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一种抑制Bax引起的植物叶片坏死的相关蛋白及其应用

2023-01-06 00:36:31

一种抑制Bax引起的植物叶片坏死的相关蛋白及其应用

　　技术领域

　　本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种辣椒疫霉侵染植物相关蛋白及其应用。

　　背景技术

　　辣椒疫霉菌属于卵菌，是一种带有破坏性的丝状植物病原体，对植物特别是双子叶植物有比较强的致病性(Margulis and Schwartz.,2000)。

　　辣椒疫霉属于卵菌门卵菌纲霜霉目疫霉科疫霉属，

　　辣椒疫霉病原菌通常以卵孢子在土壤中或病残体中进行越冬，借助风、水及其他农事活动传播病害(郑玲等,2007)。发病后能够产生新的孢子囊，形成游动孢子进行再侵染。病菌生育温度范围为10-37℃，最适宜温度为20-30℃。在重茬、低洼地、排水不良等坏境下，密度过大、植株衰弱等地区均有利于该病的发生和蔓延。

　　辣椒疫病的病原物卵孢子存活的时间最高可达到3年左右，病原菌主要以卵孢子的形式在土壤中和病残体上越冬，以便度过温度较低、环境不适宜的季节。春天到来后，在适宜的温度和湿度条件下卵孢子将会开始萌发，能较快的产生游动孢子，侵入辣椒的根部、茎基部和叶部等(Lamour and Hausbeck.,2001)。在辣椒植株的生长期间，病原菌将陆续产生孢子囊和游动孢子，借助风、雨水、土壤等传播，进行多次再侵染(Ristaino et al.,1991；Ristain et al.,1992；Ristain0 et al.,1993；Schlub et al., 1983；Springer etal.,1982)。

　　当前辣椒疫病的防治工作仍以传统的化学药剂防治为主。防治辣椒疫霉引起的重金属超标及农药残留这一些列问题给人类健康、环境安全带来了巨大的威胁。

　　发明内容

　　本发明所要解决的一个技术问题是如何抑制Bax引起的植物叶片坏死和/或如何抑制辣椒疫霉侵染植物。

　　蛋白质，是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

　　A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质或氨基酸序列是序列表1的蛋白质；

　　A2)包含序列表中序列1所示的氨基酸序列的并与叶片细胞坏死和/或辣椒疫霉侵染相关的蛋白质；

　　A3)将A2)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有同一性且与叶片细胞坏死和/或辣椒疫霉侵染相关的蛋白质；

　　A4)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

　　其中，所述A2为如下A21或A22，其中：

　　A21、氨基酸序为序列3所示的氨基酸序列的蛋白质；

　　A22、氨基酸序为序列3中第16-329位所示的氨基酸序列的蛋白质；

　　其中，A3中的所述的蛋白可以为A21所述蛋白的同源蛋白RxLR101pi和RxLR101pp，其与A21(RxLR101)的同源比对结果如图1所示。

　　其中，所述A4中的融合蛋白为如下A41、A42、A43或A44，其中：

　　A41、氨基酸序为序列5所示的氨基酸序列的蛋白质；

　　A42、氨基酸序为序列9所示的氨基酸序列的蛋白质；

　　A43、氨基酸序为序列7所示的氨基酸序列的蛋白质；

　　A44、氨基酸序为序列7中第16-340位所示的氨基酸序列的蛋白质；

　　A45、氨基酸序为序列11所示的氨基酸序列的蛋白质；

　　A46、氨基酸序为序列11中第16-343位所示的氨基酸序列的蛋白质。

　　本发明还提供与所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：

　　B1)编码权利要求1-3任一所述蛋白质的核酸分子；

　　B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

　　B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

　　B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

　　B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

　　B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

　　B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

　　其中，B1)所述核酸分子为核苷酸为R如下B101、B102、B103、B104、B105、B106、B107、B108、B109、B109、B110、B111、B112：

　　B101、序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

　　B102、序列表中序列10的cDNA分子或DNA分子；

　　B103、序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子；

　　B104、是序列表中序列4中第46-987位的cDNA分子或DNA分子；

　　B105、序列表中序列6的cDNA分子或DNA分子；

　　B106、序列表中序列8的cDNA分子或DNA分子；

　　B107、序列表中序列8中第46-1020位的cDNA分子或DNA分子；

　　B108、序列表中序列12的cDNA分子或DNA分子；

　　B109、序列表中序列12中第46-1032位的cDNA分子或DNA分子。

　　一种抑制辣椒疫霉侵染植物的方法，包括在植物中导入含有所述的B101、B105、B106或B107的重组载体或者在植物中导入含有所述的B101、B105、B106或B107的重组微生物。

　　一种抑制辣椒疫霉侵染植物的方法在调控植物辣椒疫霉侵染、制备植物抗辣椒疫霉侵染产品、培育抗辣椒疫霉侵染植物或者植物育种中的应用。

　　所述蛋白质、或所述生物材料的下述P1-P9中的任一种应用：

　　P1、所述蛋白质、或所述生物材料在调控植物叶片细胞坏死中的应用；

　　P2、所述蛋白质、或所述生物材料在制备减少植物叶片坏死的产品中的应用；

　　P3、所述蛋白质、或所述生物材料在培育减少植物叶片坏死植物中的应用；

　　P4、所述蛋白质、或所述生物材料在制备减少植物叶片坏死产品中的应用；

　　P5、所述蛋白质、或所述生物材料在调控植物辣椒疫霉侵染中的应用；

　　P6、所述蛋白质、或所述生物材料在制备提高植物抗辣椒疫霉侵染的产品中的应用；

　　P7、所述蛋白质、或所述生物材料在培育抗辣椒疫霉侵染植物中的应用；

　　P8、所述蛋白质、或所述生物材料在制备植物抗辣椒疫霉侵染产品中的应用；

　　P9、所述蛋白质、或所述生物材料在植物育种中的应用。

　　其中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

　　其中，所述植物为本氏烟或者辣椒。

　　本发明的有益效果在于，本发明中的RxLRnudix(蛋白A1))和RxLR101(蛋白A2))均能够抑制Bax诱导的PCD，RxLR101-P.p和RxLR101-P.i(蛋白A3))也能够抑制Bax引发的PCD。RxLRnudix(蛋白A1))和RxLR101的融合蛋白RxLR101-NLS与RxLRnudix-NLS (蛋白A4))能够更加强烈的抑制辣椒疫霉游动孢子的侵染。从而为有效利用植物的抗病机制设计防治辣椒疫病的新策略提供了理论依据。

　　附图说明

　　图1.同源基因序列比对图；

　　图2.RxLR101截短体模式图

　　图3.RxLR效应分子在本氏烟上的致病性分析，图3a为RxLRnudix的功能验证图，其中A代表RxLR101，B代表RxLRnudix，C代表buffer缓冲液；D代表空载体pBIN-GFP2， E代表INF1。图3b为RxLR101-P.i、RxLR101-P.p的功能验证图，其中，A代表空载pBIN-GFP2；B分别代表RxLRnudix、RxLR101-P.i、RxLR101-P.p；C代表buffer缓冲液；D代表INF1。

　　图4.RXLR的抑制性分析图，4a中，A代表RxLR101，B分别代表RxLR101-P.p，RxLR101-P.i，C代表buffer缓冲液，D代表空载体pBIN-GFP2。右图为台盼蓝染色结果，图4b图为RxLRnudix抑制性分析，A代表RxLR101，B代表RxLRnudix，C代表buffer缓冲液；D代表空载体pBIN-GFP2，E代表INF1。右图为台盼蓝染色结果。

　　图5.实施例3中的RxLR101和-RxLRnudix的辣椒疫霉游动孢子侵染结果

　　图6.实施例3中的RxLR101和-RxLRnudix的qPCR检测结果

　　图7.RxLR101融合蛋白的抑制性分析，A分别代表RxLR101-NES，RxLRnudix-NES， B分别代表RxLR101-NLS，RxLRnudix-NLS，CRxLR101，D空载pBIN-GFP2，E代表RxLRnudix，F代表buffer。右图为台盼蓝染色结果。

　　图8.实施例5中RxLR101-NES/NLS对辣椒疫霉游动孢子侵染结果

　　图9.实施例5中RxLR101-NES/NLSqPCR检测结果

　　图10.实施例5RxLRnudix-NES/NLS对辣椒疫霉游动孢子侵染结果

　　图11.实施例5中RxLRnudix-NES/NLSqPCR检测结果。

　　具体实施方式

　　下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

　　下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

　　载体和菌株

　　实验所用的克隆载体pEASY-T3 clone Vector购自北京全式金生物技术有限公司，植物表达载体pBIN-GFP2(在“A Virulence Essential CRN Effector ofPhytophthora capsici Suppresses Host Defense and Induces Cell Death in PlantNucleus”文献中公开过，公众可以从窦道龙教授实验室获得)，pYF2-PsNLS-hSpCas9、pYF2.3G-Ribo-sgRNA (在“A Phytophthora capsici Effector Targets ACD11 BindingPartners that Regulate ROS-Mediated Defense Response in Arabidopsis”文献中公开过，可以从窦道龙教授实验室获得)，pBluescriptIIKS+载体购自铂尚生物技术有限公司。

　　大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101购自TransGen Biotechcorporation 公司。

　　辣椒疫霉菌株SD33(Phytophthora capsici)(Yong Jian Jia,Bao Zhen Feng,Wen Xiu Sun and Xiu Guo Zhang，J.Phytopathol,157:585-591,2009)，公众可从山东农业大学获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

　　Bax农杆菌菌株(在“辣椒疫霉6个RxLR和大豆疫霉1个CRN效应子的功能分析”文献中公开过，公众可以从南京农业大学窦道龙教授实验室获得)。

　　辣椒疫霉菌Jul0201、辣椒疫霉菌Aug0202(Genetic diversity in phytophthoracapsici from eastern China，2008)公众可从山东农业大学获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。本发明中的具体实施例中涉及的引物如表1所示：

　　表1引物表：

　　实施例1、RxLR101、RxLR101短截体RxLRnudix的获得：

　　RxLR101基因的克隆：以本实验室保存的辣椒疫霉SD33菌株的总DNA为模板，设计特异性的引物(引物RxLR101-F和引物RxLR101-R)，利用引物RxLR101-F和引物RxLR101-RPCR扩增RxLR101基因，将反应的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳。

　　RxLR101-P.p基因的克隆：以本实验室保存的辣椒疫霉菌Jul0201的总DNA为模板，设计特异性的引物(引物RxLR101-P.p-F和引物RxLR101-P.p-R)，利用引物 RxLR101-P.p-F和引物RxLR101-P.p-RPCR扩增RxLR101-P.p基因，将反应的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳。

　　RxLR101-P.i基因的克隆：以本实验室保存的辣椒疫霉菌Aug0202的总DNA为模板，设计特异性的引物(引物RxLR101-P.i-F和引物RxLR101-P.i-R)，利用引物 RxLR101-P.i-F和引物RxLR101-P.i-RPCR扩增RxLR101-P.i基因，将反应的PCR产物用 1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳。

　　将目的条带切下放入1.5mL离心管中进行胶回收，将回收产物连接到pEASY-T3 载体上得到重组载体，将重组载体分别转化大肠杆菌DH5α，12-16h后，长出单克隆菌斑，挑单斑进行菌液PCR验证，将目的条带大小正确的菌液送去测序。测序回来，序列结果比对正确后，吸取菌液进行扩大培养。然后进行菌液的保存以及质粒的提取，得到连接pEASY-T3重组载体的cDNA质粒，将含有RxLR101的pEASY-T3重组质粒命名为pEASY-T3-RxLR101，将含有RxLR101-P.i的pEASY-T3重组质粒命名为 pEASY-T3-RxLR101-P.i，将含有RxLR101-P.p的pEASY-T3重组质粒命名为 pEASY-T3-RxLR101-P.p。

　　测序结果表明，RxLR101基因的核苷酸序列如序列4所示，编码氨基酸序列如序列3所示的RxLR101的氨基酸序列如序列3所示，其对应的编码基因的DNA序列如序列4所示，辣椒疫霉效应因子RxLR101的核苷酸序列全长990bp，编码区有一个329 个氨基酸的蛋白质，效应因子RxLR101的信号肽为序列3的1-15个氨基酸。序列3 的第16-329位为成熟蛋白质的氨基酸序列。

　　上述RxLR101基因、RxLR101-P.p基因与RxLR101-P.i基因的同源性分析如图1 所示。

　　根据RxLR101的二级结构(Baietal.,2012)对其进行了截短如图2所示，通过接种实验筛选出关键功能域，并对功能域进行重组，获得RxLR101的短截体RxLRnudix。辣椒疫霉重组基因RxLRnudix全长231bp，编码77个氨基酸。

　　4、RxLR101表达模式分析：分别提取辣椒疫霉标准菌株LT1534在辣椒中侵染的各个时期的cDNA为模板，未侵染的辣椒疫霉标准菌株LT1534菌丝体时期的cDNA为对照，PcActin为参比，检测RxLR101在1.5h、3h、6h、12h、24h、48h和72h的表达量，结果如图2所示，结果显示，RxLR101是在侵染早期上调表达，且在3h时表达量最高。

　　5、表达载体的构建

　　以pEASY-T3-RxLR101为模板，以pBIN-RxLR101-F-Kpnl、pBIN-RxLR101-R-XbaI 为引物，扩增RxLR101成熟基因，将扩增后的产物进行电泳，并回收，得到胶回收产物，对胶回收产物和pBIN-GFP2载体使用KpnI和XbaI内切酶进行酶切，然后用 SolutionI进行连接。得到含有RxLR101成熟基因的pBIN-GFP2重组载体，将其命名为pBIN-GFP2-RxLR101重组载体。pBIN-GFP2-RxLR101是将pBIN-GFP2的KpnI和 XbaI识别位点识别位点间的片段替换为RxLR101成熟基因(编码序列表中序列3中第16-329位氨基酸组成的成熟蛋白质)并保持pBIN-GFP2的其它序列不变得到的重组表达载体。

　　以pEASY-T3-RxLR101-P.i为模板，以pBIN-RxLR101-P.i-F-Kpnl、 pBIN-RxLR101-P.i-R-XbaI为引物，扩增RxLR101-P.i成熟基因，将扩增后的产物进行电泳，并回收，得到胶回收产物，对胶回收产物和pBIN-GFP2载体使用KpnI和XbaI 内切酶进行酶切，然后用SolutionI进行连接。得到含有RxLR101-P.i成熟基因的 pBIN-GFP2重组载体，将其命名为pBIN-GFP2-RxLR101-P.i重组载体。 pBIN-GFP2-RxLR101-P.i是将pBIN-GFP2的KpnI和XbaI识别位点识别位点间的片段替换为RxLR101-P.i成熟基因(编码图1中RxLR101-P.i的序列中第18-271位氨基酸组成的成熟蛋白质)并保持pBIN-GFP2的其它序列不变得到的重组表达载体。

　　以pEASY-T3-RxLR101-P.p为模板，以pBIN-RxLR101-P.p-F-Kpnl、 pBIN-RxLR101-P.p-R-XbaI为引物，扩增-RxLR101-P.p成熟基因，将扩增后的产物进行电泳，并回收，得到胶回收产物，对胶回收产物和pBIN-GFP2载体使用KpnI和XbaI 内切酶进行酶切，然后用SolutionI进行连接。得到含有RxLR101-P.p成熟基因的 pBIN-GFP2重组载体，将其命名为pBIN-GFP2-RxLR101-P.p重组载体。 pBIN-GFP2-RxLR101-P.p是将pBIN-GFP2的KpnI和XbaI识别位点识别位点间的片段替换为RxLR101-P.p成熟基因(图1中RxLR101-P.p序列中第18-359位氨基酸组成的成熟蛋白质)并保持pBIN-GFP2的其它序列不变得到的重组表达载体。

　　以pEASY-T3-RxLR101为模板，以pBIN-RxLR101-NLS-F-Kpnl、 pBIN-RxLR101-NLS-R-Kpnl为引物，扩增RxLR101成熟基因，将扩增后的产物进行电泳，并回收，得到胶回收产物，对胶回收产物和pBIN-GFP2载体使用KpnI和BamHI 内切酶进行酶切，然后用SolutionI进行连接。得到含有RxLR101NLS融合蛋白编码基因的pBIN-GFP2重组载体，将其命名为pBIN-GFP2-RxLR101-NLS重组载体。 pBIN-GFP2-RxLR101-NLS是将pBIN-GFP2的KpnI和BamHI识别位点识别位点间的片段替换为带有RxLR101-NLS成熟基因(编码序列表中序列7中第16-340位氨基酸组成的融合蛋白质)并保持pBIN-GFP2的其它序列不变得到的重组表达载体。

　　以pEASY-T3-RxLR101为模板，以pBIN-RxLR101NES-F-Kpnl、pBIN-RxLR101NES-R-Kpnl 为引物，扩增RxLR101成熟基因，将扩增后的产物进行电泳，并回收，得到胶回收产物，对胶回收产物和pBIN-GFP2载体使用KpnI和BamHI内切酶进行酶切，然后用 SolutionI进行连接。得到含有RxLR101NES融合蛋白编码基因的pBIN-GFP2重组载体，将重组载体命名为pBIN-GFP2-RxLR101NES。pBIN-GFP2-RxLR101NES是将pBIN-GFP2 的KpnI和BamHI识别位点识别位点间的片段替换为带有RxLR101NES成熟基因(编码序列表中序列11中第16-343位氨基酸组成的融合蛋白质)并保持pBIN-GFP2的其它序列不变得到的重组表达载体。

　　以RxLRnudix的DNA为模板，以pBIN-RxLRnudix-F-Kpnl、 pBIN-RxLRnudix-R-Kpnl为引物，扩增RxLRnudix成熟基因，将扩增后的产物进行电泳，并回收，得到胶回收产物，对胶回收产物和pBIN-GFP2载体使用KpnI和BamHI内切酶进行酶切，然后用SolutionI进行连接。得到含有RxLRnudix成熟蛋白编码基因的 pBIN-GFP2重组载体，将其命名为pBIN-GFP2-RxLRnudix重组载体。 pBIN-GFP2-RxLRnudix是将pBIN-GFP2的KpnI和BamHI识别位点识别位点间的片段替换为带有RxLRnudix成熟基因(编码序列表中序列1的氨基酸组成的融合蛋白质) 并保持pBIN-GFP2的其它序列不变得到的重组表达载体。

　　以RxLRnudix的DNA为模板，以pBIN-RxLRnudix-NLS-F-Kpnl、 pBIN-RxLRnudix-NLS-R-Kpnl为引物，扩增RxLRnudix成熟基因，将扩增后的产物进行电泳，并回收，得到胶回收产物，对胶回收产物和pBIN-GFP2载体使用Kpn I和BamH I内切酶进行酶切，然后用SolutionI进行连接。得到含有RxLRnudixNLS融合蛋白编码基因的pBIN-GFP2重组载体，将其命名为pBIN-GFP2-RxLRnudix-NLS重组载体。 pBIN-GFP2-RxLRnudix-NLS是将pBIN-GFP2的Kpn I和BamH I识别位点识别位点间的片段替换为带有RxLRnudix-NLS成熟基因(编码序列表中序列5中第1-88位氨基酸组成的融合蛋白质)并保持pBIN-GFP2的其它序列不变得到的重组表达载体。

　　以RxLRnudix的DNA为模板，以pBIN-RxLRnudixNES-F-Kpnl、 pBIN-RxLRnudixNES-R-Kpnl为引物，扩增RxLRnudix成熟基因，将扩增后的产物进行电泳，并回收，得到胶回收产物，对胶回收产物和pBIN-GFP2载体使用Kpn I和BamH I内切酶进行酶切，然后用SolutionI进行连接。得到含有RxLRnudixNES融合蛋白编码基因的pBIN-GFP2重组载体，将重组载体命名为pBIN-GFP2-RxLRnudixNES。 pBIN-GFP2-RxLRnudixNES是将pBIN-GFP2的Kpn I和BamHI识别位点识别位点间的片段替换为RnudixNES成熟基因(编码序列表中序列9中第1-91位氨基酸组成的融合蛋白质)并保持pBIN-GFP2的其它序列不变得到的重组表达载体。

　　6、农杆菌介导的辣椒疫霉RxLR效应分子瞬时表达

　　瞬时表达载体的构建

　　将制备好的重组载体pBIN-GFP2-RxLR101导入农杆菌GV3101感受态中，得到重组农杆菌，将其命名为农杆菌-RxLR101。

　　将制备好的重组载体pBIN-GFP2-RxLRnudix导入农杆菌GV3101感受态中，得到重组农杆菌，将其命名为农杆菌-RxLRnudix。

　　将制备好的重组载体pBIN-GFP2-RxLR101-P.i导入农杆菌GV3101感受态中，得到重组农杆菌，将其命名为农杆菌-RxLR101-P.i。

　　将制备好的重组载体pBIN-GFP2-RxLR101-P.p导入农杆菌GV3101感受态中，得到重组农杆菌，将其命名为农杆菌-RxLR101-P.p。

　　将制备好的重组载体pBIN-GFP2-RxLR101NLS导入农杆菌GV3101感受态中，得到重组农杆菌，将其命名为农杆菌-RxLR101NLS。

　　将制备好的重组载体pBIN-GFP2-RxLR8-2导入农杆菌GV3101感受态中，得到重组农杆菌，将其命名为农杆菌-RxLR101NES。

　　将制备好的重组载体pBIN-GFP2-RxLRnudix-NLS导入农杆菌GV3101感受态中，得到重组农杆菌，将其命名为农杆菌-RxLRnudix-NLS。

　　将制备好的重组载pBIN-GFP2-RxLRnudixNES导入农杆菌GV3101感受态中，得到重组农杆菌，将其命名为农杆菌-RxLRnudixNES。

　　7、效应基因的WesternBlot检测：分别将含有空载体pBIN-GFP2的农杆菌、上述制备的农杆菌(农杆菌-RxLR101、农杆菌-RxLRnudix、农杆菌-RxLR101-P.i、农杆菌 -RxLR101-P.p、农杆菌-RxLR101NLS、农杆菌-RxLR101NES、农杆菌-RxLRnudix-NLS和农杆菌-RxLRnudixNES)注射本氏烟和辣椒叶片，瞬时表达效应基因与以pBIN-GFP2的融合蛋白，得到接种农杆菌的本氏烟和辣椒叶片。提取叶片的蛋白，进行Western Blot 检测实验，利用一抗：pBIN-GFP2，二抗：羊抗鼠-HRP进行检测，内参选用Action 基因。若Western blot结果显示，在PVDF膜上，能检测到跟RxLR101、RxLRnudix、 RxLR101-P.i、RxLR101-P.p、RxLR101NLS、RxLR101NES、RxLRnudix-NLS和RxLRnudixNES 预测蛋白大小差不多的目的条带，则说明这几个效应因子均能在辣椒本氏烟中正确表达。

　　实施例2

　　1.对本氏烟叶片细胞坏死的影响

　　以空载GFP、INF1、MgCl2等作对照，在本氏烟上瞬时表达RxLRnudix、RxLR101-P.i和RxLR101-P.p进行观察分析。将含有空载体pBIN-GFP2的农杆菌以及实施例1中的农杆菌-RxLRnudix、农杆菌-RxLR101-P.i和农杆菌-RxLR101-P.p接种至本氏烟叶片上，之后将合格的本氏烟叶片进行拍照记录，并用台盼蓝染色液进行染色，用水合氯醛和酒精进行脱色处理。结果如图3所示，图3a为应因子RxLRnudix瞬时表达后的叶片症状，A代表RxLR101，B代表RxLRnudix，C代表buffer缓冲液；D代表空载体 pBIN-GFP2，E代表INF1。图3b为应因子RxLR101-P.i瞬时表达后的叶片症状，A 代表空载pBIN-GFP2；B代表RxLR101-P.i、RxLR101-P.p；C代表buffer缓冲液；D 代表INF1；图3c为应因子RxLR101-P.p瞬时表达后的叶片症状，A代表空载 pBIN-GFP2；B代表RxLR101-P.p；C代表buffer缓冲液；D代表INF1。接种结果显示，与对照相比，RxLR101-P.p接种48h后，产生接种位点皱缩、退绿的现象，7d后接种位点产生明显的细胞死亡；RxLR101-P.i接种7d后没有明显的表征，不能引起本氏烟的细胞死亡。

　　2.辣椒疫霉RxLR效应分子抑制Bax诱导的细胞死亡

　　以pBIN-GFP2、INF1、MgCl2和RxLR101等作对照，在本氏烟上瞬时表达RxLRnudix、RxLR101-P.i和RxLR101-P.p进行观察分析。将含有空载体pBIN-GFP2的农杆菌以及实施例1中的农杆菌-RxLRnudix、农杆菌-RxLR101-P.i和农杆菌-RxLR101-P.p接种至本氏烟叶片上，瞬时表达RxLRnudix24小时候，接种坏死基因Bax，对RxLRnudix的抑制功能进行验证，之后将合格的本氏烟叶片进行拍照记录，并用台盼蓝染色液进行染色，用水合氯醛和酒精进行脱色处理，结果如图4所示。图4a中，A代表RxLR101，B分别代表RxLR101-P.p，RxLR101-P.i，C代表buffer缓冲液，D代表空载体pBIN-GFP2。右图为台盼蓝染色结果。图4b图为RxLRnudix抑制性分析，A代表RxLR101，B代表RxLRnudix，C代表buffer缓冲液；D代表空载体pBIN-GFP2，E代表INF1。右图为台盼蓝染色结果。

　　如图所示，RxLRnudix不能够在烟草上引发细胞坏死，且瞬时表达RxLRnudix24h后，接种Bax发现，RxLRnudix依然能够抑制Bax诱导的PCD。

　　实施例3调控植物的辣椒疫霉侵染能力

　　侵染烟草叶片实验：

　　按照步骤2中方法制备接种含有空载体pBIN-GFP2的农杆菌(对照)、农杆菌 -RxLR101和农杆菌-RxLRnudix的本氏烟叶片，瞬时表达24h后接种游动孢子，3d后观察疫霉的致病性是否受到了影响，结果如图5所示。用qRT-PCR检测不同时期的表达量。qRT-PCR结果如图6所示。

　　以pBIN-GFP2与RxLR101为对照，在烟草上对RxLRnudix进行验证，实验结果表明，RxLRnudix可以抑制辣椒疫霉在烟草上的侵染。qPCR检测结果表明此实施例中RxLR101和-RxLRnudix均能正常表达。

　　实施例4

　　1.融合蛋白RxLR101-NES、RxLR101-NLS、RxLRnudix-NES、RxLRnudix-NLS 抑制性分析

　　以pBIN-GFP2、INF1、MgCl2等作对照，在辣椒叶片上瞬时表达RxLR101-NES、RxLR101-NLS、RxLRnudix-NES、RxLRnudix-NLS这4个效应因子，瞬时表达24小时后，接种农杆菌Bax，进行观察分析。结果如图7所示，图7中A分别代表 RxLR101-NES，RxLRnudix-NES，B分别代表RxLR101-NLS，RxLRnudix-NLS，C RxLR101，D空载pBIN-GFP2，E代表RxLRnudix，F代表buffer。右图为台盼蓝染色结果。从图7可以看出，瞬时表达Bax7d后，RxLR101-NES及RxLRnudix-NES依然能够抑制Bax诱导的PCD，而RxLR101-NLS与RxLRnudix-NLS均不能再抑制Bax 诱导的PCD。证明了RxLR101、RxLRnudix抑制Bax诱导的PCD是在细胞质中起作用的，如果将RxLR101、RxLRnudix输入到细胞核中，则不会再抑制Bax诱导的PCD，从而使Bax正常行使功能。

　　实施例5

　　RxLR101-NES、RxLR101-NLS、RxLRnudix-NES、RxLRnudix-NLS的对辣椒疫霉致病性的影响

　　以pBIN-GFP2、INF1、MgCl2等作对照，在辣椒叶片上瞬时表达RxLR101-NES、RxLR101-NLS、RxLRnudix-NES、RxLRnudix-NLS这4个效应因子，瞬时表达24小时后(瞬时表达的方法与实施例1-4中通过农杆菌的方法相同，此处不再赘述)，将诱导制备的辣椒疫霉SD33菌株的游动孢子悬浮液滴于同一接种的叶片中央(每个叶片的游动孢子量要一致)，然后放到25℃培养箱中黑暗处理，72h后，将本氏烟叶片取出，先在紫外灯下进行拍照，然后在白光灯下拍照，最后用台盼蓝染液进行染色，染色结果如图8和图10所示。

　　用qRT-PCR检测不同时期的表达量。qRT-PCR结果如图9和图11所示。

　　实验结果如图所示，以pBIN-GFP2、INF1、MgCl2等作对照，RxLR101-NES、RxLRnudix-NES几乎不能够再抑制辣椒疫霉游动孢子的侵染，与阳性对照RxLR101 及RxLRnudix相比，RxLR101-NLS与RxLRnudix-NLS能够更加强烈的抑制辣椒疫霉游动孢子的侵染。由此可知，RxLR101及RxLRnudix抑制辣椒疫霉游动孢子侵染的功能是在细胞核中行使的，细胞质则不能对辣椒疫霉的致病性产生影响。

　　序列表

　　<110> 山东农业大学

　　<120> 一种抑制Bax引起的植物叶片坏死的相关蛋白及其应用

　　<160> 12

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 77

　　<212> PRT

　　<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

　　<400> 1

　　Gln Leu Ile Ala Ala Asn Ala Asp Arg Thr Gly Ile Ala Ala Val Asp

　　1 5 1015

　　Ser Asn Thr Ala Leu Leu Pro Arg Val Leu Gly Val Glu Ser Lys Arg

　　202530

　　Thr Leu Arg Arg Tyr Asp Pro Ser Glu Phe Asp Ser Glu Glu Ala Val

　　354045

　　Asp Ser Asp Glu Glu Ala Gly Gly Trp Asp His Gly Glu Thr Ile Glu

　　505560

　　Lys Ala Val Leu Arg Glu Val Ile Glu Glu Gly Gly Val

　　657075

　　<210> 2

　　<211> 231

　　<212> DNA

　　<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

　　<400> 2

　　caattgatcg ccgccaacgc ggaccgaacc ggcattgcgg ctgtcgattc gaacactgcg 60

　　ctccttcctc gcgtgctagg agtcgaatcc aagcgtactc tgcgtcggta tgaccccagt 120

　　gagtttgatt cagaagaagc ggtcgattca gatgaggagg ccgggggctg ggatcatgga 180

　　gaaaccattg agaaggcagt tttgcgtgag gttattgaag aaggaggggt c 231

　　<210> 3

　　<211> 329

　　<212> PRT

　　<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

　　<400> 3

　　Met Arg Val Leu Ser Leu Val Thr Leu Leu Ala Phe Val Ser Ala Gln

　　1 5 1015

　　Leu Ile Ala Ala Asn Ala Asp Arg Thr Gly Ile Ala Ala Val Asp Ser

　　202530

　　Asn Thr Ala Leu Leu Pro Arg Val Leu Gly Val Glu Ser Lys Arg Thr

　　354045

　　Leu Arg Arg Tyr Asp Pro Ser Glu Phe Asp Ser Glu Glu Ala Val Asp

　　505560

　　Ser Asp Glu Glu Ala Asp Pro Val Glu Val Ala Asp Ser Asp Glu Glu

　　65707580

　　Val Val Ser Glu Gly Glu Glu Arg Val Gly Ile Pro Gly Met Glu Lys

　　859095

　　Val Ala Ser Lys Ala Thr Lys Ala Asp Asp Met Val Pro Asn Ala Ala

　　100 105 110

　　Lys Gly Ala Met Lys Trp Lys Ile Leu Val Gln Lys Asn Met Gly Gln

　　115 120 125

　　Leu Ala Glu Thr Ala Lys Leu Val Lys Lys Leu Lys Val Gly Ser Phe

　　130 135 140

　　Tyr Ser Asn Val Glu Leu Glu Lys Met Ser Leu Ser Ala Leu Arg Gln

　　145 150 155 160

　　Leu Asp Asp Ile Gln Gln Leu Gln Lys Ala Asp Ile Lys Ser Asn Val

　　165 170 175

　　Phe Gly Thr Lys Ala Thr Ala Asn Gly Met Arg Arg Lys Met Thr Arg

　　180 185 190

　　Thr Glu Asn Met Lys Leu Pro Pro Glu Gln Phe Leu Val Ser His Val

　　195 200 205

　　Gly Arg Gly Ala Gln Arg Leu Gly Glu Asn Gly Gln Arg Leu Leu Ser

　　210 215 220

　　Ala Ala Val Ile Ser Lys Gly Asp Asp Ile Asn Ser Lys Val Leu Leu

　　225 230 235 240

　　Ile Ser Ser Ser Asp Thr Lys Lys Gly Asp Phe Leu Leu Pro Lys Gly

　　245 250 255

　　Gly Trp Asp His Gly Glu Thr Ile Glu Lys Ala Val Leu Arg Glu Val

　　260 265 270

　　Ile Glu Glu Gly Gly Val Asn Gly Gln Leu Leu His Lys Leu Gly Glu

　　275 280 285

　　Tyr Pro Phe Lys Lys Gly Ala Thr Ala Tyr Ala Tyr Met Met Lys Ala

　　290 295 300

　　Ser Thr Val Tyr Asp Asp Trp Ala Glu Ser Ile Arg Tyr Arg Ile Trp

　　305 310 315 320

　　Val Arg Thr Glu Met Leu Trp Lys Tyr

　　325

　　<210> 4

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　　<212> DNA

　　<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

　　<400> 4

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　　<210> 5

　　<211> 88

　　<212> PRT

　　<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

　　<400> 5

　　Gln Leu Ile Ala Ala Asn Ala Asp Arg Thr Gly Ile Ala Ala Val Asp

　　1 5 1015

　　Ser Asn Thr Ala Leu Leu Pro Arg Val Leu Gly Val Glu Ser Lys Arg

　　202530

　　Thr Leu Arg Arg Tyr Asp Pro Ser Glu Phe Asp Ser Glu Glu Ala Val

　　354045

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　　65707580

　　Leu Ser Phe Leu Leu Arg Ser Ser

　　<210> 6

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　　<212> DNA

　　<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

　　<400> 6

　　caattgatcg ccgccaacgc ggaccgaacc ggcattgcgg ctgtcgattc gaacactgcg 60

　　ctccttcctc gcgtgctagg agtcgaatcc aagcgtactc tgcgtcggta tgaccccagt 120

　　gagtttgatt cagaagaagc ggtcgattca gatgaggagg ccgggggctg ggatcatgga 180

　　gaaaccattg agaaggcagt tttgcgtgag gttattgaag aaggaggggt ctcactttac 240

　　ctttcgtttc ttcttcggag ctcc 264

　　<210> 7

　　<211> 340

　　<212> PRT

　　<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

　　<400> 7

　　Met Arg Val Leu Ser Leu Val Thr Leu Leu Ala Phe Val Ser Ala Gln

　　1 5 1015

　　Leu Ile Ala Ala Asn Ala Asp Arg Thr Gly Ile Ala Ala Val Asp Ser

　　202530

　　Asn Thr Ala Leu Leu Pro Arg Val Leu Gly Val Glu Ser Lys Arg Thr

　　354045

　　Leu Arg Arg Tyr Asp Pro Ser Glu Phe Asp Ser Glu Glu Ala Val Asp

　　505560

　　Ser Asp Glu Glu Ala Asp Pro Val Glu Val Ala Asp Ser Asp Glu Glu

　　65707580

　　Val Val Ser Glu Gly Glu Glu Arg Val Gly Ile Pro Gly Met Glu Lys

　　859095

　　Val Ala Ser Lys Ala Thr Lys Ala Asp Asp Met Val Pro Asn Ala Ala

　　100 105 110

　　Lys Gly Ala Met Lys Trp Lys Ile Leu Val Gln Lys Asn Met Gly Gln

　　115 120 125

　　Leu Ala Glu Thr Ala Lys Leu Val Lys Lys Leu Lys Val Gly Ser Phe

　　130 135 140

　　Tyr Ser Asn Val Glu Leu Glu Lys Met Ser Leu Ser Ala Leu Arg Gln

　　145 150 155 160

　　Leu Asp Asp Ile Gln Gln Leu Gln Lys Ala Asp Ile Lys Ser Asn Val

　　165 170 175

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　　195 200 205

　　Gly Arg Gly Ala Gln Arg Leu Gly Glu Asn Gly Gln Arg Leu Leu Ser

　　210 215 220

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　　260 265 270

　　Ile Glu Glu Gly Gly Val Asn Gly Gln Leu Leu His Lys Leu Gly Glu

　　275 280 285

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　　<210> 8

　　<211> 1020

　　<212> DNA

　　<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

　　<400> 8