg 2520

　　acgagtacaa ggtgcccagc aagaaattca aggtgctggg caacaccgac cggcacagca 2580

　　tcaagaagaa cctgatcgga gccctgctgt tcgacagcgg cgaaacagcc gaggccaccc 2640

　　ggctgaagag aaccgccaga agaagataca ccagacggaa gaaccggatc tgctatctgc 2700

　　aagagatctt cagcaacgag atggccaagg tggacgacag cttcttccac agactggaag 2760

　　agtccttcct ggtggaagag gataagaagc acgagcggca ccccatcttc ggcaacatcg 2820

　　tggacgaggt ggcctaccac gagaagtacc ccaccatcta ccacctgaga aagaaactgg 2880

　　tggacagcac cgacaaggcc gacctgcggc tgatctatct ggccctggcc cacatgatca 2940

　　agttccgggg ccacttcctg atcgagggcg acctgaaccc cgacaacagc gacgtggaca 3000

　　agctgttcat ccagctggtg cagacctaca accagctgtt cgaggaaaac cccatcaacg 3060

　　ccagcggcgt ggacgccaag gccatcctgt ctgccagact gagcaagagc agacggctgg 3120

　　aaaatctgat cgcccagctg cccggcgaga agaagaatgg cctgttcgga aacctgattg 3180

　　ccctgagcct gggcctgacc cccaacttca agagcaactt cgacctggcc gaggatgcca 3240

　　aactgcagct gagcaaggac acctacgacg acgacctgga caacctgctg gcccagatcg 3300

　　gcgaccagta cgccgacctg tttctggccg ccaagaacct gtccgacgcc atcctgctga 3360

　　gcgacatcct gagagtgaac accgagatca ccaaggcccc cctgagcgcc tctatgatca 3420

　　agagatacga cgagcaccac caggacctga ccctgctgaa agctctcgtg cggcagcagc 3480

　　tgcctgagaa gtacaaagag attttcttcg accagagcaa gaacggctac gccggctaca 3540

　　ttgacggcgg agccagccag gaagagttct acaagttcat caagcccatc ctggaaaaga 3600

　　tggacggcac cgaggaactg ctcgtgaagc tgaacagaga ggacctgctg cggaagcagc 3660

　　ggaccttcga caacggcagc atcccccacc agatccacct gggagagctg cacgccattc 3720

　　tgcggcggca ggaagatttt tacccattcc tgaaggacaa ccgggaaaag atcgagaaga 3780

　　tcctgacctt ccgcatcccc tactacgtgg gccctctggc caggggaaac agcagattcg 3840

　　cctggatgac cagaaagagc gaggaaacca tcaccccctg gaacttcgag gaagtggtgg 3900

　　acaagggcgc ttccgcccag agcttcatcg agcggatgac caacttcgat aagaacctgc 3960

　　ccaacgagaa ggtgctgccc aagcacagcc tgctgtacga gtacttcacc gtgtataacg 4020

　　agctgaccaa agtgaaatac gtgaccgagg gaatgagaaa gcccgccttc ctgagcggcg 4080

　　agcagaaaaa ggccatcgtg gacctgctgt tcaagaccaa ccggaaagtg accgtgaagc 4140

　　agctgaaaga ggactacttc aagaaaatcg agtgcttcga ctccgtggaa atctccggcg 4200

　　tggaagatcg gttcaacgcc tccctgggca cataccacga tctgctgaaa attatcaagg 4260

　　acaaggactt cctggacaat gaggaaaacg aggacattct ggaagatatc gtgctgaccc 4320

　　tgacactgtt tgaggacaga gagatgatcg aggaacggct gaaaacctat gcccacctgt 4380

　　tcgacgacaa agtgatgaag cagctgaagc ggcggagata caccggctgg ggcaggctga 4440

　　gccggaagct gatcaacggc atccgggaca agcagtccgg caagacaatc ctggatttcc 4500

　　tgaagtccga cggcttcgcc aacagaaact tcatgcagct gatccacgac gacagcctga 4560

　　cctttaaaga ggacatccag aaagcccagg tgtccggcca gggcgatagc ctgcacgagc 4620

　　acattgccaa tctggccggc agccccgcca ttaagaaggg catcctgcag acagtgaagg 4680

　　tggtggacga gctcgtgaaa gtgatgggcc ggcacaagcc cgagaacatc gtgatcgaaa 4740

　　tggccagaga gaaccagacc acccagaagg gacagaagaa cagccgcgag agaatgaagc 4800

　　ggatcgaaga gggcatcaaa gagctgggca gccagatcct gaaagaacac cccgtggaaa 4860

　　acacccagct gcagaacgag aagctgtacc tgtactacct gcagaatggg cgggatatgt 4920

　　acgtggacca ggaactggac atcaaccggc tgtccgacta cgatgtggac catatcgtgc 4980

　　ctcagagctt tctgaaggac gactccatcg acaacaaggt gctgaccaga agcgacaaga 5040

　　accggggcaa gagcgacaac gtgccctccg aagaggtcgt gaagaagatg aagaactact 5100

　　ggcggcagct gctgaacgcc aagctgatta cccagagaaa gttcgacaat ctgaccaagg 5160

　　ccgagagagg cggcctgagc gaactggata aggccggctt catcaagaga cagctggtgg 5220

　　aaacccggca gatcacaaag cacgtggcac agatcctgga ctcccggatg aacactaagt 5280

　　acgacgagaa tgacaagctg atccgggaag tgaaagtgat caccctgaag tccaagctgg 5340

　　tgtccgattt ccggaaggat ttccagtttt acaaagtgcg cgagatcaac aactaccacc 5400

　　acgcccacga cgcctacctg aacgccgtcg tgggaaccgc cctgatcaaa aagtacccta 5460

　　agctggaaag cgagttcgtg tacggcgact acaaggtgta cgacgtgcgg aagatgatcg 5520

　　ccaagagcga gcaggaaatc ggcaaggcta ccgccaagta cttcttctac agcaacatca 5580

　　tgaacttttt caagaccgag attaccctgg ccaacggcga gatccggaag cggcctctga 5640

　　tcgagacaaa cggcgaaacc ggggagatcg tgtgggataa gggccgggat tttgccaccg 5700

　　tgcggaaagt gctgagcatg ccccaagtga atatcgtgaa aaagaccgag gtgcagacag 5760

　　gcggcttcag caaagagtct atcctgccca agaggaacag cgataagctg atcgccagaa 5820

　　agaaggactg ggaccctaag aagtacggcg gcttcgacag ccccaccgtg gcctattctg 5880

　　tgctggtggt ggccaaagtg gaaaagggca agtccaagaa actgaagagt gtgaaagagc 5940

　　tgctggggat caccatcatg gaaagaagca gcttcgagaa gaatcccatc gactttctgg 6000

　　aagccaaggg ctacaaagaa gtgaaaaagg acctgatcat caagctgcct aagtactccc 6060

　　tgttcgagct ggaaaacggc cggaagagaa tgctggcctc tgccggcgaa ctgcagaagg 6120

　　gaaacgaact ggccctgccc tccaaatatg tgaacttcct gtacctggcc agccactatg 6180

　　agaagctgaa gggctccccc gaggataatg agcagaaaca gctgtttgtg gaacagcaca 6240

　　agcactacct ggacgagatc atcgagcaga tcagcgagtt ctccaagaga gtgatcctgg 6300

　　ccgacgctaa tctggacaaa gtgctgtccg cctacaacaa gcaccgggat aagcccatca 6360

　　gagagcaggc cgagaatatc atccacctgt ttaccctgac caatctggga gcccctgccg 6420

　　ccttcaagta ctttgacacc accatcgacc ggaagaggta caccagcacc aaagaggtgc 6480

　　tggacgccac cctgatccac cagagcatca ccggcctgta cgagacacgg atcgacctgt 6540

　　ctcagctggg aggcgacaaa aggccggcgg ccacgaaaaa ggccggccag gcaaaaaaga 6600

　　aaaagtaaga attcctagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc 6660

　　atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 6720

　　cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 6780

　　ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagagaata gcaggcatgc 6840

　　tggggagcgg ccgcaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg 6900

　　ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc 6960

　　ctcagtgagc gagcgagcgc gcagctgcct gcaggggcgc ctgatgcggt attttctcct 7020

　　tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat acgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt 7080

　　agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc 7140

　　agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc 7200

　　tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg 7260

　　cacctcgacc ccaaaaaact tgatttgggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga 7320

　　tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc 7380

　　caaactggaa caacactcaa ccctatctcg ggctattctt ttgatttata agggattttg 7440

　　ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt 7500

　　aacaaaatat taacgtttac aattttatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 7560

　　gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 7620

　　ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag 7680

　　aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt 7740

　　ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga 7800

　　aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc 7860

　　atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt 7920

　　caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct 7980

　　cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 8040

　　tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 8100

　　tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac 8160

　　gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 8220

　　tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 8280

　　gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 8340

　　aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 8400

　　gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 8460

　　atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 8520

　　caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 8580

　　ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtggaag ccgcggtatc 8640

　　attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 8700

　　agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 8760

　　aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt 8820

　　catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctc 8868

　　<210> 4

　　<211> 8505

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)

　　<220>

　　<223> GGTA1-CRISPR/Cas9 打靶载体

　　<400> 4

　　tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 60

　　tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 120

　　aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 180

　　aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 240

　　taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 300

　　taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 360

　　agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 420

　　tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 480

　　cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 540

　　agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 600

　　gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 660

　　aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 720

　　tgtgagggcc tatttcccat gattccttca tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga 780

　　gagataattg gaattaattt gactgtaaac acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt 840

　　agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat tatgttttaa aatggactat 900

　　catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa 960

　　ggacgaaaca ccgaaaataa tgaatgtcaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 1020

　　aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga 1080

　　gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttttta gcgcgtgcgc caattctgca 1140

　　gacaaatggc tctagaggta cccgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 1200

　　cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 1260

　　gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 1320

　　tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattgtgccc 1380

　　agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 1440

　　ttaccatggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc 1500

　　cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg 1560

　　gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc 1620

　　ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga 1680

　　ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgctgcga 1740

　　cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 1800

　　ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 1860

　　tagctgagca agaggtaagg gtttaaggga tggttggttg gtggggtatt aatgtttaat 1920

　　tacctggagc acctgcctga aatcactttt tttcaggttg gaccggtgcc accatggact 1980

　　ataaggacca cgacggagac tacaaggatc atgatattga ttacaaagac gatgacgata 2040

　　agatggcccc aaagaagaag cggaaggtcg gtatccacgg agtcccagca gccgacaaga 2100

　　agtacagcat cggcctggac atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg atcaccgacg 2160

　　agtacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg cacagcatca 2220

　　agaagaacct gatcggagcc ctgctgttcg acagcggcga aacagccgag gccacccggc 2280

　　tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc tatctgcaag 2340

　　agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga ctggaagagt 2400

　　ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc aacatcgtgg 2460

　　acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag aaactggtgg 2520

　　acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac atgatcaagt 2580

　　tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac gtggacaagc 2640

　　tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc atcaacgcca 2700

　　gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga cggctggaaa 2760

　　atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggaaac ctgattgccc 2820

　　tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag gatgccaaac 2880

　　tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc cagatcggcg 2940

　　accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc ctgctgagcg 3000

　　acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct atgatcaaga 3060

　　gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg cagcagctgc 3120

　　ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc ggctacattg 3180

　　acggcggagc cagccaggaa gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg gaaaagatgg 3240

　　acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg aagcagcgga 3300

　　ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg agagctgcac gccattctgc 3360

　　ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc gagaagatcc 3420

　　tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc agattcgcct 3480

　　ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa gtggtggaca 3540

　　agggcgcttc cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag aacctgccca 3600

　　acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg tataacgagc 3660

　　tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg agcggcgagc 3720

　　agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc gtgaagcagc 3780

　　tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc tccggcgtgg 3840

　　aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt atcaaggaca 3900

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　　agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac agcctgacct 4200

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　　ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca gtgaaggtgg 4320

　　tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg atcgaaatgg 4380

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　　tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc agatcctgaa agaacacccc gtggaaaaca 4500

　　cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaatgggcgg gatatgtacg 4560

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　　agagctttct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct gaccagaagc gacaagaacc 4680

　　ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag aggtcgtgaa gaagatgaag aactactggc 4740

　　ggcagctgct gaacgccaag ctgattaccc agagaaagtt cgacaatctg accaaggccg 4800

　　agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg ccggcttcat caagagacag ctggtggaaa 4860

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　　ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca aagtgcgcga gatcaacaac taccaccacg 5040

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　　agagcgagca ggaaatcggc aaggctaccg ccaagtactt cttctacagc aacatcatga 5220

　　actttttcaa gaccgagatt accctggcca acggcgagat ccggaagcgg cctctgatcg 5280

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　　tggggatcac catcatggaa agaagcagct tcgagaagaa tcccatcgac tttctggaag 5640

　　ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc tgatcatcaa gctgcctaag tactccctgt 5700

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　　acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gacacggatc gacctgtctc 6180

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　　gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gagaatagca ggcatgctgg 6480

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　　gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc 6600

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　　agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 7560

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　　atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 7740

　　ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 7800

　　gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 7860

　　ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 7920

　　ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 7980

　　gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 8040

　　ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 8100

　　gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 8160

　　ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 8220

　　gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtggaagccg cggtatcatt 8280

　　gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 8340

　　caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 8400

　　cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 8460

　　ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctc 8505

　　<210> 5

　　<211> 8508

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列(Artificial Sequence)

　　<220>

　　<223> CMAH-CRISPR/Cas9 打靶载体

　　<400> 5