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一种用于癌症治疗中的药物、肿瘤疫苗及抑制剂

2020-10-26 13:38:22

  一种用于癌症治疗中的药物、肿瘤疫苗及抑制剂

  技术领域

  本发明属于生物医药技术领域,尤其涉及一种用于癌症治疗中的药物、肿瘤疫苗及抑制剂。

  背景技术

  目前,业内常用的现有技术是这样的:通过免疫检查点的人源化或者全人源抗体封闭该免疫检查点,从而达到激活免疫反应并杀伤肿瘤的效果。常用的免疫检查点有PD-1、PD-L1、CTLA4。

  肿瘤免疫治疗是通过不同的机制来激活人体免疫力,最终通过集体的特定免疫细胞来消灭肿瘤的方法。目前根据激活免疫系统的方法,肿瘤免疫治疗分为主动免疫治疗和被动免疫治疗。主动免疫治疗主要包括肿瘤疫苗,被动免疫治疗主要包括抗体药物治疗、免疫检查点抑制剂治疗、过继性免疫细胞治疗、细胞因子治疗等。

  目前最受关注的是免疫检查点抑制剂治疗。免疫检查点本是人体免疫系统中起保护作用的分子,起类似刹车的作用,防止T细胞过度激活导致的炎症损伤等。而肿瘤细胞利用人体免疫系统这一特性,通过过度表达免疫检查点分子,抑制人体免疫系统反应,逃脱人体免疫监视与杀伤,从而促进肿瘤细胞的生长。目前研究和应用最广泛的免疫检查点抑制剂包括CTLA-4、PD-1以及其配体PD-L1的抑制剂。免疫检查点抑制剂治疗通过抑制免疫检查点活性,释放肿瘤微环境中的免疫刹车,重新激活T细胞对肿瘤的免疫应答效应,从而达到抗肿瘤的作用,这也使其成为对抗肿瘤的新武器。临床上采用该疗法后,部分患者可以获得持久的临床疗效,并且在数年内无任何肿瘤有关的临床症状。

  目前主要的CTLA-4抑制剂有Ipilimumab、Tremelimumab等,其中Ipilimumab是最早获得FDA批准并用于临床的免疫检查点抑制剂。根据III期随机对照试验中获得的生存结果,美国FDA最终于2011年批准Ipilimumab用于治疗转移性黑色素瘤。目前FDA批准的PD-1抗体有Nivolumab和Pembrolizumab,分别用来治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌以及肾癌。2016年FDA提前四个月批准了罗氏旗下基因泰克的PD-L1抗体atezolizumab(商品名Tecentriq),作为二线药物用于治疗一种叫做urothelial carcinoma的最常见晚期膀胱癌。2017年FDA加速批准由德国默克公司与辉瑞共同研发的PD-L1抗体Bavencio(Avelumab)上市,用于治疗罹患转移性默克尔细胞癌(metastatic Merkel cell carcinoma,MCC)的成人与12岁以上儿童,包括那些先前未经化疗治疗的患者。2017年美国FDA批准了默沙东公司的“”PD-1抗体Keytruda用于治疗携带一种特定基因特征的任何一种实体瘤。这是美国FDA批准的首款不依据肿瘤来源,而是依据生物标志物进行区分的抗肿瘤疗法。具体来说,Keytruda被批准用于治疗携带微卫星不稳定性高(microsatelliteinstability-high,MSI-H)或错配修复缺陷(mismatch repairdeficient,dMMR)的成人和儿童实体瘤患者。目前,免疫检查点抑制剂PD-1、PD-L1和CTLA-4抗体正在开展上百种针对不同肿瘤的临床试验,有望在多种肿瘤的治疗上取得突破。尽管免疫检查点抑制剂在众多肿瘤治疗方面取得巨大的进步,但该疗法也存在一些不足,例如总体响应率较低,出现耐药等。因此,针对新的肿瘤免疫检查点的筛选十分必要。

  BTNL2(Butyrophin-like2)是BTNL家族成员之一,与B7家族蛋白具有较高的同源性。近年来一些遗传学研究发现该基因的单核苷酸多态性与众多疾病密切相关,如自身免疫疾病、肿瘤等。研究发现,BTNL2蛋白能够抑制T细胞的激活,提示BTNL2在免疫调节、耐受中发挥重要的作用。

  综上所述,现有技术存在的问题是:

  现有技术中,免疫检查点抑制剂总体响应率较低,出现耐药性。

  抗体的人源化水平较低,易出现免疫排斥反应;

  人源化抗体的亲和性较差,导致封闭活性较差。

  解决上述技术问题的难度和意义:

  针对其他检查点蛋白的封闭有可能提高治疗总体相应率;

  优化人源化可以减小排斥反应,使抗体发挥更好的作用;

  增加亲和性能够促进更好的封闭活性,更好的发挥药效。

  发明内容

  针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种用于癌症治疗中的药物、肿瘤疫苗及抑制剂。

  本发明是这样实现的,一种用于癌症治疗中的药物,所述用于癌症治疗中的药物为BTNL2单克隆治疗型抗体,能够用于治疗多种人类癌症。

  所述BTNL2单克隆治疗型抗体为人BTNL2或小鼠BTNL2;人BTNL2的氨基酸序列为SEQ ID NO.1,编码核苷酸序列为SEQ ID NO.2;小鼠BTNL2的氨基酸序列为SEQ ID NO.3,编码核苷酸序列为SEQ ID NO.4。

  进一步,用于纯化抗体的BTNL2胞外区多肽为免疫原;BTNL2胞外区多肽分别为人BTNL2第24位亮氨酸到第455位丝氨酸、小鼠Ephrin-B1第24位赖氨酸到第454位丝氨酸,BTNL2胞外区多肽的编码核苷酸分别为SEQ ID NO.2所示序列的69-1365位核苷酸、SEQ IDNO.4所示序列的69-1362位核苷酸。

  进一步,由BTNL2胞外区与6XHis标签组成的融合多肽用于免疫原的纯化。

  本发明的另一目的在于提供一种所述用于癌症治疗中的药物包含的BTNL2单克隆治疗型抗体构建的表达融合抗原多肽的载体,所述载体为pINFUSE-hIgG2-Fc2(载体购自INVIVOGEN公司),包含编码BTNL2胞外区的核苷酸。

  本发明的另一目的在于提供一种所述载体的构建方法,所述载体的构建方法包括:将编码BTNL2第24位亮氨酸到第455位丝氨酸的基因序列克隆并利用哺乳动物细胞表达纯化,作为免疫原,免疫大鼠;经与小鼠杂交瘤细胞融合、重组CP4 EPSPS筛选克隆,获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系;

  利用培养该杂交瘤细胞系收集培养上清,Protein G柱亲和层析纯化培养上清,获得大鼠单克隆抗体;进行免疫印记Western blot实验,分析大鼠单克隆抗体特异识别肿瘤细胞内源的BTNL2蛋白。

  本发明的另一目的在于提供一种验证所述用于癌症治疗中的药物疗效的动物模型构建方法,所述动物模型构建方法包括:

  第一步,选取8周龄雌性小鼠做动物实验;小鼠随机分为2-3组,每组10只,一组注射对照抗体,一组注射抗BTNL2抗体,另一组注射抗PD-L1抗体作为阳性对照;

  pINFUSE-hIgG2-His-BTNL2载体构建:

  通过合成小鼠BTNL2全cDNA序列,编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4,以此为模板,构建小鼠BTNL2胞外区表达载体,胞外区氨基酸为第24位赖氨酸到第454位丝氨酸;表达载体为pINFUSE-hIgG2-Fc2;

  PCR反应体系为:

  10XPCR buffer:5μl,

  dNTP:1μl,

  上/下游引物:各1ul(10μM),

  模板DNA:1ng,

  PFU:1μl

  总反应体系:50μl;

  PCR反应程序为:

  95℃5分钟,循环30次,72℃10分钟,4℃;

  将PCR反应体系跑核酸电泳,切胶回收DNA片段;将切胶回收后的DNA片段和pINFUSE-hIgG2-Fc2空载体37℃酶切2小时,回收DNA片段。将回收后的DNA片段和载体进行16℃连接过夜;取5μl连接产物转化DH5α感受态细胞。转化平板放入37℃细菌孵箱过夜,第二天调取单克隆菌落,进行菌落PCR鉴定,将鉴定正确的菌落提质粒并送公司测序;测序正确的质粒将进行质粒中提,准备转染细胞;DNA切胶回收试剂盒以及DNA溶液回收试剂盒;

  重组蛋白His-BTNL2的制备:

  将构建好的表达载体pINFUSE-hIgG2-His-BTNL2转染入293F细胞,1L培养细胞,1×106/mL,在37℃、5%CO2、130rpm摇6天;转染后第6天收取细胞培养上清,离心去除细胞,4℃,1500rpm,5分钟,0.45μm滤膜过滤;将过滤后上清用His-tag纯化试剂盒纯化重组蛋白,超滤后蛋白融在1×PBS里,过0.22μm滤膜,测浓度,-80℃保存;

  第二步,杂交瘤细胞系的建立:

  e)免疫

  将第一步中交联的多肽乳化,免疫6-8周龄雌性大鼠,腹部皮下注射每只大鼠6点,剂量为60ug/只,14天加强免疫一次,抗原乳化,剂量为30ug/只;第3次加强免疫后7天以间接ELISA检测大鼠血清中抗免疫原的多抗效价,效价最高的大鼠以尾静脉注射冲击免疫,抗原用生理盐水混匀,剂量为50ug/只;

  免疫大鼠用的抗原为重组His-BTNL2(24-454)抗原蛋白,重组His-BTNL2(24-454)抗原蛋白由序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列编码经动物细胞293F重组表达获得;

  f)细胞融合:

  无菌制备免疫达标的大鼠脾细胞悬液,与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比例混合,离心1500rpm,5min;弃上清后离心管放入37℃水浴中,在1分钟内缓慢加入Iml的PEG1500,并搅动细胞;在温水中静置1min后,加入10ml无血清的頂DM,混勾,离心1000rpm,5min;弃上清后,加入10ml血清将细胞吹打起来,并加入5ml混合10xHAT的胸腺细胞,混匀;再加入25ml含有2.1%硝基纤维素的半固体培养基充分混匀,然后均匀的倒入20个细胞培养皿中;将细胞培养皿放入到湿盒中,放入37℃ 5%CO2培养箱中培养;

  g)挑克隆:

  融合后7天克隆细胞团大小密度适中,吸取圆、实、大的克隆团打入培养基的96孔培养板中,放入37℃ 5%CO2培养箱中培养;

  h)ELISA筛选阳性杂交瘤细胞:

  3天后,细胞量大约占底面积2/3,取IOOyl上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选;阳性克隆完全换液,加入200y1含饲养细胞和1%HT的完全培养基;两天后进行第二次ELISA筛选,阳性克隆转入事先准备好培养基的24孔板培养;五天后取100y1上清进行第三次ELISA筛选,阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存;获得的小鼠杂交瘤细胞系BTN-1;

  e)小鼠杂交瘤细胞系BTN-1分泌的抗体纯化:

  利用血清替代物培养小鼠杂交瘤细胞系BTN-1。将5X106细胞转接至10个10cm培养皿,第二天细胞密度约为50%。三天后后去上清,并换为新鲜培养基,继续培养3天,在收取上清。离心去除细胞,0.45μm滤膜过滤。将过滤后上清用protein G预装柱纯化重组蛋白;纯化后的洗脱抗体通过Milipore的超滤株超滤,超滤后抗体融在1×PBS里,过0.22μm滤膜,测浓度,-80℃保存;

  f)T细胞激活实验筛选封闭/治疗性BTNL2抗体:

  用anti-CD3ePBS和anti-CD28T细胞激活剂包被24孔板,4度过夜;第二天用1XPBS清洗24孔板两次,加入20ug/ml的BTNL2-His蛋白,室温两小时。1XPBS清洗24孔板两次;分离小鼠CD4+T淋巴细胞,将CD4+T种入包被好的24孔板,5X105/孔/1ML;将细胞培养3天,收细胞上清,做ELISA检测IL-2分泌;

  g)小鼠皮下瘤的建立及抗体:

  8周龄C57BL/6小鼠或者Balb/c小鼠随机分为2组;C57BL/6小鼠在右侧背部皮下接种5X105/100ul PBSde小鼠肠癌细胞MC38,或者3X105/100ul PBSde小鼠肺癌细胞LLC,或者5X105/100ul PBS的小鼠肝癌细胞Hepa1-6;Balb/c小鼠在右侧背部皮下接种5X105/100ulPBS的小鼠乳腺癌细胞4T1;接种后4、7、10、12天分别腹腔注射200ug对照抗体或者抗BTNL2抗体;肿瘤开始测量,肿瘤测量公式是:肿瘤体积=(长X宽2)/2;并将小鼠生存期绘制成生存曲线。

  本发明的另一目的在于提供一种利用所述用于癌症治疗中的药物制备的肿瘤疫苗。

  本发明的另一目的在于提供一种利用所述用于癌症治疗中的药物制备的肿瘤免疫检查点抑制剂。

  本发明的另一目的在于提供一种利用所述用于癌症治疗中的药物制备的肿瘤过继性免疫细胞治疗抑制剂。

  本发明的另一目的在于提供一种利用所述用于癌症治疗中的药物制备的肿瘤细胞因子治疗抑制剂。

  综上所述,本发明的优点及积极效果为:

  由于BTNL2能够抑制T细胞的激活,本发明制作了针对BTNL2的封闭型单克隆抗体,并通过体外实验证明该封闭抗体能够逆转BTNL2蛋白对T细胞的抑制作用。通过小鼠荷瘤实验,本发明发现注射该抗体能够明显抑制多种肿瘤的生长,并能够显著延长小鼠的生存期。BTNL2是一个重要的免疫检查点蛋白,针对BTNL2的封闭型单克隆抗体可以作为药物治疗肿瘤。

  本发明的优点还有:

  本发明获得的杂交瘤(BTN-1)分泌产生的单克隆抗体,能通过蛋白印记(westernblot)识别重组蛋白BTNL2分子,并能够通过蛋白印记(western blot)检测结肠癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多种肿瘤组织表达的内源BTNL2蛋白。

  本发明获得的杂交瘤(BTN-1)产生的单克隆抗体可应用于免疫组织化学(IHC)、免疫印记(Western blot)、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛查,特异性和灵敏度高。

  本发明获得的杂交瘤(BTN-1)分泌的抗体,与重组以及内源表达得BTNL2蛋白的结合有极强特异性和敏感性,并能够封闭、中和重组以及内源的BTNL2的蛋白活性。

  其四、本发明获得的杂交瘤(BTN-1)产生的单克隆抗体注射能够极大地延长荷瘤小鼠的生存期,并能够抑制肿瘤的生长,该单克隆抗体可以作为癌症治疗的药物,治疗多种肿瘤。

  本发明发现针对BTNL2的治疗性抗体能够用于治疗多种癌症,为癌症的治疗提供了新的靶点和药物。

  附图说明

  图1是本发明实施例提供的重组蛋白His-BTNL2(24-454)纯化后跑胶、考马斯亮蓝染色图。看出His-BTNL2(24-454)纯度叫好,而且绝大部分分泌在培养上清中。

  图2是本发明实施例提供的利用T细胞激活实验筛选封闭/治疗性BTNL2抗体。可以看到2号杂交瘤分泌的抗体明显逆转了BTNL2对T细胞的抑制作用。将2号杂瘤命名为BTN-1。

  图3是本发明实施例提供的利用BTN-1杂交瘤分泌纯化的抗体做蛋白印记(western blot)检测不同肿瘤中内源的BTNL2表达。箭头所指为内源的BTNL2,分子量约为72KD。

  图4是本发明实施例提供的抗BTNL2抗体治疗小鼠肺癌LLC接种的肿瘤的治疗效果。从图看出,抗BTNL2抗体相对于对照抗体明显抑制了小鼠肺癌的增长。

  图5是本发明实施例提供的抗BTNL2抗体治疗对小鼠结肠癌MC38细胞接种的肿瘤治疗效果。可以看出,抗BTNL2抗体相对于对照抗体明显延长了小鼠的生存期。

  图6是本发明实施例提供的抗BTNL2抗体治疗对小鼠肝癌Hepa1-6细胞接种的肿瘤治疗效果。可以看出,抗BTNL2抗体相对于对照抗体明显延长了小鼠的生存期。

  图7是本发明实施例提供的抗BTNL2抗体治疗对小鼠乳腺癌4T1细胞接种的肿瘤治疗效果。可以看出,抗BTNL2抗体相对于对照抗体明显延长了小鼠的生存期。

  具体实施方式

  为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。

  现有技术中,能够逆转BTNL2蛋白对T细胞的抑制作用的效果差。抑制多种肿瘤的生长药物效果差。现有技术中,免疫检查点抑制剂总体响应率较低,出现耐药性。

  为解决上述技术问题,下面结合具体方案对本发明作详细描述。

  本发明将BTNL2胞外区的编码序列构建到表达载体pINFUSE-hIgG2-Fc2上,通过哺乳动物细胞表达重组蛋白His-BTNL2,用His-BTNL2重组蛋白免疫大鼠,制备针对BTNL2的单克隆抗体。通过体外T细胞激活实验筛选出能够封闭BTNL2蛋白的治疗型单克隆抗体,并进行抗体纯化。通过建立小鼠皮下不同的肿瘤模型,发现抗BTNL2抗体在多种肿瘤模型中能够抑制肿瘤的生长,延长小鼠生存期,从而提示BTNL2是一个新的肿瘤免疫治疗靶点,抗BTNL2抗体具有成为新的抗肿瘤药物的潜力。

  本发明实施例提供的用于癌症治疗中的药物包括:

  BTNL2抗体或包含BTNL2抗体的组合物。

  所述的BTNL2为人BTNL2或小鼠BTNL2。其中,人BTNL2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;小鼠BTNL2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示,编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

  在本发明实施例中,用于纯化抗体的BTNL2胞外区多肽为免疫原。所述BTNL2胞外区多肽分别为人BTNL2第24位亮氨酸到第455位丝氨酸、小鼠Ephrin-B1第24位赖氨酸到第454位丝氨酸,编码核苷酸分别为SEQ ID NO.2所示序列的69-1365位核苷酸、SEQ ID NO.4所示序列的69-1362位核苷酸。

  在本发明实施例中,用于纯化抗体的BTNL2胞外区多肽为免疫原。由BTNL2胞外区与6XHis标签组成的融合多肽用于免疫原的纯化。

  本发明实施例提供一种表达上述融合抗原多肽的载体,其骨架载体优选为pINFUSE-hIgG2-Fc2,包含编码BTNL2胞外区的核苷酸。

  在本发明实施例中,用于生产上述融合抗原多肽的宿主载体系统,包含上述载体的宿主细胞。所述宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞,优选为293F、COS7、CHO细胞。

  在本发明实施例中,构建上述融合抗原多肽的载体方法,包括:融合抗原多肽为上述宿主载体系统在允许产生融合多肽的条件下回收由此产生的多肽。本发明将编码BTNL2第24位亮氨酸到第455位丝氨酸的基因序列克隆并利用哺乳动物细胞表达纯化,作为免疫原,免疫大鼠。经与小鼠杂交瘤细胞融合、重组CP4 EPSPS筛选克隆,获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。

  利用培养该杂交瘤细胞系收集培养上清,Protein G柱亲和层析纯化培养上清,获得大鼠单克隆抗体。免疫印记(Western blot)实验显示该抗体能特异识别肿瘤细胞内源的BTNL2蛋白。

  通过T细胞激活实验,鉴定出一株具有封闭BTNL2蛋白活性的治疗性抗体。

  通过小鼠荷瘤实验,BTNL2治疗性抗体能够极大地延长荷瘤小鼠的生存期,并能够抑制肿瘤的生长。试验的肿瘤类型有肠癌、肺癌、肝癌和乳腺癌。

  在本发明实施例中,BTNL2抗体制备治疗多种癌症的药物,其中癌症类型包括但不限于肺癌、肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、前列腺癌、鼻咽癌等;治疗癌症的药物的给药途径是口服给药或静脉给药。

  下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

  实施例1

  (1)实验小鼠

  C57BL/6小鼠,购买自湖北省药物安全评价中心,并在湖北省药物安全评价中心SPF级动物实验室饲养。选取8周龄雌性小鼠做动物实验。小鼠随机分为2-3组,每组10只,一组注射对照抗体,一组注射抗BTNL2抗体,另一组注射抗PD-L1抗体作为阳性对照。

  (2)pINFUSE-hIgG2-His-BTNL2载体构建:

  通过公司合成小鼠BTNL2全cDNA序列(编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示),以此为模板,构建小鼠BTNL2胞外区表达载体(胞外区氨基酸为第24位赖氨酸到第454位丝氨酸,由公司克隆构建)。表达载体为pINFUSE-hIgG2-Fc2,购自Invivogen公司。

  PCR反应体系为:

  10XPCR buffer:5μl,

  dNTP:1μl,

  上/下游引物:各1ul(10μM),

  模板DNA:1ng,

  PFU:1μl

  总反应体系:50μl。

  PCR反应程序如下:

  95℃5分钟,(95℃1分钟,58℃30秒,72℃2分钟)循环30次,72℃10分钟,4℃。

  将PCR反应体系跑核酸电泳,切胶回收DNA片段。将切胶回收后的DNA片段和pINFUSE-hIgG2-Fc2空载体37℃酶切2小时(NCoI和BglII酶切),回收DNA片段。将回收后的DNA片段和载体进行16℃连接过夜。取5μl连接产物转化DH5α感受态细胞。转化平板放入37℃细菌孵箱过夜,第二天调取单克隆菌落,进行菌落PCR鉴定,将鉴定正确的菌落提质粒并送公司测序。测序正确的质粒将进行质粒中提,准备转染细胞。NCoI和BglII酶购自NEB公司。DNA切胶回收试剂盒以及DNA溶液回收试剂盒购自Omega,货号是D2500-01和D2500-02,回收方法参照产品说明。DNA T4连接酶购自THERMO FISHER,货号是EL0014,连接方法参照产品说明。DH5α感受态细胞购自天根生化科技公司,货号是CB101。

  (3)重组蛋白His-BTNL2(24-454)的制备:

  将构建好的表达载体pINFUSE-hIgG2-His-BTNL2(24-454)转染入293F细胞(1L培养细胞,1×106/mL),在37℃、5%CO2、130rpm摇6天。转染试剂为PolyPlus transfection公司的PolyPlus转染试剂,货号为FECTO PRO,具体装染方法见产品说明。转染后第6天收取细胞培养上清,离心去除细胞(4℃,1500rpm,5分钟),0.45μm滤膜过滤。将过滤后上清用His-tag纯化试剂盒纯化重组蛋白(碧云天生产的His标签蛋白纯化试剂盒,货号P2226),纯化方法见产品说明。纯化后的洗脱蛋白通过Milipore的超滤株超滤(货号为UFC501096),超滤后蛋白融在1×PBS里,过0.22μm滤膜,测浓度,-80℃保存。

  (4)第二步:杂交瘤细胞系的建立:

  i)免疫

  将第一步中交联的多肽用弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化,免疫6-8周龄雌性大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司),腹部皮下注射每只大鼠6点,剂量为60ug/只,14天加强免疫一次,抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司)乳化,剂量为30ug/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测大鼠血清中抗免疫原的多抗效价,效价最高的大鼠以尾静脉注射冲击免疫,抗原用生理盐水混匀,剂量为50ug/只。

  免疫大鼠用的抗原为重组His-BTNL2(24-454)抗原蛋白,上述重组His-BTNL2(24-454)抗原蛋白由序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列编码经哺乳动物细胞293F重组表达而获得。

  j)细胞融合

  无菌制备免疫达标的大鼠脾细胞悬液,与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比例混合,离心1500rpm,5min;弃上清后离心管放入37℃水浴中,在1分钟内缓慢加入Iml的PEG1500(Roche公司),并搅动细胞;在温水中静置1min后,加入10ml无血清的頂DM(Sigma公司),混勾,离心1000rpm,5min;弃上清后,加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来,并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞,混匀;再加入25ml含有2.1%硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀,然后均匀的倒入20个细胞培养皿中;将细胞培养皿放入到湿盒中,放入37℃ 5%CO2)培养箱中培养。

  k)挑克隆

  融合后7天克隆细胞团大小密度适中,在解剖镜下,吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中,放入37℃ 5%CO2培养箱中培养。

  l)ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

  3天后,细胞量大约占底面积2/3,取IOOyl上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选;阳性克隆完全换液,加入200y1含饲养细胞和1%HT(Sigma公司)的完全培养基;两天后进行第二次ELISA筛选,阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养;五天后取100y1上清进行第三次ELISA筛选,阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。获得的小鼠杂交瘤细胞系BTN-1。

  (5)小鼠杂交瘤细胞系BTN-1分泌的抗体纯化

  利用血清替代物(KNOCKOUTTM血清替代物,GIBCO公司,货号10828-028)培养小鼠杂交瘤细胞系BTN-1。将5X106细胞转接至10个10cm培养皿,第二天细胞密度约为50%。三天后后去上清,并换为新鲜培养基,继续培养3天,在收取上清。离心去除细胞(4℃,1500rpm,5分钟),0.45μm滤膜过滤。将过滤后上清用protein G预装柱纯化重组蛋白(预装柱购自武汉汇研公司,货号HZ1012-1),纯化方法见产品说明。纯化后的洗脱抗体通过Milipore的超滤株超滤(货号为UFC501096),超滤后抗体融在1×PBS里,过0.22μm滤膜,测浓度,-80℃保存。

  (6)T细胞激活实验筛选封闭/治疗性BTNL2抗体

  用anti-CD3e(1ug/ml PBS)和anti-CD28(1ug/ml PBS)T细胞激活剂包被24孔板(T细胞激活剂购自Biolengend,货号是423304),4度过夜。第二天用1XPBS清洗24孔板两次,加入20ug/ml的BTNL2-His蛋白,室温两小时。1XPBS清洗24孔板两次。分离小鼠CD4+T淋巴细胞(利用德国美天旎小鼠CD4+细胞分离试剂盒,货号是130-104-454),具体方法见产品说明。将CD4+T种入包被好的24孔板,5X105/孔/1ML(细胞培养液是RPMI1640+10%FBS)。将细胞培养3天,收细胞上清,做ELISA检测IL-2分泌。

  (7)小鼠皮下瘤的建立及抗体治疗:

  8周龄C57BL/6小鼠或者Balb/c小鼠随机分为2组。C57BL/6小鼠在右侧背部皮下接种小鼠肠癌细胞MC38(5X105/100ul PBS),或者小鼠肺癌细胞LLC(3X105/100ul PBS),或者小鼠肝癌细胞Hepa1-6(5X105/100ul PBS)。Balb/c小鼠在右侧背部皮下接种小鼠乳腺癌细胞4T1(5X105/100ul PBS)。接种后4、7、10、12天分别腹腔注射200ug对照抗体或者抗BTNL2抗体(有些实验注射200ug抗PD-L1抗体作为阳性对照,抗PD-L1抗体购自BioXcell公司,货号是BE0101)。肉眼可见肿瘤时开始测量,肿瘤测量公式是:肿瘤体积=(长X宽2)/2。

  并将小鼠生存期绘制成生存曲线。

  下面结合实验结果对本发明作进一步描述。

  结果见图1-图7。图1是重组蛋白His-BTNL2(24-454)纯化后跑胶、考马斯亮蓝染色图。可以看出His-BTNL2(24-454)纯度叫好,而且绝大部分分泌在培养上清中。图2是利用T细胞激活实验筛选封闭/治疗性BTNL2抗体。可以看到2号杂交瘤分泌的抗体明显逆转了BTNL2对T细胞的抑制作用。我们将2号杂瘤命名为BTN-1。图3是利用BTN-1杂交瘤分泌纯化的抗体做蛋白印记(western blot)检测不同肿瘤中内源的BTNL2表达。箭头所指为内源的BTNL2,分子量约为72KD。图4是抗BTNL2抗体治疗小鼠肺癌LLC接种的肿瘤的治疗效果。从图看出,抗BTNL2抗体相对于对照抗体明显抑制了小鼠肺癌的增长。图5是抗BTNL2抗体治疗对小鼠结肠癌MC38细胞接种的肿瘤治疗效果。可以看出,抗BTNL2抗体相对于对照抗体明显延长了小鼠的生存期。图6是抗BTNL2抗体治疗对小鼠肝癌Hepa1-6细胞接种的肿瘤治疗效果。可以看出,抗BTNL2抗体相对于对照抗体明显延长了小鼠的生存期。图7是抗BTNL2抗体治疗对小鼠乳腺癌4T1细胞接种的肿瘤治疗效果。可以看出,抗BTNL2抗体相对于对照抗体明显延长了小鼠的生存期。

  在本发明中,SEQ ID NO.1

  MVDFPGYNLSGAVASFLFILLTMKQSEDFRVIGPAHPILAGVGEDALLTCQLLPKRTTMHVEVRWYRSEPSTPVFVHRDGVEVTEMQMEEYRGWVEWIENGIAKGNVALKIHNIQPSDNGQYWCHFQDGNYCGETSLLLKVAGLGSAPSIHMEGPGESGVQLVCTARGWFPEPQVYWEDIRGEKLLAVSEHRIQDKDGLFYAEATLVVRNASAESVSCLVHNPVLTEEKGSVISLPEKLQTELASLKVNGPSQPILVRVGEDIQLTCYLSPKANAQSMEVRWDRSHRYPAVHVYMDGDHVAGEQMAEYRGRTVLVSDAIDEGRLTLQILSARPSDDGQYRCLFEKDDVYQEASLDLKVVSLGSSPLITVEGQEDGEMQPMCSSDGWFPQPHVPWRDMEGKTIPSSSQALTQGSHGLFHVQTLLRVTNISAVDVTCSISIPFLGEEKIATFSLSESRMTFLWKTLLVWGLLLAVAVGLPRKRS。

  SEQ ID NO.2

  SEQ ID NO.3

  MVDCPRYSLSGVAASFLFVLLTIKHPDDFRVVGPNLPILAKVGEDALLTCQLLPKRTTAHMEVRWYRSDPDMPVIMYRDGAEVTGLPMEGYGGRAEWMEDSTEEGSVALKIRQVQPSDDGQYWCRFQEGDYWRETSVLLQVAALGSSPNIHVEGLGEGEV

  QLVCTSRGWFPEPEVHWEGIWGEKLMSFSENHVPGEDGLFYVEDTLMVRNDSVETISCFIYSHGLRETQEATIALSERLQTELASVSVIGHSQPSPVQVGENIELTCHLSPQTDAQNLEVRWLRSRYYPAVHVYANGTHVAGEQMVEYKGRTSLVTDAIHEGKLTLQIHNARTSDEGQYRCLFGKDGVYQEARVDVQVMAVGSTPRITREVLKDGGMQLRCTSDGWFPRPHVQWRDRDGKTMPSFSEAFQQGSQELFQVETLLLVTNGSMVNVTCSISLPLGQEKTARFPLSDSKIALLWMTLPVVVLPLAMAIDLIKVKRWRRTNEQTHSSNQENNKNDENHRRRLPSDERLR。

  SEQ ID NO.4

  以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

  序列表

  <110> 华中科技大学

  <120> 一种用于癌症治疗中的药物、肿瘤疫苗及抑制剂

  <160> 4

  <170> SIPOSequenceListing 1.0

  <210> 1

  <211> 482

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <400> 1

  Met Val Asp Phe Pro Gly Tyr Asn Leu Ser Gly Ala Val Ala Ser Phe

  1 5 1015

  Leu Phe Ile Leu Leu Thr Met Lys Gln Ser Glu Asp Phe Arg Val Ile

  202530

  Gly Pro Ala His Pro Ile Leu Ala Gly Val Gly Glu Asp Ala Leu Leu

  354045

  Thr Cys Gln Leu Leu Pro Lys Arg Thr Thr Met His Val Glu Val Arg

  505560

  Trp Tyr Arg Ser Glu Pro Ser Thr Pro Val Phe Val His Arg Asp Gly

  65707580

  Val Glu Val Thr Glu Met Gln Met Glu Glu Tyr Arg Gly Trp Val Glu

  859095

  Trp Ile Glu Asn Gly Ile Ala Lys Gly Asn Val Ala Leu Lys Ile His

  100 105 110

  Asn Ile Gln Pro Ser Asp Asn Gly Gln Tyr Trp Cys His Phe Gln Asp

  115 120 125

  Gly Asn Tyr Cys Gly Glu Thr Ser Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Leu

  130 135 140

  Gly Ser Ala Pro Ser Ile His Met Glu Gly Pro Gly Glu Ser Gly Val

  145 150 155 160

  Gln Leu Val Cys Thr Ala Arg Gly Trp Phe Pro Glu Pro Gln Val Tyr

  165 170 175

  Trp Glu Asp Ile Arg Gly Glu Lys Leu Leu Ala Val Ser Glu His Arg

  180 185 190

  Ile Gln Asp Lys Asp Gly Leu Phe Tyr Ala Glu Ala Thr Leu Val Val

  195 200 205

  Arg Asn Ala Ser Ala Glu Ser Val Ser Cys Leu Val His Asn Pro Val

  210 215 220

  Leu Thr Glu Glu Lys Gly Ser Val Ile Ser Leu Pro Glu Lys Leu Gln

  225 230 235 240

  Thr Glu Leu Ala Ser Leu Lys Val Asn Gly Pro Ser Gln Pro Ile Leu

  245 250 255

  Val Arg Val Gly Glu Asp Ile Gln Leu Thr Cys Tyr Leu Ser Pro Lys

  260 265 270

  Ala Asn Ala Gln Ser Met Glu Val Arg Trp Asp Arg Ser His Arg Tyr

  275 280 285

  Pro Ala Val His Val Tyr Met Asp Gly Asp His Val Ala Gly Glu Gln

  290 295 300

  Met Ala Glu Tyr Arg Gly Arg Thr Val Leu Val Ser Asp Ala Ile Asp

  305 310 315 320

  Glu Gly Arg Leu Thr Leu Gln Ile Leu Ser Ala Arg Pro Ser Asp Asp

  325 330 335

  Gly Gln Tyr Arg Cys Leu Phe Glu Lys Asp Asp Val Tyr Gln Glu Ala

  340 345 350

  Ser Leu Asp Leu Lys Val Val Ser Leu Gly Ser Ser Pro Leu Ile Thr

  355 360 365

  Val Glu Gly Gln Glu Asp Gly Glu Met Gln Pro Met Cys Ser Ser Asp

  370 375 380

  Gly Trp Phe Pro Gln Pro His Val Pro Trp Arg Asp Met Glu Gly Lys

  385 390 395 400

  Thr Ile Pro Ser Ser Ser Gln Ala Leu Thr Gln Gly Ser His Gly Leu

  405 410 415

  Phe His Val Gln Thr Leu Leu Arg Val Thr Asn Ile Ser Ala Val Asp

  420 425 430

  Val Thr Cys Ser Ile Ser Ile Pro Phe Leu Gly Glu Glu Lys Ile Ala

  435 440 445

  Thr Phe Ser Leu Ser Glu Ser Arg Met Thr Phe Leu Trp Lys Thr Leu

  450 455 460

  Leu Val Trp Gly Leu Leu Leu Ala Val Ala Val Gly Leu Pro Arg Lys

  465 470 475 480

  Arg Ser

  <210> 2

  <211> 1449

  <212> DNA

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <400> 2

  atggtggatt ttccaggcta caatctgtct ggtgcagtcg cctccttcct attcatcctg 60

  ctgacaatga agcagtcaga agactttaga gtcattggcc ctgctcatcc tatcctggcc 120

  ggggttgggg aagatgccct gttaacctgc cagctactcc ccaagaggac cacaatgcac 180

  gtggaggtga ggtggtaccg ctcagagccc agcacacctg tgtttgtgca cagggatgga 240

  gtggaggtga ctgagatgca gatggaggag tacagaggct gggtagagtg gatagagaat 300

  ggcattgcaa agggaaatgt ggcactgaag atacacaaca tccagccctc cgacaatgga 360

  caatactggt gccatttcca ggatgggaac tactgtggag aaacaagctt gctgctcaaa 420

  gtagcaggtc tggggtctgc ccctagcatc cacatggagg gacctgggga gagtggagtc 480

  cagcttgtgt gcactgcaag gggctggttc ccagagcccc aggtgtattg ggaagacatc 540

  cggggagaga agctgctggc cgtgtctgag catcgcatcc aagataaaga tggcctgttc 600

  tatgcggaag ccaccctggt ggtcaggaac gcctctgcag agtctgtgtc ctgcttggtc 660

  cacaaccccg tcctcactga ggagaagggg tcggtcatca gcctcccaga gaaactccag 720

  actgagctgg cttctttaaa agtgaatgga ccttcccagc ccatcctcgt cagagtggga 780

  gaagatatac agctaacctg ttacctgtcc cccaaggcga atgcacagag catggaggtg 840

  aggtgggacc gatcccaccg ttaccctgct gtgcatgtgt atatggatgg ggaccatgtg 900

  gctggagagc agatggcaga gtacagaggg aggactgtac tggtgagtga cgccattgac 960

  gagggcagac tgaccctgca gatactcagt gccagacctt cggacgacgg gcagtaccgc 1020

  tgcctttttg aaaaagatga tgtctaccag gaggccagtt tggatctgaa ggtggtaagt 1080

  ctgggttctt ccccactgat cactgtggag gggcaagaag atggagaaat gcagccgatg 1140

  tgctcttcag atgggtggtt cccacagccc cacgtgccat ggagggacat ggaaggaaag 1200

  acgataccat catcttccca ggccctgact caaggcagcc acgggctgtt ccacgtgcag 1260

  acattgctaa gggtcacaaa catctccgct gtggacgtca cttgttccat cagcatcccc 1320

  tttttgggcg aggagaaaat cgcaactttt tctctctcag agtccaggat gacgtttttg 1380

  tggaaaacac tgcttgtttg gggattgctt cttgctgtgg ctgtaggcct gcccaggaag 1440

  aggagctga 1449

  <210> 3

  <211> 514

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <400> 3

  Met Val Asp Cys Pro Arg Tyr Ser Leu Ser Gly Val Ala Ala Ser Phe

  1 5 1015

  Leu Phe Val Leu Leu Thr Ile Lys His Pro Asp Asp Phe Arg Val Val

  202530

  Gly Pro Asn Leu Pro Ile Leu Ala Lys Val Gly Glu Asp Ala Leu Leu

  354045

  Thr Cys Gln Leu Leu Pro Lys Arg Thr Thr Ala His Met Glu Val Arg

  505560

  Trp Tyr Arg Ser Asp Pro Asp Met Pro Val Ile Met Tyr Arg Asp Gly

  65707580

  Ala Glu Val Thr Gly Leu Pro Met Glu Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Glu

  859095

  Trp Met Glu Asp Ser Thr Glu Glu Gly Ser Val Ala Leu Lys Ile Arg

  100 105 110

  Gln Val Gln Pro Ser Asp Asp Gly Gln Tyr Trp Cys Arg Phe Gln Glu

  115 120 125

  Gly Asp Tyr Trp Arg Glu Thr Ser Val Leu Leu Gln Val Ala Ala Leu

  130 135 140

  Gly Ser Ser Pro Asn Ile His Val Glu Gly Leu Gly Glu Gly Glu Val

  145 150 155 160

  Gln Leu Val Cys Thr Ser Arg Gly Trp Phe Pro Glu Pro Glu Val His

  165 170 175

  Trp Glu Gly Ile Trp Gly Glu Lys Leu Met Ser Phe Ser Glu Asn His

  180 185 190

  Val Pro Gly Glu Asp Gly Leu Phe Tyr Val Glu Asp Thr Leu Met Val

  195 200 205

  Arg Asn Asp Ser Val Glu Thr Ile Ser Cys Phe Ile Tyr Ser His Gly

  210 215 220

  Leu Arg Glu Thr Gln Glu Ala Thr Ile Ala Leu Ser Glu Arg Leu Gln

  225 230 235 240

  Thr Glu Leu Ala Ser Val Ser Val Ile Gly His Ser Gln Pro Ser Pro

  245 250 255

  Val Gln Val Gly Glu Asn Ile Glu Leu Thr Cys His Leu Ser Pro Gln

  260 265 270

  Thr Asp Ala Gln Asn Leu Glu Val Arg Trp Leu Arg Ser Arg Tyr Tyr

  275 280 285

  Pro Ala Val His Val Tyr Ala Asn Gly Thr His Val Ala Gly Glu Gln

  290 295 300

  Met Val Glu Tyr Lys Gly Arg Thr Ser Leu Val Thr Asp Ala Ile His

  305 310 315 320

  Glu Gly Lys Leu Thr Leu Gln Ile His Asn Ala Arg Thr Ser Asp Glu

  325 330 335

  Gly Gln Tyr Arg Cys Leu Phe Gly Lys Asp Gly Val Tyr Gln Glu Ala

  340 345 350

  Arg Val Asp Val Gln Val Met Ala Val Gly Ser Thr Pro Arg Ile Thr

  355 360 365

  Arg Glu Val Leu Lys Asp Gly Gly Met Gln Leu Arg Cys Thr Ser Asp

  370 375 380

  Gly Trp Phe Pro Arg Pro His Val Gln Trp Arg Asp Arg Asp Gly Lys

  385 390 395 400

  Thr Met Pro Ser Phe Ser Glu Ala Phe Gln Gln Gly Ser Gln Glu Leu

  405 410 415

  Phe Gln Val Glu Thr Leu Leu Leu Val Thr Asn Gly Ser Met Val Asn

  420 425 430

  Val Thr Cys Ser Ile Ser Leu Pro Leu Gly Gln Glu Lys Thr Ala Arg

  435 440 445

  Phe Pro Leu Ser Asp Ser Lys Ile Ala Leu Leu Trp Met Thr Leu Pro

  450 455 460

  Val Val Val Leu Pro Leu Ala Met Ala Ile Asp Leu Ile Lys Val Lys

  465 470 475 480

  Arg Trp Arg Arg Thr Asn Glu Gln Thr His Ser Ser Asn Gln Glu Asn

  485 490 495

  Asn Lys Asn Asp Glu Asn His Arg Arg Arg Leu Pro Ser Asp Glu Arg

  500 505 510

  Leu Arg

  <210> 4

  <211> 1545

  <212> DNA

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <400> 4

  atggtggatt gcccacggta tagtctatct ggcgtggctg cctccttcct cttcgtcctg 60

  ctgactataa agcacccaga tgacttcaga gtggtcggtc ctaacctccc aatcttggct 120

  aaagtcgggg aagatgccct gctaacgtgt cagctcctcc ccaagaggac cacggcacac 180

  atggaggtga ggtggtaccg ctccgaccct gacatgccag tgattatgta ccgggatgga 240

  gctgaggtga ctgggctacc gatggagggg tacggaggcc gggcagagtg gatggaggac 300

  agcactgaag agggcagtgt ggctctgaag attcgccagg tccagccaag tgacgatggc 360

  cagtactggt gccgcttcca ggagggggac tactggagag agacaagcgt gctactccaa 420

  gtggctgctc taggatcttc cccaaatatc catgtggagg gactcggaga aggagaggtc 480

  cagcttgtat gcacgtcccg aggctggttc cctgagcctg aggtgcactg ggaaggcatc 540

  tggggagaaa agttgatgag tttctctgag aatcatgtgc caggtgaaga tgggctattc 600

  tatgtggaag acacactgat ggtcaggaat gacagtgtag agaccatttc ctgcttcatc 660

  tacagccatg gcctcagaga gacccaggag gccaccatcg ctctgtcaga gaggctccag 720

  accgaactgg cttccgttag cgtaatcgga cattcccagc ccagccctgt tcaagtcgga 780

  gagaacatag aattaacttg tcacctctca cctcaaacgg atgctcagaa cttagaggtg 840

  aggtggctcc gatcccgcta ttaccctgca gtccacgtgt atgcaaatgg cacccacgtg 900

  gctggagagc agatggtaga atacaaaggg aggacttcat tggtgactga tgccatccac 960

  gagggaaaac tgaccctgca aattcacaat gccagaactt cggatgaagg gcagtaccgg 1020

  tgcctttttg gaaaagatgg tgtctaccag gaggcccgtg tggatgtgca ggtgatggcg 1080

  gtgggttcca ccccacggat caccagggag gtcttgaaag atggaggcat gcagctgagg 1140

  tgtacgtctg atgggtggtt cccacggccc catgtgcagt ggagggacag agatggaaag 1200

  acaatgccat cgttttccga ggcctttcag caagggagcc aggagctgtt ccaggtggag 1260

  acacttctgc tggtcacaaa cggctccatg gtgaatgtga cctgctccat cagcctccct 1320

  ctgggccagg agaaaacagc ccgtttccct ctctcagact ccaagatagc tttgctatgg 1380

  atgaccctgc ctgttgtggt gctgcctctg gccatggcta tcgacctgat caaggtgaaa 1440

  cggtggcggc ggaccaatga acaaacacac agcagcaatc aggaaaataa caagaatgac 1500

  gaaaaccaca ggcggcgact tccttctgat gagaggctca gatga 1545

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