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OsNRT2.3b在提高产量与稻米品质中的应用

2020-10-26 13:46:21

　　OsNRT2.3b在提高产量与稻米品质中的应用

　　技术领域

　　本发明属于基因工程技术领域，涉及OsNRT2.3b在提高产量与稻米品质中的应用。

　　背景技术

　　稻米(Oryza sativa L.)是数十亿人的重要主食(Zeng,et al.,2017)。作为一个农业大国，我国是世界上最早种植水稻的国家之一，目前也是我国最重要的粮食作物之一(陈立刚,2019,司徒淞,等，2000)。长期以来，为提高水稻产量，农户一直把施肥作为水稻生产最重要的物化技术措施。我国传统农业十分重视有机肥的使用，它具有促进作物增产、改善品质、提升土壤质量等作用，但存在肥效慢、养分含量低、施用量大费劳力及增产效果差等缺点(周江明，2012)。无机肥虽有增产快、养分高、用量少等优点，但当前因农户过度施用已造成粮食生产成本高、土壤质量退化、农业面源污染严重等问题。人民的生活水平有了很大提高，这也直接导致了人们对稻米品质的要求越来越高，粮食数量与质量二者结构性矛盾愈发明显，因此要从关键环节肥料入手，以解决“稻强米弱”的现象(徐年龙等，2018)。

　　在作物所有必需营养元素中，氮是限制植物生长和形成产量的首要因素。氮(N)素是作物从土壤中吸收量最多的元素，其对作物的生命活动和产量形成具有重要意义。近年来人们从分子水平上对硝态氮的吸收系统进行了大量研究。已发现两类基因NRT1和NRT2分别于与低亲和硝态氮转运系统(LATS)和高亲和硝态氮转运系统(HATS)有关。对于某些高亲和硝酸盐运输蛋白需要其伴侣蛋白调控其活性，拟南芥(AtNRT2.1)、大麦(HvNRT2.1)以及水稻(OsNRT2.1、 OsNRT2.2和OsNRT2.3a)等运输蛋白都需要在NAR2蛋白存在条件下才具有硝酸盐运输活性，NRT2家族基因一般具有11至12次跨膜，水稻原生质体亚细胞定位实验表明 OsNRT2.3a和OsNRT2.3b都是细胞质膜定位的跨膜蛋白，跨膜结构预测表明OsNRT2.3a和OsNRT2.3b都具有典型的硝酸盐运输蛋白跨膜结构。OsNRT2.3b在叶片和根系均表达，表达量都很低，叶片中表达丰度相对根系较高，且表达不受外界氮浓度及形态影响。

　　发明内容

　　本发明的目的是提供OsNRT2.3b在提高产量与稻米品质中的应用。

　　本发明的目的可通过以下技术方案实现：

　　OsNRT2.3b在提高产量与稻米品质中的应用。所述的OsNRT2.3b基因在NCBI数据库中登录号为：AK072215。

　　OsNRT2.3b的超表达载体在提高水稻产量与稻米品质上的应用。

　　利用超表达技术获得的OsNRT2.3b超表达材料在不同肥料处理条件下能够提高产量和稻米品质。

　　有益效果：

　　1、本发明通过系统研究，首次发现了不同肥料处理和OsNRT2.3b超表达材料在水稻株高、有效分蘖、生物量、单穗重、结实率、千粒重、单株穗重等农艺形状上存在不同程度的互作效应。首次发现不同肥料处理和水稻材料互作OsNRT2.3b超表达材料的有效分蘖、单穗重、单株产量产生极显著性差异;不同肥料处理条件下，OsNRT2.3b 超表达材料的地上部生物量、有效分蘖、单穗重、单株产量显著高于日本晴野生型 (WT-N)(图1、表1)。

　　2、本发明通过系统研究，首次发现了不同肥料处理和OsNRT2.3b超表达材料的碾磨品质(糙米率、精米率、整精米率)存在不同程度的互作效应。首次发现不同肥料处理条件下，总体OsNRT2.3b超表达材料的糙米率、整精米率高于日本晴野生型(WT-N) (表2)。

　　3、本发明通过系统研究，首次发现了不同肥料处理和OsNRT2.3b超表达材料的外观品质(水分含量、长宽比、垩白粒率、垩白度)存在不同程度的互作效应。首次发现OsNRT2.3b超表达材料在不同肥料处理条件下长宽比均高于日本晴野生型(WT-N)，垩白粒率和垩白度均显著低于日本晴野生型(WT-N)(表3)。

　　4、本发明通过系统研究，首次发现了不同肥料处理和OsNRT2.3b超表达材料的营养及食味品质(蛋白质含量、直链淀粉含量、碱消值、胶稠度)存在不同程度的互作效应。首次发现有机肥能显著降低OsNRT2.3b超表达材料的蛋白质含量。OsNRT2.3b超表达材料在不同肥料条件下蛋白质含量、碱消值显著低于日本晴野生型(WT-N)，胶稠度显著高于日本晴野生型(WT-N)，直链淀粉含量恒定，不随外界肥料高低，或者类型而改变。对照野生型精米蛋白质含量高，米饭硬度变大，黏度降低，色泽变差;胶稠度短，米饭干燥无光泽，硬而松散，口感差，稻米蒸煮和食味品质下降。说明OsNRT2.3b超表达材料蒸煮食味品质显著高于日本晴野生型(WT-N)，且外界肥料处理对其影响较小。(表4)。

　　附图说明

　　图1不同肥料处理下对OsNRT2.3b超表达材料成熟期地上部生物量的影响

　　具体实施方案：

　　实施例1 OsNRT2.3b基因超表达载体的构建

　　根据OsNRT2.3b基因的全长cDNA序列(NCBI网站查得)，用软件Primer 5.0设计扩增全长ORF引物，在引物的5’端分别设计SpeⅠ和BglⅡ两个不同的酶切位点，以用于不同的表达载体pCAMBIA1302，正义链为overNRT2.3b-F： 5’-caACTAGTGCTACCACGTGTTGGAGATG-3’，反义链overNRT2.3b-R： 5’-gaAGATCTGAGCAAACCACCAACAAG-3’，以购自NationalInstitute of Agrobiological Sciences(NIAS)OsNRT2.3b基因cDNA全长克隆质粒为模板扩增得到开放阅读框(ORF)序列。含目的基因的PCR产物经回收纯化后连入pMD19-Tcloning Vector，酶切验证并测序。测序正确的质粒分别用speI和BglⅡ酶切得到含特定酶切位点的基因片段。将目的基因片段连入pCAMBIA1302载体，得到35S::OsNRT2.3b表达载体，经酶切验证后备用。

　　实施例2 OsNRT2.3b超表达植株的获得与分子生物学鉴定

　　转基因T0代苗用潮霉素或GUS染色筛选后，得到OsNRT2.3b-Ox(35S启动子)转基因阳性50株系，将获得的转基因苗移栽至大田中繁种以便获得T0代种子。在阳性株系中，我们获得了表型与野生型相比差异明显的OsNRT2.3b-Ox转基因株系18个，为了进一步确定这些株系中目的基因是否得到增强，取T0代转基因苗叶片提总RNA进行初步的RT-PCR 鉴定，得到目的基因增强表达的株系若干，根据检测结果，选取表达增强株系作为下一步研究的材料，命名为O8(35S启动子)。

　　为了验证转基因株系遗传稳定性，将分别收获的独立株系的T0代种子以及野生型种子水培发苗，催芽2～3d后转入含有潮霉素(25mg/L)的清水中筛选1周。筛选后将生长相对一致的水稻苗移入培养箱中正常培养2周。采取植株根部及叶片样品，迅速放入液氮杯中，提取RNA后进行半定量RT-PCR检测。结果发现超表达转基因株系目的基因增强效果依然很强。我们将进行过RT-PCR检测过的T1代苗再次种到土壤里繁种获得T1代种子。

　　实施例3试验设计

　　试验设置三肥料施用水平(M:有机肥处理、NPK:无机肥处理、NPKM:有机肥)、两个肥料梯度(1:低、2:高)，即有机低(M1)、有机高(M2)、无机低(NPK1)、无机高(NPK2)、无机肥+有机肥配施低(NPKM1)、无机肥+有机肥配施高(NPKM2)共6个处理，每个处理设3 个重复，共计18个小区，随机区组排列，每个小区面积3.75m2(3m×1.25m)，小区深度1.2 m，各小区之间用砖砌混凝土隔离，防止小区之间的水肥交换。氮肥按照基肥:分蘖肥:穗肥=5: 2:3施入尿素(含N 46%)，有机肥在基肥期一次性施入，后期不施肥。其中有机肥中N≥10%，有机质含量≥20%。过磷酸钙和氯化钾则在基肥期一次性施入，后期不施。该试验依据当地常规进行田间管理，水稻长期淹水病虫草防治统一按照当地常规稻机插栽培相应培管措施执行。水稻以苗床育秧-移栽的方式种植。肥料施用量见下表。

　　附注1田间小区试验处理设置表

　　实施例4测产与拷种

　　在水稻成熟期，随机调查各小区水稻6株，按照平均有效穗数法对6株稻穗进行有效穗数、总粒数、单穗重、单株穗重、结实率、千粒重等各产量构成因子考查。结果见图1和表1。

　　实施例5稻米品质的测定

　　收获后的稻谷于室温下保存3个月以保证稻谷品质的稳定，测定前各处理统一用NP-4350 型风选机等风量风选。稻米品质参照GB/T 17891—1999《优质稻谷》的方法测定糙米率、精米率、整精米率、垩白粒率、垩白度等。精米中粗蛋白质含量和直链淀粉含量用由瑞典生产的波通DA7200近红外谷物分析仪测定。结果见表2-表4。