一种含肽类化合物的冷冻保存液在卵母细胞或胚胎冻存中的应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种含肽类化合物的冷冻保存液在卵母细胞或胚胎冻存中的应用。
背景技术
冷冻保存是指将生物材料保存于超低温状态下，使细胞新陈代谢和分裂速度减慢或者停止，一旦恢复正常生理温度又能继续发育。该技术自问世以来，成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一，已被广泛采用。近年来，随着生活压力的增加，人类生育力呈逐年下降的趋势，生育力保存越来越受到人们的重视，人类生殖细胞(精子、卵母细胞)、性腺组织等的冷冻保存就成为保存生育力的重要手段。另外，随着世界人口老龄化加剧，对捐赠的可用于再生医学和器官移植的人源性材料细胞、组织或器官的冷冻保存的需求也极速增加。因此，如何高效的冷冻保存珍贵的细胞、组织以及器官资源以备不时之需成为亟待解决的科学技术问题。
目前最常用的冷冻保存方法为玻璃化冷冻。玻璃化冷冻技术虽然在快速冷冻过程中可使细胞内外的液体均成玻璃化状态而避免了冷冻过程中的损伤。但是，在复温过程中，现有的冷冻保存试剂不能有效的控制冰晶的生长，从而损害细胞。目前玻璃化冷冻方法所使用的高浓度(≥15%)有毒的有机溶剂，导致冷冻存活率偏低，且严重影响保存对象(子代)安全性以及功能表达。综上，目前采用的冷冻保存试剂存在不具备复温过程中有效控制冰晶生长的能力，同时存在试剂安全性差的问题。
发明内容
为改善现有技术的上述缺陷，本发明提供一种含肽类化合物的冷冻保存液在卵母细胞或胚胎冻存中的应用。
本发明通过如下技术方案实现：
一种肽类化合物，由亲冰性氨基酸，如：苏氨酸(L-Thr)、谷氨酰胺(L-Gln)、天冬氨酸(L-Asn)等与其他亲水性氨基酸或葡萄糖内酯(GDL)或糖类反应得到，所述其他亲水性氨基酸可选自精氨酸、脯氨酸、丙氨酸等。
根据本发明，所述肽类化合物为两个以上的氨基酸单元形成的肽类，如：2-8个氨基酸单元，具体地可以为2个、3个、4个、5个、6个氨基酸单元;每个氨基酸单元可以相同或不同。
根据本发明，所述肽类化合物中亲冰氨基酸如苏氨酸与其他亲水氨基酸的摩尔比为(0.1-3)：1，优选(0.5-2)：1。
根据本发明，所述肽类化合物为L-Thr-L-Arg(TR),L-Thr-L-Pro(TP),L-Arg-L-Thr(RT),L-Pro-L-Thr(PT)，L-Thr-L-Arg-L-Thr(TRT),L-Thr-L-Pro-L-Thr(TPT),L-Ala-L-Ala-L-Thr(AAT)，L-Thr-L-Cys-L-Thr(TCT)中的至少一种。
根据本发明，所述肽类化合物为GDL-L-Thr。
根据本发明，所述肽类化合物具有式(1)-式(6)所示任一结构：
上述肽类化合物的制备方法，可以采用本领域已知的多肽合成方法合成，例如采用固相合成法合成。
根据本发明的制备方法，包括如下步骤：树脂溶胀、一种氨基保护的氨基酸共价连接在溶胀的树脂上、脱保护、加入另一种氨基保护的氨基酸缩合反应、脱保护、切割、纯化。
根据本发明的制备方法，将葡萄糖内酯(GDL)溶解在有机溶剂中，并将苏氨酸和碱性催化剂加入到有机溶剂里，完全溶解后加入到葡萄糖内酯的溶液中，55-60℃反应，反应结束后，过滤掉白色沉淀物，把滤液蒸干得到粗产物。
根据本发明的制备方法，所述有机溶剂可以选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等。
根据本发明的制备方法，所述GDL-L-Thr采用如下合成路线制备：
本发明还提供上述肽类化合物用于控制水溶液中冰晶生长的应用、上述肽类化合物用于制备细胞或组织冷冻保存液的应用。
本发明还提供式(7)所示的肽类化合物：
其中，R选自取代或未取代的烷基，所述取代基可以选自-OH、-NH2、-COOH、-CONH2等，例如，R为取代或未取代的C1-6烷基，优选R为-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2COOH;n为大于等于1而小于等于1000的整数，例如可以为1～100范围内的整数。在本发明的一些实施方式中，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10的整数。
作为本发明的一个实施方案，所述式(7)所示化合物具有如下任一所示的结构：
根据本发明，所述式(7)所示的化合物采用如下合成路线制备：
本发明还提供上述式(7)的化合物用于控制水溶液中冰晶生长的应用、式(7)的化合物用于制备细胞或组织冷冻保存液的应用。
根据本发明的应用，所述肽类化合物和其他控冰材料组合使用，所述控冰材料选自PVA、氨基酸、聚氨基酸等中的至少一种。
本发明还提供一种冷冻保存液，其含有上述肽类化合物。
根据本发明的冷冻保存液，以每100mL计，含有0.1-50g所述肽类化合物。
根据本发明的冷冻保存液，还进一步含有PVA、氨基酸、聚氨基酸或者DMSO、多元醇中的一种或两种以上。
根据本发明的冷冻保存液，还可以含有血清。
根据本发明的冷冻保存液，以每100mL计，含有0.1-50g所述肽类化合物，0-6.0g的PVA，0-9.0g的聚氨基酸，0-15mL的DMSO，5-45mL的多元醇，0.1-1.0mol L-1的水溶性糖，0-30mL的血清，余量为缓冲液。
作为本发明的一个实施方式，所述冷冻保存液以每100mL计，含有0.1-50g的所述肽类化合物，0.1-15mL的DMSO，5.0-45mL的多元醇，0.1-1.0mol L-1水溶性糖，0-30mL的血清，不含有PVA和聚氨基酸，余量为缓冲液。
作为本发明的一个实施方式，所述冷冻保存液以每100mL计，含有0.1-50g所述肽类化合物，0.1-6.0g的PVA，0-9.0g的聚氨基酸，0-15mL的DMSO，5.0-45mL的多元醇，0.1-1.0mol L-1的水溶性糖，0-30mL的血清，余量为缓冲液。
作为本发明的一个实施方式，所述冷冻保存液以每100mL计，含有0.1-50g所述肽类化合物，0.1-6.0g的PVA，0.1-9.0g的聚氨基酸，0.1-15mL的DMSO，5.0-45mL的多元醇，0.1-1.0mol L-1的水溶性糖，余量为缓冲液。
在一个具体实施方式中，所述冷冻保存液含有0.1-10mL的DMSO，例如0.5-7.5mL的DMSO。
在一个具体实施方式中，所述冷冻保存液含有0.1-6.0g的PVA，例如0.2-4.0g的PVA。
在一个具体实施方式中，所述冷冻保存液含有5-30mL多元醇，例如8.0-25mL、20mL、15mL。
在一个具体实施方式中，所述冷冻保存液含有0.1-0.8mol L-1的水溶性糖，例如0.2-0.6mol L-1的水溶性糖。
在一个具体实施方式中，所述冷冻保存液含有5.0-30mL的血清，例如5.0-20mL血清;在另一具体实施方式中，所述冷冻保存液不含有血清。
根据本发明，所述PVA选自等规PVA、间规PVA和无规PVA的一种或两种以上的组合，例如所述PVA的间同规整度为15%-60%，具体地例如50%-60%、50%-55%。
根据本发明，所述PVA可选自分子量为10-500kDa的PVA，例如分子量为10-30kDa、30-50kDa、80-90kDa、200-500kDa。
根据本发明，所述聚氨基酸可选自赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸等中至少一种的均聚物或两种以上氨基酸的共聚物。
根据本发明，所述多元醇可以为碳原子数为2-5的多元醇，优选碳原子数为2-3的二元醇、和/或三元醇，例如乙二醇，丙二醇，丙三醇中的任一种;优选乙二醇。
根据本发明，所述水溶性糖可以为非还原性双糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一种，例如选自蔗糖、海藻糖;优选蔗糖。所述水溶性糖可以起到保护细胞膜和避免细胞沉降的作用。
根据本发明，所述缓冲液可选自DPBS或hepes-buffered HTF缓冲液中的至少一种。
根据本发明，所述血清针对人源性冷冻保存对象可选人血清白蛋白或其替代物十二烷基磺酸钠SDS，针对非人源性冷冻保存对象可选胎牛血清或牛血清白蛋白。
上述冷冻保存液的制备方法，包括将所述肽类化合物溶解于缓冲液中，冷却到室温后调节pH，将其他组分溶解于另外的缓冲液中，冷却后混合，调节pH，用缓冲液定容至预定体积，任选地使用时加入血清。
根据本发明的制备方法，包括如下步骤：
(1)将肽类化合物溶解于一部分缓冲液中，冷却到室温后调节pH，得到溶液1;
(2)将水溶性糖溶解于一部分缓冲液中，待水溶性糖全部溶解后加入其他组分，制得溶液2;
(3)任选地，将PVA和/或聚氨基酸溶解于另一部分缓冲液中，冷却到室温后调节pH，制得溶液3;
(4)待溶液1、溶液2、和任选地溶液3冷却至室温后混合，调节pH，用缓冲液定容至预定体积，得到所述冷冻保存液。
根据本发明的制备方法，所述步骤(3)中，PVA在水浴加热中溶解;例如水浴温度为60-85℃，优选80℃。所述步骤(3)中，所述溶解包括搅拌步骤。
根据本发明的制备方法，所述步骤(2)中，所述溶解为超声辅助溶解。
本发明还提供上述冷冻保存液在卵母细胞或胚胎冻存中的应用。
根据本发明，包括将要保存的卵母细胞或胚胎先置于冷冻平衡液中平衡2-5分钟;然后置于所述冷冻保存液中平衡1-3分钟，将已在冷冻保存液中平衡后的卵母细胞或胚胎放入液氮中进行冷冻。
本发明还提供上述冷冻保存液在制备卵母细胞或胚胎冻存中使用的冷冻试剂中的用途。
本发明还提供上述冷冻平衡液在制备卵母细胞或胚胎冻存中使用的冷冻试剂中的用途。
本发明中，亲水性指可与水分子形成非共价作用，例如可与水形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用;
亲冰性指可与冰形成非共价作用，例如可与冰形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用。
本发明中，使用所述冷冻保存液时，可选用本领域已知的冷冻平衡液，优选，所述冷冻保存液中DMSO含量为0，所述冷冻平衡液以每100mL计，含有多元醇7.5-15mL,血清10-20mL，缓冲液余量;优选，所述冷冻保存液中血清含量也为0时，所述冷冻平衡液以每100mL计，含有PVA 1.0-5.0g，多元醇7.5-15mL，缓冲液余量。
有益效果
本发明的发明人发现在冰水混合相中的控制冰晶生长的过程中，材料需与冰和水均具有良好的相互作用，因此根据亲冰-亲水控冰机制合成了以亲冰氨基酸例如苏氨酸与其他亲水性氨基酸或糖类结合的肽类化合物，所合成的肽类化合物具有良好的控冰效果，可以修饰冰晶形貌，没有热滞后，且含有本发明肽类化合物的冷冻保存液用于冷冻保存卵母细胞和胚胎时可保持优异的存活率。
附图说明
图1：GDL-L-Thr抑制冰晶生长活性的电镜图和冰晶尺寸大小的统计图。
图2：GDL-L-Thr在纯水中修饰冰晶形貌效果。
图3：实施例2制备的TR短链肽抑制冰晶生长活性的光学图片(为显微镜下高速摄像机拍摄)和冰晶尺寸大小的统计图。
图4：实施例2制备的TR短链肽在纯水中修饰冰晶形貌效果。
图5：实施例7类肽R-COOH,R-CH3以及R-CH2CH3抑制冰晶生长活性效果。
图6：类肽(A)R-COOH,(B)R-CH3以及(C)R-CH2CH3在纯水中修饰冰晶形貌效果。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法;下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1式(1)化合物的合成
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂(2-Chlorotrityl Chloride Resin)放入反应管中，加DCM(20mL g-1)，振荡30分钟。砂芯抽滤除去溶剂，加入三倍摩尔过量Fmoc-L-Pro-OH，再加入8倍摩尔过量的DIEA,最后加入DMF溶解，振荡30分钟。甲醇封头30分钟。
(2)除去溶剂DMF，加20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，5分钟后除去溶剂，再加入20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，15分钟后除去哌啶溶液。取少量树脂，用乙醇清洗三次后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。
(3)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DMF(15mL g-1，两次)清洗后，向反应管中加入用尽量少的DMF溶解的Fmoc-L-Thr(tBu)-OH;两倍过量，HBTU两倍过量。之后，立刻加入8倍过量的DIEA，反应30分钟。
(4)抽掉溶液后，取少量树脂，用乙醇清洗三次后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，无色为阴性反应，即反应完全。
(5)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DMF(15mL g-1，两次)清洗后除去溶剂，加20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，5分钟后除去溶剂，再加入20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，15分钟后除去哌啶溶液，取少量树脂，用乙醇清洗后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。
(6)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DCM(15mL g-1，两次)清洗后抽干树脂。
(7)使用切割液(15mL g-1，TFA：水：EDT：Tis=95:1:2:2,V/V)将产物切割90分钟。并将切割液用氮气吹干，之后冻干，得到多肽粗品。
(8)用HPLC纯化多肽并转盐或脱盐，HPLC：tR=6.1mins(纯化柱子型号：Kromasil100-5C18,4.6mm*250mm;梯度洗脱液：0.1%TFA乙腈溶液和0.1%TFA水溶液,0mins-1:99，20mins-1:9)。将纯化后的溶液冻干，既得到成品L-Thr-L-Pro(记为TP)。产率约为80%。质谱鉴定217.3为[M+H]+。
实施例2式(2)化合物的合成
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂放入反应管中，加DCM(20mL g-1)，振荡30分钟。砂芯抽滤除去溶剂，加入三倍摩尔过量Fmoc-Arg(Pbf)-OH，再加入8倍摩尔过量的DIEA,最后加入DMF溶解，振荡30分钟。甲醇封头30分钟。
(2)除去溶剂DMF，加20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，5分钟后除去溶剂，再加入20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，15分钟后除去哌啶溶液。取少量树脂，用乙醇清洗三次后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。
(3)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DMF(15mL g-1，两次)清洗后，向反应管中加入用尽量少的DMF溶解的Fmoc-L-Thr(tBu)-OH;两倍过量，HBTU两倍过量。之后，立刻加入8倍过量的DIEA，反应30分钟。
(4)抽掉溶液后，取少量树脂，用乙醇清洗三次后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，无色为阴性反应，即反应完全。
(5)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DMF(15mL g-1，两次)清洗后除去溶剂，加20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，5分钟后除去溶剂，再加入20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，15分钟后除去哌啶溶液，取少量树脂，用乙醇清洗后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。
(6)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DCM(15mL g-1，两次)清洗后抽干树脂。
(7)使用切割液(15mL g-1，TFA：水：EDT：Tis=95:1:2:2,V/V)将产物切割90分钟。并将切割液用氮气吹干，之后冻干，得到多肽粗品。
(8)用HPLC纯化多肽并转盐或脱盐，HPLC：tR=4.8mins(纯化柱子型号：Kromasil100-5C18,4.6mm*250mm;梯度洗脱液：0.1%TFA乙腈溶液和0.1%TFA水溶液,0mins-1:99，20mins-1:4)。将纯化后的溶液冻干，既得到成品L-Thr-L-Arg(TR)。产率约为80%。质谱鉴定276.2为[M+H]+。
实施例3式(3)化合物的合成
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂放入反应管中，加DCM(20mL g-1)，振荡30分钟。砂芯抽滤除去溶剂，加入三倍摩尔过量Fmoc-L-Thr(tBu)-OH，再加入8倍摩尔过量的DIEA,最后加入DMF溶解，振荡30分钟。甲醇封头30分钟。
(2)除去溶剂DMF，加20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，5分钟后除去溶剂，再加入20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，15分钟后除去哌啶溶液。取少量树脂，用乙醇清洗三次后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。
(3)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DMF(15mL g-1，两次)清洗后，向反应管中加入用尽量少的DMF溶解的Fmoc-Arg(Pbf)-OH;两倍过量，HBTU两倍过量。之后，立刻加入8倍过量的DIEA，反应30分钟。
(4)抽掉溶液后，取少量树脂，用乙醇清洗三次后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，无色为阴性反应，即反应完全。
(5)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DMF(15mL g-1，两次)清洗后除去溶剂，加20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，5分钟后除去溶剂，再加入20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，15分钟后除去哌啶溶液，取少量树脂，用乙醇清洗后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。
(6)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DMF(15mL g-1，两次)清洗后抽干树脂。
(7)重复操作(3)～(5)，链接氨基酸Fmoc-L-Thr(tBu)-OH。反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DCM(15mL g-1，两次)清洗后抽干树脂。
(8)使用切割液(15mL g-1，TFA：水：EDT：Tis=95:1:2:2,V/V)将产物切割90分钟。并将切割液用氮气吹干，之后冻干，得到多肽粗品。
(9)用HPLC纯化多肽并转盐或脱盐，HPLC：tR=3.9mins(纯化柱子型号：Kromasil100-5C18,4.6mm*250mm;梯度洗脱液：0.1%TFA乙腈溶液和0.1%TFA水溶液,0mins-1:99，20mins-1:4)。将纯化后的溶液冻干，既得到成品L-Thr-L-Arg-L-Thr(TRT)。产率约为75%。质谱鉴定377.4为[M+H]+。
实施例4式(4)化合物的合成
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂放入反应管中，加DCM(20mL g-1)，振荡30分钟。砂芯抽滤除去溶剂，加入三倍摩尔过量Fmoc-L-Thr(tBu)-OH，再加入8倍摩尔过量的DIEA,最后加入DMF溶解，振荡30分钟。甲醇封头30分钟。
(2)除去溶剂DMF，加20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，5分钟后除去溶剂，再加入20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，15分钟后除去哌啶溶液。取少量树脂，用乙醇清洗三次后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。
(3)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DMF(15mL g-1，两次)清洗后，向反应管中加入用尽量少的DMF溶解的Fmoc-L-Pro-OH;两倍过量，HBTU两倍过量。之后，立刻加入8倍过量的DIEA，反应30分钟。
(4)抽掉溶液后，取少量树脂，用乙醇清洗三次后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，无色为阴性反应，即反应完全。
(5)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DMF(15mL g-1，两次)清洗后除去溶剂，加20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，5分钟后除去溶剂，再加入20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，15分钟后除去哌啶溶液，取少量树脂，用乙醇清洗后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。
(6)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DMF(15mL g-1，两次)清洗后抽干树脂。
(7)重复操作(3)～(5)，链接氨基酸Fmoc-L-Thr(tBu)-OH。反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DCM(15mL g-1，两次)清洗后抽干树脂。
(8)使用切割液(15mL g-1，TFA：水：EDT：Tis=95:1:2:2,V/V)将产物切割90分钟。并将切割液用氮气吹干，之后冻干，得到多肽粗品。
(9)用HPLC纯化多肽并转盐或脱盐，HPLC：tR=7.6mins(纯化柱子型号：Kromasil100-5C18,4.6mm*250mm;梯度洗脱液：0.1%TFA乙腈溶液和0.1%TFA水溶液,0mins-1:99，20mins-2:8)。将纯化后的溶液冻干，既得到成品L-Thr-L-Pro-L-Thr(TPT)。产率约为70%。质谱鉴定318.3为[M+H]+
实施例5式(5)化合物的合成
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂放入反应管中，加DCM(20mL g-1)，振荡30分钟。砂芯抽滤除去溶剂，加入三倍摩尔过量Fmoc-L-Thr(tBu)-OH，再加入8倍摩尔过量的DIEA,最后加入DMF溶解，振荡30分钟。甲醇封头30分钟。
(2)除去溶剂DMF，加20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，5分钟后除去溶剂，再加入20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，15分钟后除去哌啶溶液。取少量树脂，用乙醇清洗三次后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。
(3)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DMF(15mL g-1，两次)清洗后，向反应管中加入用尽量少的DMF溶解的Fmoc-L-Ala-OH;两倍过量，HBTU两倍过量。之后，立刻加入8倍过量的DIEA，反应30分钟。
(4)抽掉溶液后，取少量树脂，用乙醇清洗三次后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，无色为阴性反应，即反应完全。
(5)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DMF(15mL g-1，两次)清洗后除去溶剂，加20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，5分钟后除去溶剂，再加入20%哌啶/DMF溶液(10mL g-1)，15分钟后除去哌啶溶液，取少量树脂，用乙醇清洗后，加入茚三酮试剂，105～110℃加热5分钟，变深蓝色为阳性反应。
(6)将上述反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DMF(15mL g-1，两次)清洗后抽干树脂。
(7)重复操作(3)～(5)，链接氨基酸Fmoc-L-Ala-OH。反应得到产物用依次用DMF(15mL g-1，两次)、甲醇(15mL g-1，两次)以及DCM(15mL g-1，两次)清洗后抽干树脂。
(8)使用切割液(15mL g-1，TFA：水：EDT：Tis=95:1:2:2,V/V)将产物切割90分钟。并将切割液用氮气吹干，之后冻干，得到多肽粗品。
(9)用HPLC纯化多肽并转盐或脱盐，HPLC：tR=7.9mins(纯化柱子型号：Kromasil100-5C18,4.6mm*250mm;梯度洗脱液：0.1%TFA乙腈溶液溶液乙腈溶液和0.1%TFA水溶液水溶液,0mins-1:99，20mins-1:9)。将纯化后的溶液冻干，既得到成品L-Ala-L-Ala-L-Thr(AAT)。产率约为70%。质谱鉴定260.1为[M-8H]+。
实施例6式(6)化合物的合成
(1)将1.0g(0.56mol)的葡萄糖内酯(GDL)溶解在30mL甲醇里(60℃溶解)，并将0.56mol的L-Thr和0.56mol的NaOH加入到50mL甲醇里，完全溶解后加入到内酯甲醇反应体系中，60℃反应回流48小时。
(2)反应结束后，过滤掉白色沉淀物，把滤液蒸干得到粗产物。
(3)HPLC纯化，，HPLC：tR=3.4mins(纯化柱子型号：Kromasil100-5C18,4.6mm*250mm;梯度洗脱液：0.1%TFA乙腈溶液和0.1%TFA水溶液,0mins-1:99，20mins-1:5)产率约为50%，质谱鉴定296.1为[M]+。
实施例7式(7)化合物的合成
(1)将二氯二甲基硅烷的DCM溶液倒入多肽合成管中，静至30分钟后将合成管晾干备用。
(2)取用100mg树脂于合成管中，加入2mL的DMF，通氮气，溶胀树脂10分钟后抽滤。
(3)加入1mL的4-甲基哌啶/DMF溶液去保护，5分钟后除去，再加1mL的4-甲基哌啶/DMF溶液，15分钟后除去，鼓泡，抽滤。
(4)DMF冲洗5次，鼓泡，抽滤。
(5)依次加入2M,0.5mL的溴乙酸/DMF溶液，N,N-二异丙基碳二亚胺/DMF溶液,鼓泡20分钟，抽滤，DMF冲洗3次。
(6)加入1M,1mL的伯胺/DMF溶液，鼓泡30分钟，DMF冲洗，二氯甲烷冲洗(x3)。
(7)重复步骤5,6，直至所需的分子量。
(8)加入4mL的裂解液，充分摇匀，通氮气吹干，最后冷冻干燥，纯化处理，得到最终成品。
(9)R为-CH3，-CH2CH3以及-CH2CH2COOH的类肽。质谱鉴定444.6是R为-CH3的[M+H]+、528.8是R为-CH2CH3的[M+H]+、792.1是R为-CH2CH2COOH的[M+H]+。
实施例8细胞冻存实验
(1)将实施例2合成的TR和实施例4合成的TPT按以下方法制备冷冻保存液：
冷冻保存液1：总体积100mL，将28g TR超声溶于25mLDPBS中，调节PH为7.0，为溶液1;将0.05mol蔗糖超声溶解于25mL DPBS中，待蔗糖全部溶解后依次加入10mL乙二醇、7.5mLDMSO，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混匀，调节pH并采用DPBS定容至总体积的80%，最后，使用前加20mL血清。
冷冻保存液2：总体积100mL，将28gTPT超声溶于25mLDPBS中，调节PH为7.0，为溶液1;将0.05mol蔗糖超声溶解于25mLDPBS中，待蔗糖全部溶解后依次加入10mL乙二醇、7.5mLDMSO，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混匀，调节pH并采用DPBS定容至总体积的80%，最后，使用前加20mL血清。
冷冻保存液对比例：每1mL中含有15%(v/v)的DMSO,15%(v/v)的乙二醇，20%(v/v)的血清，0.5M蔗糖，余量为DPBS。
(2)平衡液：
冷冻平衡液A：每1mL中含有7.5%(v/v)的DMSO,7.5%(v/v)的乙二醇，20%(v/v)的血清，余量为DPBS;
解冻液a：解冻液Ⅰ(含有1.0mol L-1蔗糖，20%的血清，余量为DPBS);解冻液Ⅱ(含有0.5mol L-1蔗糖，20%的血清，余量为DPBS);解冻液Ⅲ(含有0.25mol L-1蔗糖，20%的血清，余量为DPBS);解冻液Ⅳ(20%的血清，余量为DPBS)。
(3)用上述冷冻保存液和对比例配方保存小鼠卵母细胞
采用上述步骤所制备的冷冻保存液1和2、以及对比例1的冷冻保存液以及冷冻平衡液对小鼠的卵母细胞进行冷冻保存。本发明所用卵母细胞冷冻保存方法具体为卵母细胞先置于冷冻平衡液平衡5分钟，然后置于所制备冷冻保存液50秒，之后放入液氮中保存。解冻后，卵母细胞培养2小时计算卵母细胞的存活率(表1)。
(4)用上述冷冻保存液和对比例配方保存小鼠胚胎
采用上述步骤所制备的冷冻保存液1和2、以及对比例1的冷冻保存液以及冷冻平衡液对小鼠的胚胎进行冷冻保存。本发明所用胚胎冷冻保存方法具体为胚胎先置于冷冻平衡液平衡5分钟，然后置于所制备冷冻保存液50秒，之后放入液氮中保存。解冻后，胚胎培养2小时计算存活率(表2)。
本发明实施例中存活率为3-12次重复实验的存活率平均值。
表1小鼠卵母细胞冷冻保存存活率
表2小鼠胚胎冷冻保存存活率
实施例9控冰性能测试
冰晶重结晶抑制(IRI)活性采用“溅射冷冻法”，将样品溶解分散到DPBS溶液中，将10～30μL上述溶液在1.0m以上的高度滴加到-60℃预冷的干净硅片表面，利用冷热台以10℃/min的速度缓慢升温到-6℃，并在该温度下退火30min，利用偏光显微镜以及高速摄像机观察记录冰晶的大小，冷热台密封，保证内部的湿度在50%左右。每一个样品重复至少三次，使用Nano Measurer 1.2统计冰晶的尺寸，统计结果的误差为标准偏差。
冰晶形貌(DIS)观察和热滞后(Thermal Hysteresis，TH)测量采用纳升渗透压仪，首先用酒精灯外焰熔化毛细管，并同时拉伸产生极细孔径毛细管，将毛细管与微量进样器相连。将黏度较高的浸镜油注入微米孔径圆片中，利用微量进样器将溶解了材料的水溶液注入微孔中。通过控制温度，使液滴快速结冰，并缓慢升温以获得单晶冰，以0.01℃的精度缓慢降温，利用配备了高速摄像机的显微镜观察冰晶形貌以及TH测试。
对上述实施例2中制备的TR的DPBS溶液20μL利用“溅射冷冻法”进行IRI活性测试。测得的相对于DPBS的最大冰晶尺寸(%)如图3所示。通过化学键结合的TR的最大冰晶尺寸明显小于相同浓度下精氨酸的DPBS溶液和苏氨酸的DPBS溶液的最大冰晶尺寸。
取上述实施例2中制备的TR的去离子水溶液，利用纳升进行冰晶形貌观察发现，TR有修饰冰晶形貌的效果(过冷度-0.1,0.05～0.9mol L-1)，如图4所示。且并未测得热滞后。
对上述实施例6中制备的GDL-L-Thr的DPBS溶液20μL利用“溅射冷冻法”进行IRI活性测试。测得的相对于DPBS的最大冰晶尺寸(%)如图2所示。通过化学键结合的GDL-L-Thr的最大冰晶尺寸明显小于相同浓度下GDL的DPBS溶液和L-Thr的DPBS溶液的最大冰晶尺寸，且小于同浓度GDL和L-Thr混合的DPBS溶液的最大冰晶尺寸。
取上述实施例6中制备的GDL-L-Thr的去离子水溶液，利用纳升进行冰晶形貌观察发现，GDL-L-Thr有修饰冰晶形貌的效果(过冷度-0.02～0.4,0.05～0.9mol L-1)，如图3所示。且并未测得热滞后。
对上述实施例7中制备的化合物的DPBS溶液20μL利用“溅射冷冻法”进行IRI活性测试。测得的相对于DPBS的最大冰晶尺寸(%)如图5所示。
取上述实施例7中制备的三种类肽的去离子水溶液，利用纳升进行冰晶形貌观察发现R为-CH3以及-CH2CH3的类肽有较为明显的修饰冰晶形貌的效果，R为-CH2CH2COOH的类肽无修饰冰晶形貌的效果(过冷度-0.02～0.4,1.0～20mg mL-1)所得形貌如图6所示，且三种类肽皆未并未测得热滞后。
上述结果表明，所制备的肽类化合物具有良好的修饰冰晶形貌的效果，且没有热滞后，能实现控制冰晶生长的作用，可以用于控冰材料。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
