一种视网膜双极细胞病变模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及医学工程技术领域，具体而言，涉及一种视网膜双极细胞病变模型的构建方法及其应用。
背景技术
视网膜双极细胞(Bipolar cell)是脊椎动物视网膜的谷氨酸中间神经元，接受光感受器细胞的信号输入，在整合后传递至无长突细胞和神经节细胞，双极细胞在视网膜信号传递的过程处于一个类似中转站的关键位置。
现已发现在多种视网膜疾病的发生发展中均伴随双极细胞的病变。视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa,RP)是一种导致视力丧失的进行性、遗传性致盲眼底病，通常为视网膜光感受器异常所致，临床要表现为慢性进行性视野缺失，夜盲，色素性视网膜病变和视网膜电图异常，最终可导致失明。对RP相关的动物模型研究发现，在视网膜变性过程中，视网膜双极细胞会出现病变的现象。这种病变包括双极细胞在变性过程中失去树突以及胞体丢失现象。而双极细胞的这些病变也同时会影响到双极细胞的视觉传递功能，导致相关视网膜疾病的病情加重甚至失明。
然而，对于双极细胞病变在相关视网膜疾病发生发展中的作用尚不明了，并且双极细胞病变所致疾病表型的具体分子机制尚不清楚，这为该类疾病的临床诊断和治疗带来极大阻碍，因此有必要对双极细胞病变的详细致病机制进行深入研究。
目前，缺乏相应的双极细胞病变模型。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种视网膜双极细胞病变模型的构建方法及其应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
一种视网膜双极细胞病变模型的构建方法，其包括：敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因。
Yap1(Yes-associated protein 1，MGI:103262)基因位于小鼠9号染色体7,931,999-8,004,596bp，全长7.26kb，该基因在小鼠中共有10个转录本。其中最长转录本cDNA全长4171bp，包含9个外显子。
Yap1是Hippo信号通路(Hippo pathway)的一个下游转录因子，参与发育、生长、修复和体内平衡。早期研究人员发现，在Hippo信号通路正常的情况下，YAP1处于非激活状态;当Hippo信号通路中的某些分子发生突变时，YAP1处于超激活状态。此时，超激活状态下的YAP1可以促进细胞增殖、转移、生存以及维持干细胞活性。由于YAP1的超激活可以促进肿瘤的发生与发展，因此，YAP1被定义为一个癌蛋白。Yap1基因作为该信号通路的转录调节因子，在多种癌症的发生和发展中发挥重要作用，参与癌细胞的增殖分化以及肿瘤组织的血管生成，并可能成为癌症治疗的潜在靶点。
目前尚无针对Yap1蛋白在视网膜及视觉功能维持中作用的研究报道，其详细作用机制以及其在视网膜中的生物学功能还不甚明了。因此，深入研究Yap1对视网膜双极细胞病变类疾病的治疗及病因探讨潜力巨大。但是目前对Yap1的研究还处于初期阶段，其在小鼠体内的具体作用机制尚不清楚，限制了其开发应用。
发明人创造性的提供了一种高效稳定的Yap1基因敲除动物模型构建方法，为研究Yap1蛋白在视网膜及视觉功能中的作用提供了模型支持。
发明人首次发现，在目标动物的视网膜双极细胞中敲除Yap1基因即沉默其表达，可以使得目标动物表现出视网膜双极细胞病变性疾病相关的特征，例如双极细胞死亡，主要表现为双极细胞受损、变性，视网膜内核层逐渐变薄，视网膜外核层及其他相关细胞层出现相应病理改变。因此，视网膜双极细胞中的Yap1基因被敲除的动物可以作为视网膜双极细胞病变疾病模型，并用于视网膜双极细胞病变疾病研究等领域中，为该疾病的研究例如发病过程、机制以及相关药物的筛选提供一种新的模型。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因是指敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因的外显子序列。
敲除Yap1基因序列可以是敲除Yap1基因全长序列，敲除Yap1基因的外显子序列，也可以是敲除Yap1基因部分序列例如部分外显子序列，无论敲除那种类型(部分或全长)的序列，只要是能够在双极细胞中沉默Yap1基因的表达，使动物表现出视网膜双极细胞病变类疾病相应特征即落入本发明的保护范围。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因的第1号到第9号外显子中的至少一个外显子序列。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因的第1号到第2号外显子序列。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述构建方法包括：采用Cre-loxP敲除技术、CRISPR/Cas9技术、人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术或转录激活因子样效应物核酸酶技术敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因。
在其他实施方式中，也可以是siRNA介导的基因沉默技术。此外，采用其他手段实现Yap1基因的敲除也属于本发明的保护范围。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述目标动物选自小鼠、大鼠、狗、猪、猴、兔、牛、马、羊和猿中的任意一种。
无论选用何种动物，只要是具有Yap1基因的动物，均可作为本发明所述构建方法中的目标动物，在其双极细胞中敲除Yap1基因，使其表现出视网膜双极细胞病变类疾病特征，作为视网膜双极细胞病变疾病模型，用于视网膜双极细胞病变类疾病研究领域中，均属于本发明的保护范围。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述构建方法是采用Cre-loxP敲除技术敲除目标动物视网膜双极细胞基因组中的Yap1基因，目标动物为小鼠，其包括：将条件性敲除Yap1基因的首建小鼠与野生型鼠交配繁殖，获得条件性敲除Yap1基因的杂合子小鼠，然后将条件性敲除Yap1基因的杂合子小鼠进行相互交配，得到Yap1基因条件性敲除纯合子小鼠，将纯合子小鼠与Chx10-Cre基因动物交配，得到视网膜双极细胞Yap1条件性敲除基因小鼠。
条件性敲除Yap1基因的首建小鼠(Yap1 cko小鼠，027929)购自美国杰克森实验室，Chx10-Cre转基因小鼠(MGI:5302217)购自美国杰克森实验室(Jackson laboratory)。此转基因小鼠表达视网膜双极细胞(Bipolar cell)特异蛋白启动子驱动的经过特殊改造的Cre基因。将纯合子小鼠与Chx10-Cre基因动物交配得到视网膜双极细胞Yap1条件性敲除基因小鼠。改造的Cre蛋白可以进入双极细胞的细胞核，识别基因组上LoxP位点，实现Yap1基因的条件性敲除。Chx10为双极细胞特异表达的基因，可以介导Cre在该细胞特异表达。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述条件性敲除Yap1基因的首建小鼠的Yap1基因带有loxP位点;
优选的，条件性敲除Yap1基因的首建小鼠购自美国杰克森实验室，No：032192。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述将条件性敲除Yap1基因的首建小鼠与野生型鼠交配繁殖后，进行基因型鉴定，筛选获得条件性敲除Yap1基因的杂合子小鼠。
由任一项的视网膜双极细胞病变模型的构建方法所得到的视网膜双极细胞病变模型在筛选用于预防或治疗视网膜双极细胞病变类疾病药物中的应用。
本发明的构建方法得到的动物模型具有典型视网膜双极细胞病变特征，具有非常广阔的应用前景，例如将其用于研究视网膜双极细胞病变类疾病的发病过程、发病机制，为深入了解研究该类疾病提供基础。又或者将其用于筛选用于预防或治疗视网膜双极细胞病变类疾病药物、用于评价药物的疗效或预后等。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种视网膜双极细胞病变模型的构建方法及其应用，本发明首次发现，在目标动物的视网膜双极细胞中敲除Yap1基因即沉默其表达，可以使得目标动物表现出视网膜双极细胞病变性疾病相关的特征，例如双极细胞死亡，主要表现为双极细胞受损、变性，视网膜内核层逐渐变薄，视网膜外核层及其他相关细胞层出现相应病理改变。因此，敲除Yap1基因的目标动物可以作为视网膜双极细胞病变模型，该模型可以用于研究视网膜双极细胞病变类疾病的发病过程、发病机制，为深入了解研究该类疾病提供基础。也可以将视网膜双极细胞病变模型用于筛选用于预防或治疗视网膜双极细胞病变类疾病药物、用于评价药物的疗效或预后等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为视网膜双极细胞特异敲除Yap1基因小鼠(Yap1ChxKO)的鉴定图;
图2为免疫组化方法检测Yap1基因在野生型小鼠视网膜中的表达情况;
图3为暗适应视网膜电图(Electroretinogram,ERG)检测结果;
图4为暗适应ERG中震荡波幅(OPS)检测结果图;
图5为视网膜双极细胞特异敲除Yap1基因小鼠视网膜切片免疫组化染色结果图;
图6为实施例5视网膜双极细胞特异敲除Yap1基因小鼠IHC染色结果图;
图7为实施例6视网膜双极细胞特异敲除Yap1基因小鼠IHC染色结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种视网膜双极细胞病变模型的构建方法。本实施例以小鼠为目标动物，对本发明提供的视网膜双极细胞病变模型的构建方法进行说明，Yap1基因敲除的路线参照图1所示，具体操作如下：
1)获得Yap1基因敲除的首建小鼠，该敲除型小鼠的Yap1基因第1-2号外显子两端有同向排列loxP位点;
2)将步骤1)得到的首建敲除型小鼠和野生型小鼠交配繁育，在后代中筛选出Yap1基因敲除的杂合子小鼠;
3)将步骤2)得到的Yap1基因条件性敲除杂合子小鼠相互交配繁育，得到Yap1基因条件性敲除纯合子小鼠;
4)将步骤3)得到的Yap1基因条件性敲除纯合子动物与转Chx10-Cre基因动物交配，得到视网膜双极细胞条件性敲除Yap1基因动物，即可作为视网膜双极细胞病变疾病模型。
对新生小鼠的基因型进行鉴定的方法如下：
1)剪小鼠尾梢少许组织样本，置于干净的1.5ml离心管中;
2)在离心管中加入100μl裂解液(40mM NaOH，0.2mM EDTA溶液)，并在金属浴100℃加热1h;
3)取出离心管，冷却至室温后，加入100μl的中和液(40mM Tris-HCl，pH5.5)，10000g离心2min后，取上清用于小鼠基因型鉴定。
4)进行PCR扩增：按照如下体系配置PCR反应体系。
2×Taq Mix，10μL;
尾巴组织裂解液，2μL;
引物1(Yap1-loxP-Forward或Rod-Cre-Forward)，1μL(浓度：10mM)。
引物2(Yap1-loxP-Reverse或Rod-Cre-Reverse)，1μL(浓度：10mM)。ddH2O，6μL。
引物序列如下：
Yap1-loxP-Forward序列：5’-GGTGGATTTCTCAGTTCAAGG-3’;
Yap1-loxP-Reverse序列：5’-AGTCAGGGTTTCCATTGCTG-3’;
Chx10-Cre-Forward序列：
5’-TCAGTGCCTGGAGTTGCGCTGTGG-3’;
Chx10-Cre-Reverse序列：
5’-CTTAAAGGCCAGGGCCTGCTTGGC-3’。
扩增程序为：
将装有PCR反应体系的反应管在PCR仪上于95℃预加热5分钟使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于95℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度58℃，保持30秒，使引物与模板充分退火;在72℃保持30秒，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环25次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持5分钟，使产物延伸完整，4℃保存。
5)凝胶电泳
称取1g琼脂糖放于100ml TAE buffer中,微波炉中融化后制成1%的琼脂糖胶。取10ul PCR产物于加样孔中，120V恒压琼脂糖电泳15min，用凝胶成像系统成像。
图1中示出了凝胶电泳结果图，在图1中的B图中，上图为Yap1基因条件性敲除鉴定结果，WT表示野生型对照，条带大小为183bp;Het表示杂合子，有两个条带，分别为183bp和237bp;Yap1ChxKO表示纯合子，条带大小为237bp。下图是Chx10-Cre鉴定结果。Chx10-Cre大小为187bp。根据图1的结果，显示所采用的鉴定方法可对新生小鼠的基因型进行有效鉴定，以便进行后续研究。图1结果显示，得到了视网膜双极细胞Yap1条件性敲除基因小鼠。
实施例2
免疫组化(IHC)实验分析Chx10-Cre敲除小鼠视网膜中基因敲除效率。
视网膜冰冻切片免疫染色：取3月龄的实施例1构建得到的视网膜双极细胞特异敲除Yap1基因小鼠，断颈处死，快速取眼球，并放入4%的PFA中，冰上固定15min后，在角膜上剪口，然后继续冰上固定。2h后，PBS缓冲液冲洗3遍，然后将眼球置于30%蔗糖溶液中脱水2h，然后解剖镜下剪去角膜及晶体，OCT包埋并迅速置于-80℃冰箱冷冻。大约10min后，取出OCT包埋的眼球，置于冰冻切片机-25℃平衡约30min后即可切片。切片厚度为12μm。
切片完成后，选取质量较高的片子于37℃烘箱放置30min，然后免疫组化笔在有视网膜组织的地方画圈，PBS洗三遍以去除OCT，然后5%的NDS(含有0.25%Triton)封闭通透2h，孵育一抗Yap1(Rabbit)以及PKCα(Mouse)，4℃过夜。第二天，PBS清洗三次后，孵育相应的荧光二抗，然后再用PBS清洗三次，封片，观察。
结果见图2中的C图所示。在小鼠3月龄时，通过视网膜冰冻组织切片染色Yap1抗体后发现，相较于野生型小鼠，敲除型小鼠视网膜双极细胞Yap1表达消失，表明其在视网膜双极细胞中被特异性敲除。ONL：Outer nuclear layer(外核层);INL：Inner nuclear layer(内核层)。
免疫印迹(Western blot)实验分析Chx10-Cre敲除小鼠视网膜中基因敲除效率。
方法包括：
1)分别获取对照和敲除小鼠视网膜(实施例1中获得的小鼠模型)，充分研磨后加入200ul蛋白裂解液RIPA。
2)超声破碎细胞后，在冰上裂解20min。
3)4℃，16000g离心10min后，取上清转移至另一干净离心管，加入50μl的蛋白上样液，混匀后95℃加热5min。
4)待样本冷却后，分别取20μl，160V电压进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分离蛋白。
5)SDS-PAGE结束后，根据需要，裁剪适当大小的硝酸纤维素膜，按顺序铺上滤纸、胶、硝酸纤维素膜及滤纸，并赶去气泡，转膜槽放入冰水浴中，采用恒流0.28A的电流进行转膜，转膜2h。
6)转膜完毕后，纯水冲洗硝酸纤维素膜一遍，晾干并标记。然后用8%的脱脂牛奶封闭2h。
7)封闭完成后，加入一定量的按一定比例(按照抗体使用说明书)稀释于封闭液的一抗Yap1(Rabbit)以及内参Gapdh(Rabbit)，4℃孵育过夜。
8)回收一抗，1×TBST缓冲液洗膜4次，每次10min，用1×TBST稀释辣根过氧化氢酶(HRP)标记的抗兔二抗，室温于摇床上孵育2h。
9)二抗孵育结束后，用1×TBST洗膜3次，每次10min，用Thermo的ELC发光试剂盒检测蛋白，所用仪器为Bio-Rad的化学发光凝胶成像系统。
免疫印迹检测结果参照图2中的A图所示。免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)染色结果表明Yap1在视网膜双极细胞中被敲除。
实施例3
对12月龄的实施例1的Yap1基因敲除小鼠进行ERG视力检测：
1)暗适应动物应整夜暗适应，环境应做到绝对没有光线;
2)次日麻醉：称重，腹腔内注射;宜深度麻醉;
3)动物固定及散瞳：麻醉完成后，在暗红光照明下将小鼠用胶带固定在动物试验平台的前方：需保证小鼠正\"趴\"，即相对于闪光刺激器的刺激口，双眼高度一致，充分暴露，滴加散瞳剂。
4)电极安装：将视网膜电图仪(Espion Visual Electrophysiology System,DiagnosysLLC,Lit-tleton,MA,USA)预热后，在电极涂上导电膏，夹住小鼠尾巴，插入放大器“地”接口;双头的针电极插入后颈皮(大约在两耳中间)，同时接两个通道的“负”接口;金环电极夹在动物实验平台的电极支架上，仔细调整其角度，轻微的接触角膜的中心顶端。一通道正极接右眼，二通道正极接左眼。通过针管对双眼滴生理盐水，改善电极及角膜的接触效果。保证两个金环电极以相同的角度、方式接触两眼角膜中心正端的相同位置。
5)记录示波信号确认无误后，关闭暗红光。可以先尝试记录一下暗适应光强为0.003cd/s·m2的ERG检测，确认一下信号的质量：如果双眼的振幅出现了与预期不同的较大差异，建议再次检查金环电极的安装位置。然后依次记录暗适应光强为0.03/0.3/3.0/20.0cd/s·m2的信号，记录后系统将自动打开背景光。
结果参照图3所示，在12个月时，相较于Yap1Ctrl(野生)小鼠，Yap1ChxKO(视网膜双极细胞敲除)小鼠的a波和b波在暗适应条件下均明显降低，表明Yap1在双极细胞敲除后导致视力受损。A-D：不同光强下Yap1基因敲除小鼠的暗适应视网膜电图轨迹图，E:不同光强下Yap1基因敲除小鼠的暗适应视网膜电图a波统计，F:不同光强下Yap1基因敲除小鼠的暗适应视网膜电图b波统计。
此外，对暗适应视网膜电图的震荡波幅(OPS)进行分析，参照图4所示，发现在12个月时，相较于Yap1Ctrl(野生)小鼠，Yap1ChxKO(视网膜双极细胞敲除)小鼠的OPS波在暗适应条件下均明显降低，表明Yap1敲除小鼠视网膜内层(Inner retina)细胞功能受损。A-C：不同光强下Yap1基因敲除小鼠的暗适应视网膜电图OPS波的轨迹图;D:不同光强下Yap1基因敲除小鼠的暗适应视网膜电图OPS波统计。
实施例4
视网膜石蜡切片H&E染色：
对12月龄小鼠的视网膜进行石蜡切片、苏木精-伊红染色法(H&E染色方法)染色，具体操作如下：
1)快速取小鼠眼球组织，并置于固定液中固定24h;
2)石蜡包埋，切片，厚度为4μm;
3)切片常规用二甲苯脱蜡，经多级乙醇至水洗：二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ)5min→100%乙醇2min→95%的乙醇1min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→蒸馏水洗2min;
4)苏木素染色5分钟，自来水冲洗;
5)盐酸乙醇分化30秒;
6)自来水浸泡15分钟;
7)置伊红液2分钟。
8)常规脱水，透明，封片：95%乙醇(I)1min→95%乙醇(Ⅱ)1min→100%乙醇(I)1min→100%乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3：1)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封固。
9)显微镜下拍照。
参照图5所示，结果显示在12个月时，相较于Yap1Ctrl(野生)小鼠，Yap1ChxKO(实施例1获得的视网膜双极细胞敲除模型)小鼠的视网膜内核层已经开始变薄，表明双极细胞死亡。图7中的B图为对不同部位的Yap1敲除鼠视网膜内核层厚度统计图。
实施例5
视网膜冰冻切片免疫染色：取12月龄的实施例1构建得到的视网膜双极细胞特异敲除Yap1基因小鼠断颈处死后，快速取眼球，并放入4%的PFA中，冰上固定15min后，在角膜上剪口，然后继续冰上固定。2h后，PBS缓冲液冲洗3遍，然后将眼球置于30%蔗糖溶液中脱水2h，然后解剖镜下剪去角膜及晶体，OCT包埋并迅速置于-80℃冰箱冷冻。大约10min后，取出OCT包埋的眼球，置于冰冻切片机-25℃平衡约30min后即可切片。切片厚度为12μm。
切片完成后，选取质量较高的片子于37℃烘箱放置30min，然后免疫组化笔在有视网膜组织的地方画圈，PBS洗三遍以去除OCT，然后5%的NDS(含有0.25%Triton)封闭通透2h，孵育一抗，4℃过夜。第二天，PBS清洗三次后，孵育相应的荧光二抗，然后再用PBS清洗三次，封片，观察。
结果参照图6所示。在小鼠12月龄时，通过视网膜冰冻组织切片染色双极细胞抗体PKCα后发现，相较于Yap1Ctrl(野生)小鼠，Yap1ChxKO(视网膜双极细胞敲除)小鼠视网膜双极细胞数量明显减少，出现明显病变表征，出现变性退化。
实施例6
视网膜冰冻切片免疫染色：取3月龄的实施例1构建得到的视网膜双极细胞特异敲除Yap1基因小鼠断颈处死后，快速取眼球，并放入4%的PFA中，冰上固定15min后，在角膜上剪口，然后继续冰上固定。2h后，PBS缓冲液冲洗3遍，然后将眼球置于30%蔗糖溶液中脱水2h，然后解剖镜下剪去角膜及晶体，OCT包埋并迅速置于-80℃冰箱冷冻。大约10min后，取出OCT包埋的眼球，置于冰冻切片机-25℃平衡约30min后即可切片。切片厚度为12μm。
切片完成后，选取质量较高的片子于37℃烘箱放置30min，然后免疫组化笔在有视网膜组织的地方画圈，PBS洗三遍以去除OCT，然后5%的NDS(含有0.25%Triton)封闭通透2h，孵育一抗，4℃过夜。第二天，PBS清洗三次后，孵育相应的荧光二抗，然后再用PBS清洗三次，封片，观察。
结果参照图7所示。在小鼠12月龄时，通过视网膜冰冻组织切片染色神经胶质细胞标记物GFAP后发现，相较于野生型小鼠，敲除型小鼠视网膜出现明显胶质细胞增生，炎症反应增强，表明视网膜损伤。
综上，可以看出，本发明实施例以小鼠为例，通过Cre-loxP敲除技术在其视网膜双极细胞中特异性敲除Yap1基因，使小鼠表现出视力受损，视网膜双极细胞退化以及丢失等视网膜双极细胞病变典型表征。由此充分说明，在视网膜双极细胞条件性敲除Yap1基因，可以使目标动物表现出视网膜双极细胞病变。视网膜双极细胞条件性敲除Yap1基因的动物，可以作为视网膜双极细胞病变类疾病模型。该疾病模型可以用于视网膜双极细胞病变疾病研究等领域中，为该疾病的研究例如发病过程、机制以及相关药物的筛选提供一种新的模型。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
