一种有柄石韦的孢子体繁殖方法及其应用
技术领域
本发明涉及有柄石韦繁殖技术领域，具体是一种有柄石韦的孢子体繁殖方法及其应用。
背景技术
有柄石韦[Pyrrosia petiolosa(Christ)Ching]为水龙骨科(Polypodiaceae)石韦属(Pyrrosia)石生型蕨类植物，孢子叶背面被厚层星毛状覆盖，有大量孢子囊群。由于有柄石韦具有利尿通淋、清湿热等功效，具有较高的药用价值，因此有柄石韦的需求量也在不断增加。但是，近年来，随着有柄石韦临床用药量的逐渐增大，野生资源也随之减少，这就需要人工培育来提高繁殖效率。从培养条件方面研究影响GGB(green globular bodies，绿色团状小球，绿色球状体)转化成孢子体的因素，是有柄石韦植株快速繁殖的关键。
目前关于有柄石韦繁殖方法的研究多见于分株繁殖，培养周期较长，一般超过两个月的时间，尚未发现培育出有柄石韦孢子体的相关报道。组织培养具有繁殖速度快、繁殖系数高等特点，但是在许多石韦属植物的孢子组织培养研究中只能获得大量原叶体，难以获得幼孢子体。因此，建立有柄石韦孢子体繁殖体系可为其工厂化育苗提供理论和技术支持。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种有柄石韦的孢子体繁殖方法，以解决上述背景技术中提出的现有有柄石韦繁殖方法大多是分株繁殖，存在培养周期较长的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种有柄石韦的孢子体繁殖方法，包括以下步骤：
1)选取成熟的有柄石韦孢子叶，消毒后从孢子叶上获得孢子粉末，得到消毒的外植体材料;
2)将步骤1)中得到的所述外植体材料接种到萌发培养基中进行有柄石韦孢子萌发，得到片状原叶体;其中，所述萌发培养基是不添加蔗糖的MS培养基(Murashige andSkoog culture medium)稀释成不同浓度得到的培养基，且所述萌发培养基的pH值为5.6-6.0;
3)将步骤2)中得到的所述片状原叶体转接至增殖培养基上进行增殖，得到原叶体团;所述增殖培养基是设计不同浓度的蔗糖溶液分别和B5培养基与1/2B5培养基进行组合得到，所述B5培养基即甘博格(Gamborg)等1968年设计的B5培养基，且所述增殖培养基的pH值为5.6-6.0;
4)将步骤3)中得到的所述原叶体团进行光照诱导，得到幼孢子体团。
需要说明的是，所述有柄石韦孢子叶为2018年10月于贵州安顺市采收孢子囊饱满且健壮的成熟孢子叶，用毛刷将孢子叶表面杂物轻轻扫落，装进硫酸纸袋置于4℃冰箱中保存，备用。消毒整个过程均在超净工作台上进行，滤纸和接种工具均为无菌。
作为本发明进一步的方案：所述消毒是将成熟的有柄石韦孢子叶用酒精、无菌水与HgCl2溶液进行消毒。
优选的，所述消毒是将成熟的有柄石韦孢子叶用体积浓度是70%的酒精浸泡30s，在无菌水里冲洗3次，再用0.1wt%的HgCl2溶液浸泡8min，最后用无菌水冲洗5次。
作为本发明再进一步的方案：所述获得孢子粉末是先用无菌滤纸将孢子叶表面水分吸干，再用无菌手术刀从孢子叶上将孢子粉末轻轻刮落，获得消毒的外植体材料。
作为本发明再进一步的方案：所述选取成熟的有柄石韦孢子叶是选择有柄石韦的成熟孢子叶，用毛刷将孢子叶表面杂物轻轻扫落，装进硫酸纸袋置于0-10℃(优选4℃)冰箱中保存，备用。
优选的，所述萌发培养基的pH值为5.8。
进一步优选的，所述萌发培养基以1/8MS培养基按照琼脂6g/L进行加入琼脂制备。
作为本发明再进一步的方案：所述萌发是在培养温度25±2℃下采用日光灯光源进行光照，光照强度为1000-1500lx(勒克斯)，光照时间为10-14h/d。
优选的，所述萌发的培养温度25±2℃，采用日光灯光源进行光照，光照强度为1000-1500lx(勒克斯)，光照时间为12h/d。
作为本发明再进一步的方案：所述不同浓度的蔗糖溶液是浓度为0-30g·L-1的蔗糖溶液。
作为优选方案：所述增殖培养基是以B5培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L制备的培养基为片状原叶体最佳的增殖培养基。
作为本发明再进一步的方案：所述增殖是在培养温度25±2℃下采用日光灯光源进行光照，光照强度为1000-1500lx(勒克斯)，光照时间为10-14h/d。
优选的，所述增殖的培养温度25±2℃，采用日光灯光源进行光照，光照强度为1000-1500lx(勒克斯)，光照时间为12h/d。
作为本发明再进一步的方案：所述光照诱导具体是在培养温度25±2℃下采用日光灯光源进行光照，光照时间为10-14h/d，光照强度为1000-3000lx(勒克斯)，且在光照诱导中每天进行喷水。
优选的，所述光照诱导具体是在培养温度25±2℃下采用日光灯光源进行光照，光照时间为12h/d，光照强度为1000-3000lx(勒克斯)，每天喷一次水。
作为本发明再进一步的方案：所述原叶体团进行光照诱导前还包括将所述原叶体团进行炼苗的步骤。
作为本发明再进一步的方案：所述原叶体团进行光照诱导前还包括：将所述原叶体团进行炼苗3-5d后，从增殖培养基中取出GGB(绿色团状小球)，将GGB基部的培养基清洗干净后种植于装有蛭石的穴盘中。
优选的，在种植于装有蛭石的穴盘中，所述蛭石进行灭菌处理，即121℃高压蒸汽灭菌30min，灭菌完毕后将蛭石置于烘箱中进行烘干处理;穴盘使用前用5%次氯酸钠溶液进行表面消毒，晾干后装入灭菌好的蛭石，压实整平，整盆浸水直至基质表面湿润。
作为本发明再进一步的方案：在所述有柄石韦的孢子体繁殖方法中，还包括移栽的步骤，所述移栽是将光照诱导获得的幼孢子体团分离成单株幼孢子体，将单株幼孢子体移栽至基质中，浇水进行常规管理，得到有柄石韦植株。
作为本发明再进一步的方案：所述基质是河沙、园土、石英砂、蛭石、松针土、树皮或珍珠岩中的任意一种或多种。
优选的，所述基质是以下6种基质之一：A.河沙;B.园土;C.石英砂;D.蛭石;E.河沙：园土：松针土=1:1:3;F.蛭石：树皮：珍珠岩=2:1:1。
作为本发明再进一步的方案：所述移栽至基质中是按2-3cm的行距将单株幼孢子体移栽至基质中。
优选的，所述移栽至基质中是按2.5cm的行距将单株幼孢子体移栽至基质中。
作为本发明再进一步的方案：在移栽至基质中后，基质浇透水，用塑料膜盖住盆口，待幼植株适应后揭开薄膜，进行常规管理。
本发明实施例的另一目的在于提供一种所述的有柄石韦的孢子体繁殖方法在蕨类植物培育中的应用。
作为本发明再进一步的方案：在所述的有柄石韦的孢子体繁殖方法在蕨类植物培育中的应用中，在进行蕨类植物培育时，可以将有柄石韦直接替换为相应的蕨类植物进行培育，当然，也可以根据需要来灵活调整具体的参数，这里并不作限定;所述蕨类植物一般分成5个亚门：松叶蕨亚门(Psilophytina)、楔叶亚门(Sphenophytina)、石松亚门(Lycophytina)、水韭亚门(Isoephytina)和真蕨亚门(Filicophytin)，具体种类根据需求进行选择，这里并不作限定。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明实施例提供了一种有柄石韦的孢子体繁殖方法，通过将无菌的有柄石韦孢子接种于不添加蔗糖的萌发培养基中进行萌发，再转接至增殖培养基上进行增殖，然后通过经过炼苗处理和光照诱导得到有柄石韦孢子体。采用本发明的方法能够获得大量的原叶体材料，孢子萌发率为100%;培养过程中无需孢子体继代培养和生根培养两个阶段，缩短了孢子体的诱导周期，从孢子萌发到幼孢子体形成仅需60d;而且，提高了孢子体诱导率，孢子体诱导率高达85%;还可快速地获得有柄石韦植株，幼孢子体移栽成活率为100%，为工厂化育苗提供理论和技术支持，解决了现有有柄石韦繁殖方法大多是分株繁殖，存在培养周期较长的问题，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为实施例1中有柄石韦孢子萌发示意图。
图2为实施例1中有柄石韦原叶体增殖示意图。
图3为实施例1中有柄石韦孢子体诱导示意图。
图4为实施例1中有柄石韦孢子体移栽示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细地说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种有柄石韦的孢子体繁殖方法，包括以下步骤：
(1)有柄石韦孢子的选择和消毒
于2018年10月采集于贵州安顺市采收孢子囊饱满且健壮的成熟孢子叶，用毛刷将孢子叶表面杂物轻轻扫落，收集孢子叶装进硫酸纸袋，置于4℃冰箱中保存，备用;然后将孢子叶在超净工作台上进行消毒灭菌，用70%酒精浸泡30s，在无菌水里冲洗3次，再用0.1wt%HgCl2溶液浸泡8min，最后用无菌水冲洗5次;先用无菌滤纸将孢子叶表面水分吸干，再用无菌手术刀从孢子叶上将孢子粉末轻轻刮落，获得消毒的外植体材料。
(2)有柄石韦孢子萌发培养
将消毒的外植体材料接种于以1/8MS培养基按照琼脂6g/L进行加入琼脂(即每升培养基均添加琼脂6g)制备的萌发培养基中进行有柄石韦孢子萌发，得到片状原叶体，萌发培养基中不添加蔗糖，且pH值为5.8。萌发的培养温度25℃，日光灯光源，光照强度为1000-1500lx，光照时间为12h/d，图1为实施例1中有柄石韦孢子萌发的图片。萌发培养每次接种5瓶，重复3次，观察和记录孢子萌发情况。萌发时间指在培养基上出现绿色小点的时间，具体的萌发结果见表1。
表1萌发结果表
(3)有柄石韦原叶体增殖
将上述得到的所述片状原叶体转接至增殖培养基上进行增殖，得到原叶体团，增殖培养基是30g·L-1蔗糖溶液与B5培养基组合，每升增殖培养基均添加琼脂6g，pH值为5.8，增殖的培养温度25±2℃，日光灯光源，光照强度为1000-1500lx，光照时间为12h/d，每个处理接种5瓶，重复3次，30d后观察并记录原叶体生长状况。具体的增殖结果如表2所示。图2为实施例1中有柄石韦原叶体增殖的图片。
表2原叶体增殖结果
(4)有柄石韦孢子体诱导
以蛭石作为栽培基质，将其置于高压蒸汽灭菌锅中，温度为121℃，灭菌时间30min，灭菌完毕后将栽培基质置于烘箱中进行烘干处理。育苗盘使用前用5%次氯酸钠溶液进行表面消毒，晾干后装入灭菌好的栽培基质，放入基质后压实整平，整盆浸水直至基质表面湿润。将增殖后的原叶体团从培养瓶中取出，用蒸馏水洗净培养基，移植入基质中进行光照诱导，得到幼孢子体团，设置光照周期为12h/d，光照强度2000lx处理。每天喷一次水。定期观察孢子体光照诱导情况，记录孢子体形成初始时间并统计诱导率。孢子形成时间是指原叶体团到出现第一片真叶为止。具体的孢子体诱导结果见表3所示。图3为实施例1中有柄石韦孢子体诱导的图片。
表3孢子体诱导结果
(5)有柄石韦孢子体移栽
将诱导获得的幼孢子体团分离成单株幼孢子体，将单株幼孢子体移栽至基质中，基质为蛭石：树皮：珍珠岩=2:1:1。按2.5cm行距将幼孢子体移栽至基质中，基质浇透水，用塑料膜盖住盆口，待幼植株适应后揭开薄膜，进行常规管理。30d后记录幼孢子体成活率。具体的孢子体移栽结果见表4所示。图4为实施例1中有柄石韦孢子体移栽的图片。
表4孢子体移栽结果
实施例2
为了探讨不同培养基对孢子萌发的影响，下面进行如下步骤：
(1)有柄石韦孢子的选择和消毒
于2018年10月采集于贵州安顺市采收孢子囊饱满且健壮的成熟孢子叶，用毛刷将孢子叶表面杂物轻轻扫落，收集孢子叶装进硫酸纸袋，置于4℃冰箱中保存，备用;然后将孢子叶在超净工作台上进行消毒灭菌，用70%酒精浸泡30s，在无菌水里冲洗3次，再用0.1wt%HgCl2溶液浸泡8min，最后用无菌水冲洗5次;先用无菌滤纸将孢子叶表面水分吸干，再用无菌手术刀从孢子叶上将孢子粉末轻轻刮落，获得消毒的外植体材料。
(2)有柄石韦孢子萌发培养
将消毒的外植体材料接种于不同无机盐浓度的萌发培养基中进行有柄石韦孢子萌发，得到片状原叶体，所有萌发培养基均不添加蔗糖，每升萌发培养基均添加琼脂6g，pH值为5.8。萌发的培养温度25℃，日光灯光源，光照强度为1000-1500lx，光照时间为12h/d。每种培养基接种5瓶，重复3次，30d后观察和记录孢子萌发情况。萌发时间指在培养基上出现绿色小点的时间，萌发结果见表5。
表5不同培养基对孢子萌发的影响
根据表5数据可以看出，孢子在1/8不含蔗糖培养基中所需的萌发时间最短，萌发时间为15d，萌发率为100%;孢子在MS液体培养基中需要的萌发时间最长，为28d。有柄石韦最佳萌发培养基为1/8MS培养基+琼脂6g/L。
实施例3
为了探讨不同培养基及蔗糖浓度对原叶体增殖的影响，下面进行如下步骤：
将实施例2中最佳萌发培养基(最佳萌发培养基为1/8MS培养基+琼脂6g/L。)中的片状原叶体转接至增殖培养基上进行增殖，得到原叶体团;具体是设立8组含有不同浓度的蔗糖溶液与B5、1/2B5培养基组合的增殖培养基，每升培养基均添加琼脂6g，pH值为5.8，培养温度25±2℃，日光灯光源，光照强度为1000-1500lx，光照时间为12h/d，每个处理接种5瓶，重复3次，30d后观察并记录原叶体生长状况。具体结果如表6所示。
表6不同培养基及蔗糖浓度对原叶体增殖的影响
根据表6中的数据可以看出，在不添加蔗糖的1/2B5、B5培养基中，原叶体生长情势较好，颜色呈现鲜绿色，但是生长速度缓慢。其中，B5+30g·L-1蔗糖培养基中的原叶体团体积较大，生长速度快，B5+30g·L-1蔗糖培养基为原叶体增殖最佳培养基。
实施例4
为了探讨不同光照强度对孢子体诱导的影响，下面进行如下步骤：
以蛭石作为栽培基质，将其置于高压蒸汽灭菌锅中，温度为121℃，灭菌时间30min，灭菌完毕后将基质置于烘箱中进行烘干处理。育苗盘使用前用5%次氯酸钠溶液进行表面消毒，晾干后装入灭菌好的基质，放入基质后压实整平，整盆浸水直至基质表面湿润。将增殖后的原叶体团(即实施例3中的在B5+30g·L-1蔗糖培养基为原叶体进行增殖得到的原叶体团)从培养瓶中取出，用蒸馏水洗净培养基，移植入基质中，设置光周期为12h/d，光照强度分1000lx、2000lx和3000lx 3个处理。每天喷一次水。定期观察孢子体诱导情况，记录孢子体形成初始时间并统计诱导率。孢子形成时间是指原叶体团到出现第一片真叶为止。具体的结果见表7所示。
表7不同光照强度对孢子体诱导的影响
从表7中可以看出，当光照强度达到2000lx时，孢子体诱导率最高，但是诱导时间最长。诱导孢子体的最佳光照强度为2000lx。
实施例5
为了探讨不同基质对孢子体移栽的影响，下面进行如下步骤：
将诱导获得的幼孢子体团(即实施例4中诱导孢子体的最佳光照强度为2000lx得到的幼孢子体团)分离成单株幼孢子体，将单株幼孢子体移栽至以下6种基质：A.河沙;B.园土;C.石英砂;D.蛭石;E.河沙：园土：松针土=1:1:3(质量比);F.蛭石：树皮：珍珠岩=2:1:1(质量比)。按2.5cm行距将幼孢子体移栽至基质中，基质浇透水，用塑料膜盖住盆口，待幼植株适应后揭开薄膜，进行常规管理。30d后记录幼孢子体成活率。具体的结果见表8所示。
表8不同基质对孢子体移栽的影响
从表8中可以看出，在蛭石：树皮：珍珠岩=2:1:1组合基质中，移栽后的成活率高达100%;园土基质移栽的成活最低，仅为50%。因此，孢子体移栽的最适基质为蛭石：树皮：珍珠岩=2:1:1组合基质。
实施例6
与实施例1相比，除了在进行移栽至基质中，基质为松针土外，其他与实施例1相同。
实施例7
与实施例1相比，除了在进行移栽至基质中，基质为树皮外，其他与实施例1相同。
实施例8
与实施例1相比，除了在进行移栽至基质中，基质为珍珠岩外，其他与实施例1相同。
实施例9
与实施例1相比，除了在进行移栽至基质中，基质为河沙:园土:石英砂:蛭石:松针土:树皮:珍珠岩=1:1:1:1:1:1:1外，其他与实施例1相同。
实施例10
与实施例1相比，除了在进行移栽至基质中，基质为河沙:园土:石英砂:蛭石:松针土:树皮:珍珠岩=1:1:1:1:1:1:1外，其他与实施例1相同。
实施例11
与实施例1相比，除了在进行移栽至基质中，基质为园土:石英砂:蛭石:松针土:树皮:珍珠岩=1:1:1:1:1:1外，其他与实施例1相同。
实施例12
与实施例1相比，除了在进行移栽至基质中，基质为石英砂:蛭石:松针土:树皮:珍珠岩=1:1:1:1:1外，其他与实施例1相同。
实施例13
与实施例1相比，除了在进行移栽至基质中，基质为石英砂:松针土:树皮:珍珠岩=1:1:1:1外，其他与实施例1相同。
实施例14
与实施例1相比，除了在进行移栽至基质中，基质为石英砂:松针土:珍珠岩=1:1:1外，其他与实施例1相同。
实施例15
与实施例1相比，除了所述萌发培养基的pH值为5.6，所述增殖培养基的pH值为5.6外，其他与实施例1相同。
实施例16
与实施例1相比，除了所述萌发培养基的pH值为6.0，所述增殖培养基的pH值为6.0外，其他与实施例1相同。
实施例17
与实施例1相比，除了所述萌发是在培养温度27℃下采用日光灯光源进行光照，光照强度为1500lx，光照时间为14h/d以及所述增殖是在培养温度27℃下采用日光灯光源进行光照，光照强度为1500lx，光照时间为14h/d外，其他与实施例1相同。
实施例18
与实施例1相比，除了所述萌发是在培养温度23℃下采用日光灯光源进行光照，光照强度为1000lx，光照时间为10h/d以及所述增殖是在培养温度23℃下采用日光灯光源进行光照，光照强度为1000lx，光照时间为10h/d外，其他与实施例1相同。
实施例19
与实施例1相比，除了所述光照诱导是在培养温度23℃下采用日光灯光源进行光照，光照时间为10h/d，光照强度为1000lx，且在光照诱导中每天进行喷水两次外，其他与实施例1相同。
实施例20
与实施例1相比，除了所述光照诱导是在培养温度27℃下采用日光灯光源进行光照，光照时间为14h/d，光照强度为3000lx，且在光照诱导中每天进行喷水一次外，其他与实施例1相同。
本发明有益效果如下，本发明实施例提供了一种有柄石韦的孢子体繁殖方法，可以缩短孢子体诱导周期，提高孢子体的诱导率。本发明以孢子为外植体，建立了有柄石韦孢子体繁殖体系，为有柄石韦野生资源的保护提供了有效方法，同时也为其工厂化育苗提供理论和技术支持;在所述有柄石韦的孢子体繁殖方法中，在组织培养过程中利用有柄石韦孢子数量多，繁殖系数大的特点，可获得大量的原叶体材料，为转化幼孢子体提供了充足的材料来源。孢子体需要通过受精作用才能获得，然而在密闭空间内没有充足的水分供给精细胞和卵细胞相结合，因此可利用不完全组织培养技术，通过人为补水的手段为有柄石韦孢子体受精过程提供适量水分，保证受精过程顺利的进行。所述有柄石韦的孢子体繁殖方法通过组织培养技术和不完全组织培养技术两者相结合可大大缩短孢子体形成周期，还可以提高孢子体的诱导率，从而获得大量的有柄石韦种苗。采用本发明方法的孢子萌发率高达100%，孢子体诱导率可达85%，孢子体移栽后的成活率达100%，从孢子萌发到幼孢子体形成仅需60d(天)，目前关于有柄石韦繁殖方法的研究多见于分株繁殖，培养周期较长，一般超过两个月的时间，因此，本发明提供的有柄石韦的孢子体繁殖方法缩短了培养周期，具有广阔的市场前景。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
