一种大鼠非肥胖非酒精性脂肪性肝病模型的建立方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大鼠非肥胖非酒精性脂肪性肝病模型的建立方法。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确的肝损害因素所致的，以弥漫性肝细胞脂肪变为主要特征的临床病理综合征，疾病谱包括单纯性肝脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、肝硬化和肝细胞癌。NAFLD现已经成为世界上最常见的慢性肝病之一，在成年人中的全球患病率约为25.24%。2018年我国NAFLD患病率为29.6%。NAFLD已超过病毒型肝炎，成为我国的第一大肝病，但是目前临床上尚缺乏用于NAFLD安全且有效的治疗药物。NAFLD不仅给个人和社会带来了严重的经济负担，而且严重危害国民健康。并非所有肥胖受试者都患有NAFLD，并且在非肥胖个体中也可以发现NAFLD。为了更好地了解非肥胖受试者中发生的NAFLD，我们建议使用术语“非肥胖非酒精性脂肪性肝病”。
迄今为止，NAFLD的发病机制尚未完全阐明，经典理论为“二次打击”学说。在高脂饮食、肥胖、胰岛素抵抗等因素的作用下，肝脏出现脂质沉积形成脂肪肝，即“一次打击”。肝脏脂肪变易于接受氧化应激等“二次打击”，导致炎症、坏死和纤维化进展。因此，过氧化损伤和炎症可能同时存在，共同推进NAFLD向终末期肝病的进展。最近，也有学者提出“多重打击”学说的理论，认为胰岛素抵抗，脂代谢紊乱，营养因素，肠道菌群以及遗传因素共同参与导致NAFLD的发生。但其中的具体机制尚未完全阐明。
近年来，国民的饮食结构发生的重大改变，人们摄入的干炒、煎炸等高温加工食品越来越多，而这类食品在加工过程中可产生大量自由基，其中活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)可与生物膜磷脂、多不饱和脂肪酸、核酸等大分子发生过氧化反应，引起机体氧化损伤。但这类食品的危害尚未引起广泛重视，尤其是高温干炒食品对肝脏的损害目前尚未见报道。在我们前期对NAFLD的临床资料与高危因素调查问卷分析发现，部分患者BMI未达到超重或肥胖的诊断标准，而是与摄入干炒、煎炸等高温加工食品与NAFLD的发生关系密切，通过对患者进行饮食干预，减少该类食品的摄入，可缓解NAFLD病情，改善预后。
现有的NAFLD的动物模型以高脂饮食饲喂为代表，可模拟人类NASH的组织病理学特征和代谢综合征表现。但这些模型存在一些缺点例如肝脏纤维化程度较轻，强制过量喂养脂肪，不符合中国人饮食结构等。蛋氨酸和胆碱缺乏的饮食，它可以在更短的喂养时间内复制出NASH组织学表型，可以引起更严重的炎症，氧化应激，细胞凋亡和纤维化。但是，喂食MCD饮食的动物显示出显著的体重减轻(10周内高达40%)。
这些饮食模式与我们目前的饮食模式差别较大。当前社会人们对油炸食物等高温加工食物的摄入频率明显增加，尤其是年轻人。越来越多的年轻人虽然体重指数(BMI)、血脂等指标未见明显异常，但却患有脂肪肝。关于非肥胖非酒精性脂肪性肝病的研究尚不完整，其机理尚未完全阐明。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，模拟中国人的饮食模式，提供一种大鼠非肥胖非酒精性脂肪性肝病模型的建立方法，大鼠没有明显的肥胖或消瘦，对非肥胖非酒精性脂肪肝发病机制提供研究基础，对该病的诊治具有临床意义。
具体技术方案如下：
一种大鼠非肥胖非酒精性脂肪性肝病模型的建立方法，饲喂包含高温处理大豆的人类饮食模拟饲料，所述的高温处理为140-160℃干热炒制12-18min。
所述的高温处理可以是干炒、烘烤等干热加工。
大豆(Glycine max L.)提供了膳食蛋白质中最丰富的植物来源之一。大豆的蛋白质含量从36%到56%不等。β-伴大豆球蛋白占大豆蛋白的30%，是第二大含量的大豆蛋白成分，可有效预防高脂饮食诱发的脂肪肝。膳食β-伴大豆球蛋白还可以改善高脂饮食诱发的肥胖(DIO)大鼠的NAFLD。近年来，人们对在饮食中添加大豆食品的潜在健康益处产生了浓厚的兴趣。较多研究证据集中在降低血浆胆固醇和甘油三酸酯，以预防冠心病。其他作用，包括抗糖尿病作用，减轻体重等。但是，大豆食品对人类的潜在健康影响仍然存在很大争议，经高温处理过的大豆摄入后对机体的影响尚不清楚。
模型组喂养的饲料模拟了中国人的饮食模式，干炒黄豆加入膳食后的营养物质比例符合大鼠进食饲料要求。
本发明中，在大鼠喂养第四周的时候，我们发现未热加工大豆组饲料喂养的大鼠肝脏也出现脂肪变，但是随着时间的延长，这种脂肪变并没有加重，而且没有达到成模标准，我们猜测可能生黄豆的一些成分导致的，但这种脂肪变并没有热加工黄豆组大鼠肝脏脂肪变明显，高温长时间干炒大豆加入动物饲料中会导致大鼠肝脏更严重的损伤。
进一步，所述的高温处理优选为150℃干热加工15min。
进一步，所述人类饮食模拟饲料中包括40wt%-60wt%的高温处理大豆。
再进一步，所述人类饮食模拟饲料中优选包括60wt%的高温处理大豆。
在初步实验中，当添加干炒大豆的比例低于占饲料的40wt%时，并没有达到建模标准。比例超过65wt%，饮食成分比例不符合大鼠正常饮食标准。因此我们将比例增加到60wt%，发现构成脂肪肝建模标准。我们还发现将大豆在150℃干炒20min后会变成糊状，因此为了大鼠进食量的保证，以及实验结果的准确性，我们将温度控制在15min，并使大豆保持焦状。因此，我们认为只有当高温加工食品达到一定量一定的温度时，才会在大鼠体内引起足够的氧化应激损伤。
进一步，所述人类饮食模拟饲料中，除高温处理大豆外，余量为普通大鼠饲料和未干炒大豆。
所述的普通大鼠饲料可以选用标准商品大鼠饲料。
进一步，所述的大鼠为健康的SD大鼠。
进一步，使用所述的人类饮食模拟饲料对大鼠喂养56-84天(8-12周)。
在饲喂4周时，模型组出现轻微脂肪变和纤维化;
在饲喂8周时，6只大鼠中有4只脂肪变可达整个肝脏的1/3-2/3,纤维化加重;
在饲喂12周时，6只大鼠均出现脂肪变，可达整个肝脏的1/3-2/3，纤维化进一步加重，偶见炎症坏死灶。
进一步，模型的建立包括如下步骤:
(1)实验动物选择：选择健康雄性SD大鼠，200-220g，6-8周，SPF级;
(2)实验动物准备：对实验动物维持在20-26℃适应性喂养2周;以12h:12h的明/暗周期进行饲养，并喂养普通大鼠饲料和自来水;
(3)造模：实验动物准备完成后，饲喂所述的人类饮食模拟饲料56-84天;饲喂期间实验动物自由饮水和进食，动物房保持安静，自然采光，温度22-28℃。
进一步，对造模完成的大鼠进行食物摄入量、体重、Lee’s指数统计(用于评价成年大鼠肥胖程度的指标);对造模完成的大鼠进行肝指数计算;对造模完成的大鼠进行病理组织学评估、血清生化指标评估。
可对造模期不同周数的大鼠进行上述指标的统计、计算和评估。
需要注意的是：本发明的模型病理表现以小泡性脂变为主，临床上很多人BMI和血清学检查指标正常，但是肝脏已有损伤，特别是对于肝脏脂肪变较轻的病人，临床上一些设备手段容易漏诊，因此我们的模型可能对NAFLD的诊断提供一定的借鉴意义。
本发明的部分机理分析如下：
基于临床NAFLD的复杂性，为了更好地阐明疾病的发病机制，找到潜在的治疗靶标，并评估单一或联合药物的治疗潜力，需要开发临床前有效且安全的体外和体内模型。目前在动物实验中，常用的肝损伤动物模型包括高脂模型引起的脂肪肝模型，四氯化碳引起的化学肝损伤模型，乙醇诱导的酒精引起的肝损伤模型等。尽管有一些制备方法肝损伤模型非常成熟，大多数属于病理状态，并且由于某些人日常生活中不良的生活和饮食习惯而导致的慢性肝损伤存在一些差异。国外文献对此类研究的阐述并不完全，有研究发现，与未喂食加热油的大鼠相比，每天喂1.5mL 160-190℃反复加热的油，连续喂6周，会损害大鼠体内甘油磷脂的代谢，改变肠道组织结构和微生物群的组成，然而，对肝脏的损害并没有深入报道。
食物高温加工过程中会产生大量脂质自由基，进入人体后，活性氧作用于膜磷脂的多不饱和脂肪酸等大分子，发生氧化还原反应,并通过链式反应，放大活性氧的作用，导致细胞膜及细胞器膜损伤，膜流动性下降。肝脏是人体新陈代谢的总枢纽，是氧化应激损伤的核心靶器官，活性氧(ROS)通过活化IKKβ等多种途径促进脂肪肝的发生。
在本发明构建的大鼠模型中，未观察到肥胖的迹象。我们知道有些NAFLD患者没有肥胖症状，在这些患者中，饮食成分(例如，过多的胆固醇摄入和降低的PUFA摄入，摄入过多的果糖)可能是NAFLD发生及其后续代谢变化的关键因素。非肥胖NAFLD患者中心性肥胖可能更为显著，所谓中心性肥胖是腹部肥胖，内脏脂肪过多沉积与胰岛素抵抗，促炎性细胞因子释放和内皮功能障碍密切相关。韩国的一项研究表明，相比肥胖NAFLD，非肥胖NAFLD与代谢综合征的相关性可能更强。最近显示，非肥胖NAFLD患者比肥胖NAFLD患者具有更严重的肝脏炎症和更高的死亡率。肥胖和非肥胖的NAFLD患者可能代表了两个不同的临床病原亚组，它们具有不同的遗传，环境和其他几个因素，所有这些因素都会影响疾病的发病机理和预后。
本发明的有益效果如下：
本发明在大鼠饲料中添加高温加工的大豆，成功构建了非肥胖非酒精性脂肪性肝病模型。本发明造模方法简单，符合人类饮食模式，大鼠没有明显的肥胖或消瘦，克服了现有模型的缺陷，对人类非肥胖非酒精性脂肪肝发病机制提供研究基础，对相关疾病具有临床指导意义。
此外，本发明的模型病理表现以小泡性脂变为主，临床的一些检测设备和手段对于肝脏脂肪变较轻的病人，容易漏诊，因此我们的模型可能对NAFLD的诊断提供一定的借鉴意义。
附图说明
图1为实验2中三组大鼠的日进食量统计;
图2为实验2中三组大鼠造模期三组大鼠体重、Lee’s指数变化统计;
图3为实验4中三组大鼠造模期的肝指数变化统计;
图4为实验6中三组大鼠肝脏第12周苏木精-曙红(H&E)染色图;
图5为实验6中干炒组大鼠肝脏第12周特殊表现;
图6为实验6中三组大鼠肝脏第12周Masson染色图;
图7为为实验6中三组大鼠肝脏Masson染色纤维化面积统计图;
图8为实验6中第12周三组大鼠肝脏表面形态变化。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
具体实施方式中：
实验动物由北京华富康生物科技有限公司提供;
大豆为中黄13非转基因大豆，购自中国农业科学院;
炎症因子Elisa试剂盒购自吉泰依科赛公司;
商业标准大鼠饲料购买自北京华阜康生物科技股份有限公司，名称与型号为大小鼠维持料1022，其成分如下：
上述饲料的营养成分保证值如下：
所有实验动物的护理和处理均按照《实验室动物的护理和使用指南》中的建议进行。动物实验规程已通过机构动物护理和使用委员会的批准(批准号：09-293)。
实施例1
一种大鼠非肥胖非酒精性脂肪性肝病模型的建立方法，包括如下步骤：
1、饲料配置：制备干炒大豆，干炒大豆由北京斯贝福生物技术有限公司制备，具体方法为：将大豆使用温控翻炒机进行干炒，150℃干炒15min，降温到70℃，粉碎;将上述干炒并粉碎的大豆60wt%与商业标准大鼠饲料40wt%混合均匀，获得人类饮食模拟饲料。
2、大鼠模型的建立：
(1)实验动物选择：18只健康雄性SD大鼠，200-220g，6-8周，SPF级;
(2)实验动物准备：对实验动物维持在20-26℃适应性喂养2周;以12h:12h的明/暗周期进行饲养，并喂养商业标准大鼠饲料和自来水，饲喂期间实验动物自由饮水和进食;
(3)造模：实验动物准备完成后，分成三组，每组6只，分别饲喂所述的人类饮食模拟饲料4周(28天)/8周(56天)/12周(84天);饲喂期间实验动物自由饮水和进食，动物房保持安静，自然采光，温度22-28℃;饮水为自来水。
对比例1
与实施例1的区别在于，将人类饮食模拟饲料替换成商业标准大鼠饲料;
其余技术特征与实施例1相同。
需要注意的是，对比例1与实施例1使用同一批大鼠，分配随机;并与实施例1的大鼠同时期建模喂养。
对比例2
与实施例1的区别在于，将人类饮食模拟饲料中的干炒大豆替换为未经干炒的大豆;
其余技术特征与实施例1相同。
需要注意的是，对比例2与实施例1使用同一批大鼠，分配随机;并与实施例1的大鼠同时期建模喂养。
实验
将实施例1标记为干炒组，对比例1标记为正常组，对比例2标记为未炒组，三组选用同一批大鼠，随机分配，同时进行建模。并进行各种指标检测。
实验结果表明：与其他两组相比，干炒组重量最轻，肝脏指数最小，肝脏表面颜色和特性发生明显变化，表明高温加工食品产生的有毒物质可能对大鼠的肝脏产生不利影响。
实验动物处理方法如下：
在步骤2(3)造模期的每4周、8周、12周，每组分别处死6只大鼠。大鼠处死前12小时禁食，自由饮水，第二天上午称重，用电子天平连续称取3次体重，取平均值。空腹测量血糖，大鼠麻醉后，将大鼠迅速固定在解剖板上，测量大鼠体长并拍照，体长为大鼠麻醉状态下鼻尖至肛门的长度;随后沿腹部中线依次切开皮肤，皮下组织和腹膜，以露出腹腔。腹主动脉采集大鼠血液，静置后在3000rpm下离心10分钟以去除血细胞，收集血清进行血清学检查，自动生化分析仪测量ALT，AST、TC、TG、胰岛素等指标。完全切除肝脏后，称重肝脏组织，并在4℃下用0.9%氯化钠溶液冲洗肝脏，将大鼠肝右叶、左外侧叶、左内侧叶、左中叶、尾状叶、乳头叶分别置于10%福尔马林中浸泡固定。
实验1
对实施例1、对比例2的步骤1制备的人类饮食模拟饲料与对比例1使用的商业标准大鼠饲料进行成分检测，具体结果见表1。
表1饲料成分检测表
实验2
统计三组大鼠在步骤2(3)造模期的日进食量，具体结果见图1;
根据图1与实验1的成分检测结果，三组大鼠进食总热量基本无差异。
统计三组大鼠在步骤2(3)造模期不同周数的体重、Lee’s指数(方法见实验动物处理方法)。
Lee’s指数=[体重(g)1/3x1000]/体长(cm)
具体结果见图2;由图2可见，三组大鼠体重、Lee’s指数无明显差异(P>0.05)。
本发明造模过程中大鼠的进食量、体重、Lee’s指数与喂食普通饲料的正常组没有明显差异，大鼠在造模过程中未发生肥胖。
实验3
空腹测量大鼠血糖，并进行胰岛素抵抗评估。
用快速血糖仪及配套试纸测定各组大鼠空腹血糖(FPG);免疫法测定空腹血清胰岛素(FINS);根据FPG和FINS值计算胰岛素抵抗指数HOMA-IR，HOMA-IR=(FPG×FINS)/22.5。
三组大鼠均未出现胰岛素抵抗。可能与大鼠非肥胖以及喂养周数过短有关。
实验4
对三组大鼠进行肝指数的计算。
肝指数=肝湿体重÷体重×100%;
如图3所示，与正常组相比，未炒组和干炒组大鼠肝指数逐渐下降，干炒组下降更明显。
实验5
对血清生化指标进行比较。
血清学指标检测由北京金海科隅生物技术有限公司完成。
具体结果见表2-4。
表2三组大鼠造模不同周数血清TC、TG的比较
表3三组大鼠造模不同周数血清TNF-a的比较
表4三组大鼠造模不同周数血清ALT和AST的比较
12周，干炒组和对比例1的TC和对比例2相比，差异具有统计学意义(P<0.05);8周，干炒组和对比例1的TG和对比例2相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。4周、8周、12周干炒组的TC、TG和对比例1(正常组)相比，差异不具有统计学意义(P>0.05)。
4周、8周、12周各组大鼠血清TNF-a、AST、ALT无明显差异。
实验6
对三组大鼠的肝组织切片进行病理形态学评估和比较。
进行肝组织学的光学显微镜分析：将石蜡包埋的肝组织切成4μm的切片，并进行标准的苏木精-曙红(H&E)染色,肝脂肪变性和炎性用NAS评分来评估，肝纤维化通过Masson染色评估。在每个切片上观察十个200倍光学显微镜视野，并对肝脂肪变性，炎症和纤维化的严重程度进行评分。NAFLD(NAS)评分：肝脏脂肪变性：0分(<5%)，1分(5-33%)，2分(34%-66%)，3分(>66%);小叶内炎症(20倍物镜计数坏死灶)：0分，无炎症;1分(<2个);2分(2-4个);3分(>4个);肝细胞气球样变：0分，无;1分，少见;2分，多见。NAS积分=脂肪变+炎症+气球样变，总分0-8分。NAS评分为半定量评分系统而非诊断程序，<3分可排除NASH，>4分则可诊断NASH，介于两者之间者为可能NASH。规定不伴有小叶内炎症、气球样变和纤维化但肝脂肪变者为NAFL，脂肪变达不到此程度者仅称为肝细胞脂肪变。进一步证实存在脂肪变的定量方法是使用Oil-Red-O来评估，肝纤维化通过Masson染色进行评估。肝脏纤维化评分0-4期(0期:无;1期:肝纤维化在窦周或汇管区周围;1A期:肝纤维化轻度，主要在窦周，3区附近;1B期:肝纤维化中度，主要在窦周，3区附近;1C期:肝纤维化主要在汇管区/汇管区周围;2期:肝纤维化在窦周及汇管区/汇管区周围;3期:发生桥接性纤维化;4期:肝硬化)。
光学显微镜分析结果中，大鼠肝脏第12周苏木精-曙红(H&E)染色见图4，脂肪变为图4箭头白色区域;干炒组大鼠肝脏第12周特殊表现见图5[图A(100倍)-炎症坏死灶,图B(400倍)-气球样变，图C(400倍)-成串珠状排列的肌成纤维细胞，如箭头所示];大鼠肝脏第12周Masson染色见图6(400倍);大鼠肝脏Masson染色纤维化面积统计图见图7。
大鼠肝脏第12周表面形态照片见图8，图8中，A为正常组，B为未炒组，C为干炒组。由图8可见，随着时间的延长，相比较其他两组，干炒组肝脏成缩小趋势，各个肝叶变长，说明随着时间的延长肝脏纤维化逐渐加重。NAS评分和肝纤维化评分结果见表5。
表5 NAS评分和肝纤维化评分结果
*P<0.05,干炒组vs正常组、未炒组
#P<0.05,干炒组vs正常组、未炒组
肝脏病理结果显示，正常组大鼠的肝组织在宏观和显微镜下均未见异常。在第4周，未炒组、干炒组病理组织病理学无显著差异，未炒组、干炒组均于第4周出现肝脂肪变性，未炒组和干炒组肝细胞内堆积的小泡脂变，NAFLD活性评分(NAS)在第4周时升高，第8周的肝脏组织病理学开始出现差异，干炒组NAS评分显著高于正常组、未炒组，NAS评分为4-5分。未炒组大鼠肝脏脂肪变程度下降，干炒组脂肪变逐渐加重，肝脏脂肪变以小泡性脂肪变性为主，在细胞核周围可见小而圆的脂滴，主要分布在汇管区周围。第8周，干炒组肝细胞脂肪变性的面积可以达到整个肝脏的三分之一至三分之二，这种变化发生在3只大鼠中。第12周，小叶内肝细胞脂变可以达到整个肝脏的三分之一至三分之二，这种变化发生在6只大鼠中，可见肝细胞增大，小叶散在坏死灶内，门管区炎性细胞浸润明显，中央静脉内皮内可见散在炎性细胞，纤维化加重。
上述实施例、对比例及实验均进行两次重复，两次实验结果吻合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
