一种氨基酸类冷冻保存液在干细胞冻存中的应用
本申请要求2019年4月9日向中国国家知识产权局提交的专利申请号为201910282417.4，发明名称为“一种氨基酸类冷冻保存液及其制备方法”的在先申请的优先权。前述在先申请的全文通过引用的方式结合于本申请中。
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种氨基酸类冷冻保存液在干细胞冻存中的应用。
背景技术
冷冻保存是指将生物材料保存于超低温状态下，使细胞新陈代谢和分裂速度减慢或者停止，一旦恢复正常生理温度又能继续发育。该技术自问世以来，成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一，已被广泛采用。近年来，随着生活压力的增加，人类生育力呈逐年下降的趋势，生育力保存越来越受到人们的重视，人类生殖细胞(精子、卵母细胞)、性腺组织等的冷冻保存就成为保存生育力的重要手段。另外，随着世界人口老龄化加剧，对捐赠的可用于再生医学和器官移植的人源性细胞、组织或器官的冷冻保存的需求也极速增加。因此，如何高效的冷冻保存珍贵的细胞、组织以及器官资源以备不时之需成为亟待解决的科学技术问题。
目前最常用的冷冻保存方法为玻璃化冷冻。玻璃化冷冻技术虽然在快速冷冻过程中可使细胞内外的液体直接成为玻璃态而避免了冷冻过程中因冰晶形成而导致的损伤。但是，在复温过程中，现有的冷冻保存试剂不能有效的控制冰晶的生长，从而损害细胞。除此之外，目前玻璃化冷冻方法所使用的高浓度(≥15%)的二甲基亚砜(DMSO)或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等对细胞有毒的有机溶剂，导致冷冻保存试剂对细胞的毒副作用，严重影响冷冻保存对象复苏后的存活率甚至(子代)安全性以及功能表达。综上，目前采用的冷冻保存试剂不具备复温过程中有效控制冰晶生长的能力，同时存在试剂毒性大的问题。
发明内容
本发明提供一种氨基酸类冷冻保存液，并提供该冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用。
本发明的氨基酸类冷冻保存液，每100mL溶液中含有：氨基酸类仿生控冰材料0.1-50g，多元醇5.0-45mL，DMSO 0-15mL，血清0-30mL，水溶性糖0.1-1mol L-1，缓冲液余量。
根据本发明，所述氨基酸类仿生控冰材料选自氨基酸或者聚氨基酸的一种或两种以上。
作为本发明的一个实施方案，所述氨基酸类仿生控冰材料可以为含有亲冰基团和亲水基团的氨基酸、或者含有亲冰基团的氨基酸和含有亲水基团的氨基酸组成的聚氨基酸。
所述亲水基团为可与水分子形成非共价作用的官能团，例如可与水形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用;可以选自羟基(-OH)、氨基(-NH2)、羧酸基(-COOH)、或酰胺基(-CONH2)等中的至少一种;
所述亲冰基团为可与冰形成非共价作用的官能团，例如可与冰形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用;示例性地所述亲冰基团可以选自羟基(-OH),氨基(-NH2),苯基(-C6H5)，或吡咯烷基(-C4H8N)的至少一种。
示例性地，所述氨基酸类仿生控冰材料选自精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甘氨酸等中的一或两种，或者由上述氨基酸组成的聚氨基酸;例如所述氨基酸类仿生控冰材料为精氨酸与苏氨酸的组合。
作为本发明的一个实施方案，所述氨基酸类仿生控冰材料为聚氨基酸(聚合度≥2)，优选聚合度为2～40(如聚合度为6、8、15、20等)，所述聚氨基酸为氨基酸的均聚物，例如为聚-L-脯氨酸、聚-L-精氨酸等中的一种或两种以上的组合。
根据本发明，每100mL冷冻保存液中所述氨基酸类仿生控冰材料含量为0.5-50g，优选1.0-35g，例如，当所述氨基酸类仿生控冰材料为氨基酸时，其含量可以为5.0-35g，优选为15-25g;当所述氨基酸类仿生控冰材料为聚氨基酸时，其含量可以为0.5-9.0g，优选为1.0-5.0g。
根据本发明，所述多元醇可以为碳原子数为2-5的多元醇，优选碳原子数2-3的二元醇、和/或三元醇，例如乙二醇，丙二醇，丙三醇中的任一种;优选乙二醇。
根据本发明，所述水溶性糖可以为非还原性双糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一种，例如选自蔗糖、海藻糖、水溶性纤维素(例如羟丙基甲基纤维素等)、聚蔗糖;优选蔗糖。所述水溶性糖可以起到保护细胞膜和避免细胞沉降的作用。
根据本发明，所述缓冲液可选自DPBS或hepes-buffered HTF缓冲液或其他细胞培养缓冲液中的至少一种。
根据本发明，所述血清针对人源性冷冻保存对象可选人血清白蛋白或其替代物，如：十二烷基磺酸钠，针对非人源性冷冻保存对象可选胎牛血清或牛血清白蛋白。
根据本发明，每100mL冷冻保存液中所述DMSO含量为0-10mL，优选DMSO含量为1.0-7.5mL，例如1.5-5mL;作为本发明的另一实施方案，每100mL冷冻保存液中所述DMSO含量为0。
根据本发明，每100mL冷冻保存液中所述血清含量为0.1-30mL，例如5.0-20mL，再例如10-15mL;作为本发明的另一实施方案，每100mL冷冻保存液中所述血清含量为0。
根据本发明，每100mL冷冻保存液中所述水溶性糖含量为0.1-1.0mol L-1，例如0.1-0.8mol L-1，0.2-0.6mol L-1;具体地，例如0.25mol L-1，0.5mol L-1，1.0mol L-1。
根据本发明，每100mL冷冻保存液中所述多元醇，含量为5.0-40mL，例如6.0-20mL，9-15mL。
根据本发明，所述冷冻保存液的pH为6.5-7.6，例如为6.9-7.2。
根据本发明，每100mL所述冷冻保存液还含有0.1-6.0g的聚乙烯醇(PVA)。
根据本发明，所述PVA选自等规PVA、间规PVA和无规PVA的一种或两种以上的组合，例如所述PVA的间同规整度为15%-65%，具体地例如40%-60%、53%-55%。优选无规PVA，例如所述PVA的间同规整度为45%-65%的PVA。
根据本发明，所述PVA可选自分子量为10-500kDa或者更高分子量的PVA，例如分子量为10-30kDa、30-50kDa、80-90kDa、200-500kDa。
根据本发明，所述PVA可选自水解度大于80%的PVA，例如水解度为80%-99%、82-87%、87%-89%、89%-99%、98%-99%。
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存液以每100mL计，含有如下组分：
优选：所述冷冻保存液以每100mL计，含有如下组分：
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存液以每100mL体积计，含有如下组分：
优选：所述冷冻保存液以每100mL体积计，含有如下组分：
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻保存液以每100mL体积计，含有如下组分：
优选：所述冷冻保存液以每100mL体积计，含有如下组分：
本发明还提供上述冷冻保存液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述氨基酸类仿生控冰材料溶解于部分缓冲液，调节pH后形成溶液1;任选地，将PVA溶解于另外一部分缓冲液中，调节pH后得到溶液2;
(2)将水溶性糖溶解于第三部分的缓冲液中，待水溶性糖全部溶解后加入其他组分，制得溶液3;
(3)待溶液1、任选地溶液2、和溶液3冷却至室温后混合，调节pH并用缓冲液定容至预定体积，得到所述冷冻保存液。
根据本发明的制备方法，当所述冷冻保存液含有血清时，所述血清在所述冷冻保存液使用时添加。
根据本发明的制备方法，所述PVA溶解时，采用温浴加热并进行搅拌，例如水浴或油浴;例如水浴温度为65-85℃、70-80℃;所述搅拌为机械搅拌例如磁力搅拌。
根据本发明的制备方法，所述步骤(2)中，所述溶解为超声辅助溶解。
本发明还提供一种冷冻平衡液，以每100mL计，含有多元醇5.0-45mL，缓冲液余量。
根据本发明的冷冻平衡液，还任选地包括DMSO 0-15mL，血清0-30mL，和/或PVA 0-5.0g。
根据本发明的冷冻平衡液，所述多元醇含量为6.0-28mL，例如7.0-20mL，10-15mL。
根据本发明的冷冻平衡液，所述DMSO含量为0.1-15mL，例如1.0-10mL，5.0-7.5mL;作为本发明的一个实施方案，所述DMSO的含量为0。
根据本发明的冷冻平衡液，所述血清含量为0.1-30mL，例如5.0-20mL，10-15mL;作为本发明的一个实施方案，所述血清的含量为0。
根据本发明的冷冻平衡液，所述PVA含量为0.1-5.0g，例如0.1g、0.5g、1.0g、2.0g;作为本发明的一个实施方案，所述PVA的含量为0。
本发明冷冻平衡液中，所述多元醇、血清、缓冲液可选自与所述冷冻保存液中相同的种类。
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻平衡液以每100mL计，含有多元醇5.0-7.5mL，DMSO 5.0-7.5mL,血清10-20mL，缓冲液余量。
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻平衡液以每100mL计，含有多元醇7.5-15mL，血清10-20mL，缓冲液余量。
作为本发明的一个实施方案，所述冷冻平衡液以100mL计，含有PVA1.0-5.0g，多元醇7.5-15mL，缓冲液余量。
本发明还提供上述冷冻平衡液的制备方法，包括将各组分溶解于缓冲液中，血清单独存放，在使用时添加。
一种氨基酸类冷冻保存用试剂，包括上述冷冻平衡液和上述冷冻保存液，所述平衡液和保存液彼此独立存在。
根据本发明的冷冻保存用试剂，所述冷冻保存液中DMSO含量为0，所述冷冻平衡液以每100mL计，含有PVA 1.0-5.0g，多元醇7.5-15mL,血清10-20mL，缓冲液余量;所述冷冻保存液中DMSO和血清含量都为0时，所述冷冻平衡液以每100mL计，含有PVA 1.0-5.0g，多元醇7.5-15mL，缓冲液余量。
本发明提供上述冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用。
根据本发明的实施方案，所述干细胞为本领域已知的具有分化功能的各种干细胞，例如全能干细胞、多能干细胞或者专能干细胞，包括但不限于胚胎干细胞、各类间充质干细胞(例如脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等)、造血干细胞。
根据本发明的实施方案，干细胞冷冻保存采用微滴法，例如所述干细胞冷冻保存的应用包括如下步骤:将冷冻保存液加入干细胞中，吹打分散，制成干细胞悬液，将干细胞悬液置于冷冻载片上，液氮(-196℃)冷冻保存。
根据本发明的实施方案，冷冻保存的干细胞的解冻包括将置有干细胞的冷冻载片置于a-MEM培养基中，37℃解冻。
本发明中“冻存”和“冷冻保存”具有相同含义，可互换使用，指通过低温对某种物质或者细胞、组织、器官进行保存，使其保持其本来的理化和/或生物活性、生理生化功能。
有益效果
本发明提供的冷冻保存液以氨基酸类仿生控冰材料为主要控冰成分，来源广泛，生物相容性好，所制备的冷冻保存试剂可大大较少DMSO的用量甚至不加DMSO，毒性小，能达到与现有含DMSO15%以上的商业化冷冻保存液同等甚至更高的细胞存活率。本发明的冷冻保存液组成简单，且原料来源方便，成本低廉，可广泛应用于各类细胞、组织的冷冻保存，例如可广泛用于卵母细胞、胚胎、干细胞、卵巢组织、卵巢器官等冷冻保存，均可保持良好的生物活性。
附图说明
图1为新鲜(未冷冻)卵巢器官切片染色照片;
图2为对比实例8冻存的完整卵巢器官解冻后切片染色照片;
图3-6依次为应用实例14-17冻存的完整卵巢器官解冻后切片染色照片;
图7为新鲜(未冷冻)卵巢组织切片染色照片;
图8为对比实例9冻存的卵巢组织解冻后切片染色照片;
图9-12依次为应用实例18-21冻存的卵巢组织解冻后切片染色照片。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法;下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中冷冻液中采用聚-L-脯氨酸聚合度为15或者聚合度为8，分子量分别为1475或者795;聚-L-精氨酸聚合度为8，分子量为1267。解冻液中聚-L-脯氨酸聚合度为8，分子量为795。
本发明实施例中存活率为3-12次重复实验的存活率平均值。
实施例1卵母细胞和胚胎冷冻保存
1.制备冷冻保存液：按以下配方配制冷冻保存液
冷冻保存液A:总体积100mL：将16g的L-Arg与8g的L-Thr溶于25mL的DPBS中，调节pH为6.9，为溶液1;将17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后依次加入10mL的乙二醇、10mL的DMSO，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将2种溶液混均，调节pH至6.9，并用DPBS定容补齐余量至总体积的80%，20mL的胎牛血清单独存放，在冷冻保存液使用前加入。
冷冻保存液B:总体积100mL，将1.5g的聚-L-脯氨酸(聚合度为15)超声溶解于25mL的DPBS中，调节pH为6.8，为溶液1;将17g(0.05mol)的蔗糖超声溶解于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后依次加入10mL的乙二醇、10mL的DMSO，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH至7.0，并用DPBS定容补齐余量至总体积的80%，20mL的血清单独存放，在冷冻保存液使用前加入。
冷冻保存液C:总体积100mL，将1.5g的聚-L-精氨酸(聚合度为8)超声溶解于25mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液1;将17g(0.05mol)的蔗糖超声溶解于20mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后依次加入10mL的乙二醇、10mL的DMSO，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混均，调节pH至7.0，并用DPBS定容补齐余量至总体积的80%，20mL的血清单独存放，在冷冻保存液使用前加入。
冷冻保存液D：总体积100mL，将1.5g的聚-L-脯氨酸超声溶于另外20mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液1;将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于25mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液2;将17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后依次加入10mL的乙二醇，为溶液3，待溶液1、溶液2及溶液3恢复至室温，再将三种溶液混匀，调节pH值，并用DPBS定容补齐余量至总体积100mL，备用。
冷冻保存液E：总体积100mL，将1.5g的聚-L-精氨酸(聚合度为8)超声溶于另外20mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液1;将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于25mL的DPBS中，调节pH为7.0，为溶液2;将17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L-1)超声溶解于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后依次加入10mL的乙二醇，为溶液3，待溶液1、溶液2及溶液3恢复至室温，再将三种溶液混匀，调节pH值，并用DPBS定容补齐余量至总体积100mL，备用。
2.制备冷冻平衡液：按以下配方配制冷冻平衡液
冷冻平衡液a：将7.5mL的乙二醇、7.5mL的DMSO加入65mL的DPBS中，混匀，使用时加入20m L的血清。
冷冻平衡液b：将2.0g的PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于92.5的mL的DPBS中，待PVA全部溶解，调节pH为7.0，加入7.5mL的乙二醇，混匀，备用。
对比例1：
冷冻平衡液a：每1mL中含有7.5%(v/v)的DMSO,7.5%(v/v)的乙二醇，20%(v/v)的胎牛血清，余量为DPBS;
冷冻保存液1#：每1mL中含有15%(v/v)的DMSO,15%(v/v)的乙二醇，20%(v/v)的胎牛血清，0.5mol L-1蔗糖，余量为DPBS。
冷冻平衡液2#：每1mL中含有7.5%(v/v)的乙二醇，20%(v/v)的胎牛血清，余量为DPBS;
冷冻保存液2#：每1mL中含有10%(v/v)的乙二醇，20%(v/v)的胎牛血清，0.5molL-1蔗糖，余量为DPBS。
实施例1和对比例1采用的解冻液配方有如下两种：
解冻液1#：解冻液Ⅰ(含有1.0mol L-1蔗糖，20%的血清，余量为DPBS);解冻液Ⅱ(含有0.5mol L-1蔗糖，20%的血清，余量为DPBS);解冻液Ⅲ(含有0.25mol L-1蔗糖，20%的血清，余量为DPBS);解冻液Ⅳ(20%的血清，余量为DPBS)。
解冻液2#：解冻液I(含有1.0mol L-1的蔗糖，20mg mL-1的PVA，10mg mL-1的聚脯氨酸，余量为DPBS);解冻液II(含有0.5mol L-1蔗糖，20mg mL-1的PVA，5.0mg mL-1的聚脯氨酸，余量为DPBS);解冻液III(含有0.25mol L-1蔗糖，20mg mL-1的PVA，2.5mg mL-1的聚脯氨酸，余量为DPBS);解冻液IV(20mg mL-1的PVA，余量为DPBS)。
应用例1：
采用上述实施例及对比例的冷冻平衡液以及冷冻保存液按表1和表2中的方案分别进行卵母细胞和胚胎冷冻保存。
1.卵母细胞冷冻保存
小鼠卵母细胞先置于冷冻平衡液中平衡5分钟;然后置于所制备冷冻保存液中1分钟，将已在冷冻保存液中平衡后的卵母细胞放置于冷冻载杆上，然后快速投入液氮中(-196℃)中，并封闭载杆后继续保存;解冻时，将冷冻的卵母细胞置于37℃的解冻液Ⅰ中平衡5分钟，再依次在解冻液Ⅱ-Ⅳ中各平衡3分钟;将解冻完毕的卵母细胞培养2小时后观察存活细胞数量，计算存活率(参见表1)。
2.胚胎冷冻保存
小鼠胚胎先置于冷冻平衡液平衡5分钟，然后置于按上述配方所制备冷冻保存液50秒，将已在冷冻保存液中平衡的胚胎放置于冷冻载杆上，然后快速投入液氮(-196℃)中，并封闭载杆后继续保存;解冻时，将冷冻的胚胎置于37℃的解冻液Ⅰ中平衡3分钟，再依次在解冻液Ⅱ-Ⅳ中各平衡3分钟;将解冻完毕胚胎培养2小时，观察存活胚胎数量，计算存活率(参见表2)。
表1小鼠卵母细胞冷冻保存存活率
表2小鼠胚胎冷冻保存存活率
由表1和表2的数据可以看出，本发明的冷冻保存液进行卵母细胞和胚胎冷冻保存时，卵母细胞存活率可达98%以上，胚胎存活率可达95%以上，能达到甚至远高于目前临床普遍使用的含有15%DMSO的商业化冷冻保存液(对比实例1-4)的冷冻保存复苏率，且添加了氨基酸仿生控冰材料的冷冻保存效果显著优于不添加对比实例2，即未添加仿生控冰材料的冷冻保存液。
实施例2：人脐带间充质干细胞的冷冻保存
1.制备冷冻保存液：按以下配方配制冷冻保存液
冷冻保存液F：总体积100mL，含有乙二醇10mL、血清20mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、聚L-精氨酸(聚合度为8)4.0g、PVA 1.0g、DPBS余量。
冷冻保存液G：总体积100mL，含有乙二醇10mL、血清20mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、聚L-精氨酸(聚合度为8)4.0g、DMSO 7.5mL、DPBS余量。
冷冻保存液H：总体积100mL，含有乙二醇10mL、血清20mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、聚L-脯氨酸(聚合度为8)4.0g、DMSO 7.5mL、DPBS余量。
冷冻保存液I：总体积100mL，含有乙二醇10mL、血清20mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、L-Arg 16g、L-Thr 8g、DMSO 7.5mL、DPBS余量。
冷冻保存液J：总体积100mL，含有乙二醇25mL、血清20mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、L-Arg 16g、L-Thr 8g、DPBS余量。
冷冻保存液配制方法同实施例1。
2.对比例2：
冷冻保存液1#：每1mL中含有15%(v/v)的DMSO,15%(v/v)的乙二醇，20%(v/v)的胎牛血清，0.5mol L-1蔗糖，余量为DPBS。
冷冻保存液4#：每1mL中含有10%(v/v)的DMSO，15%(v/v)的胎牛血清，余量为a-MEM培养基(USA,Invitrogen,C12571500BT)。
应用例2：
采用上述实施例及对比例的冷冻保存液按表3中的方案分别进行人脐带间充质干细胞的冷冻保存。
1.微滴法冷冻保存人脐带间充质干细胞
本发明所用人脐带干细胞冷冻保存方法具体为：将培养皿上的人脐带间充质干细胞用25%胰酶消化3分钟后(消化时间控制在2-3分钟内即可)，放入等体积培养液(10%FBS+a-MEM培养基)，轻柔吹打至干细胞全部脱落，加入1.5ml离心管，1000rmp离心5分钟，弃上清(将细胞与上清液分离)，将10uL冷冻液加入离心管底部，轻柔吹打使干细胞团分散，将此10uL带有干细胞的冷冻液置于冷冻载片上，置于液氮(-196℃)冻存。解冻时，将带有细胞及冷冻液的冷冻载杆直接放入37℃培养基中进行解冻。解冻后，台盼蓝染色察看其存活率，并使用仪器JIMBIO-FIL计数细胞数量，存活率=活细胞数/细胞总数(参见表3)。
表3人脐带间充质干细胞冷冻保存存活率
本发明的冷冻保存液进行人脐带间充质干细胞冷冻保存时，即使不使用或仅使用少量DMSO(7.5%)干细胞存活率可达80%以上，例如应用实例9和13，在完全不添加DMSO时，存活率可达到92.4%和71.0%，表明该冷冻用试剂不仅能达到常规冷冻液冷冻干细胞的有效性，甚至远高于目前普遍使用的含有10%的DMSO的冷冻保存液(对比实例6)的冷冻保存复苏率，添加了氨基酸仿生控冰材料的冷冻保存效果显著优于不添加氨基酸类控冰材料的对比实例5、6。
实施例3：卵巢器管和卵巢组织的冷冻保存
1.制备冷冻保存液：按以下配方配制冷冻保存液和冷冻平衡液
冷冻保存液K：总体积100mL，含有乙二醇10mL、血清20mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、聚L-精氨酸(聚合度为8)4.0g、PVA 1.0g、DPBS余量。
冷冻保存液L：总体积100mL，含有乙二醇10mL、血清20mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、聚L-精氨酸(聚合度为8)4.0g、DMSO 7.5mL、DPBS余量。
冷冻保存液M：总体积100mL，含有乙二醇10mL、血清20mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、L-Arg 16g、L-Thr 8g、DMSO 7.5mL、DPBS余量。
冷冻保存液N：总体积100mL，含有乙二醇10mL、血清20mL、蔗糖17g(0.5mol L-1)、聚L-脯氨酸(聚合度为8)4.0g、DMSO 7.5mL、DPBS余量。
冷冻保存液配制方法同实施例1。
冷冻平衡液a：将7.5mL的乙二醇、7.5mL的DMSO加入65mL的DPBS中，混匀，使用时加入20m L的血清。
冷冻平衡液b：7.5mL的乙二醇加入72.5mL的DPBS中，混匀，使用时加入20m L的血清。
2.对比例3：
冷冻平衡液a：每1mL中含有7.5%(v/v)的DMSO,7.5%(v/v)的乙二醇，20%(v/v)的胎牛血清，余量为DPBS;
冷冻保存液1#：每1mL中含有15%(v/v)的DMSO,15%(v/v)的乙二醇，20%(v/v)的胎牛血清，0.5mol L-1蔗糖，余量为DPBS。
3.解冻液：
解冻液1#：解冻液Ⅰ(含有1.0mol L-1蔗糖，20%的血清，余量为DPBS);解冻液Ⅱ(含有0.5mol L-1蔗糖，20%的血清，余量为DPBS);解冻液Ⅲ(含有0.25mol L-1蔗糖，20%的血清，余量为DPBS);解冻液Ⅳ(20%的血清，余量为DPBS)。
应用例3:
采用上述实施例及对比例的冷冻平衡液以及冷冻保存液按表4、表5中的方案分别对新生3天内的小鼠完整的卵巢器官和性成熟小鼠的卵巢组织切片进行冷冻保存。
整个卵巢器官或者卵巢组织切片先置于冷冻平衡液室温平衡25分钟，然后置于所制备的冷冻保存液中15分钟，之后将完整卵巢器官或卵巢组织切片放置于冷冻载杆上，投入液氮中保存。解冻后，完整卵巢器官或卵巢组织切片放入培养液(10%FBS+a-MEM)后置于37℃、5%CO2培养箱中复苏培养2小时后用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、HE染色，显微镜下观察形态，结果如图1-12所示，图1为新鲜未冷冻的卵巢器官切片染色照片，图7为新鲜未冷冻的卵巢组织切片染色照片。
表4卵巢器官冷冻保存方案
表5卵巢组织冷冻保存方案
根据图1-6可知，与使用不添加氨基酸类仿生控冰材料的对比实例8以及新鲜未冷冻的卵巢器官相比，实施例14-17中原始卵泡结构相对完整，间质结构相对完整，细胞胞浆均质、淡染相对较多，胞核皱缩、深染相对较少;血管管壁结构完整，管腔塌陷较少，内皮细胞胞浆均质、淡染相对较多，胞核皱缩、深染相对较少。可见，实施例14-17组对于卵巢器官的冻存效果更好。
根据图7-12可知，实施例18-21的方案和对比实例9以及新鲜未冷冻的卵巢组织相比，生长期卵泡及窦卵泡结构相对完整，可见本发明的冻存液用于冻存卵巢组织也比现有技术具有更好的效果。
由此可见，本发明以氨基酸类仿生控冰材料为主要成分制备的冷冻保存液具有良好的抑制冰晶生长的效果，可以减少保存体系中DMSO的用量，甚至不加DMSO，可保持良好的生物相容性，并且可以同时适用于卵母细胞、胚胎、干细胞、生殖器官和组织的冷冻保存，均可达到良好的细胞存活率和生物活性。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
