RORCE2基因作为药物靶点在制备Th17细胞相关疾病药物中的应用
技术领域
本发明属于医药生物分子技术领域，涉及RORCE2基因作为药物靶点在制备Th17细胞相关疾病药物中的应用。
背景技术
适应性免疫应答在维持机体免疫自稳和清除病原体等异物等过程中至关重要，它的失调将导致多种自身免疫性或慢性炎症性疾病的发生。实验性自身免疫性脑炎(Experimental autoimmune encephalitis，EAE)和胶原诱导关节炎(Collagen inducedarthritis，CIA)就是两种因为适应性免疫应答失调导致的小鼠自身免疫病的经典模型。以往认为Th l细胞功能失调是引起这两种自身免疫病的主要原因，但是，研究表明IFN-γ缺陷鼠或IFN-γR缺陷鼠无IFN-γ信号，仍可发生自身免疫病，甚至对自身免疫病更易感，这说明除产生IFN-γ的Th1细胞外，还有另一种(些)Th细胞亚群参与诱导自身免疫病。后来实验证实了体内确实存在一群CD4+T细胞有此功能，这类效应CD4+T细胞分泌的细胞因子以IL-17为主，即被命名为Thl7细胞。它代表一类不同于Th1或Th2的CD4+Th细胞亚群，具有很强的促炎症作用，并与多种自身免疫病的发生和发展有关。因此我们对于Th17细胞的研究将对于人类多种疾病发病机制的阐明及其防治措施的建立起着极其重大的意义。
Th17细胞可以产生多种细胞因子，其中最主要的是IL-17，此外还有IL-22、GM-CSF、IL-6和TNF等。IL-17是一种具有促炎作用的细胞因子，其家族包括6个成员(IL-17A-F)，通常所指的IL-17即IL-17A。当IL-17与其受体IL-17R结合并被激活时，导致趋化因子、集落刺激因子和粘附分子的表达或释放，招募和激活炎症细胞尤其是嗜中性粒细胞，从而介导炎症，影响感染、肿瘤和自身免疫的病理过程。许多炎症性疾病，如类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、哮喘及同种排斥反应患者血清和病变组织中均能检测到IL-17。除此以外，IL-17还参与中性粒细胞的增殖、成熟和趋化，对T细胞的活化起协同刺激作用，并能促进树突状细胞的成熟。同时，Th17细胞产生的另一细胞因子IL-22也参与了Th17细胞的效应功能，其与IL-17协同作用，可以增强炎症反应并造成组织损伤。IL-17与IL-22共同表达被认为是自身攻击性(autoaggressive)T细胞和促炎症T细胞的标志。以上研究结果提示，Th17细胞在多种疾病的发病过程中具有重要作用。
目前研究发现，RORγt(retinoid-related orphan receptor gamma T)是Th 17细胞分化的关键转录因子，其表达依赖于IL-6和TGF-β。RORγt基因在人类基因组中位于1号染色体，在小鼠中位于3号染色体，其编码蛋白为一种DNA结合型转录因子。RORγt在Th17细胞分化中起着非常重要的作用，其可以作为染色体重塑因子(chromatin remodelingfactor)开放IL-17基因座，并使其它因子直接结合到IL-17启动子上。进一步研究发现，在体外，RORγt基因敲除的CD4+T细胞IL-17的表达量急剧减少；而通过基因转染使RORγt过表达的CD4+T细胞不需要外来细胞因子即可表达IL-17。RORγt基因缺陷小鼠Thl7细胞缺陷，小鼠易于感染，EAE发病时间延迟，病情减轻。由此可以看出，RORγt在Th17细胞的增殖、分化和发育中扮演着非常重要的作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种以RORCE2基因作为药物靶点在制备Th17细胞相关疾病药物中的应用，还提供RORCE2基因作为靶点在制备小鼠模型中的应用，以及小鼠模型构建的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、RORCE2基因作为药物靶点在制备Th17细胞相关疾病药物中的应用，所述RORCE2基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述Th17细胞相关疾病为Th17细胞过度激活导致的炎症性疾病。
进一步，所述Th17细胞相关疾病为实验性自身免疫性脑炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、哮喘。
进一步，所述药物能预防、抵抗或者治疗Th17细胞相关疾病。
2、RORCE2基因作为药物靶点在制备Th17细胞相关疾病药物中的应用，所述药物以RORCE2基因为靶点，抑制或者调控RORγt基因表达。
所述RORCE2基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
敲除或者抑制RORCE2的作用可明显降低Th17细胞的频率，RORCE2基因可以作为靶点应用在Th17细胞过度激活导致的炎症性疾病，如实验性自身免疫性脑炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、哮喘。
3.RORCE2基因作为靶点在制备小鼠模型中的应用，所述RORCE2基因的序列如SEQID NO.3所示。
进一步，所述应用为敲除小鼠RORCE2基因，并对繁殖的子代小鼠进行基因型鉴定，最终得到稳定的纯合系RORCE2基因敲除小鼠。
4.一种小鼠模型，敲除小鼠RORCE2基因，并对繁殖的子代小鼠进行基因型鉴定，最终得到稳定的纯合系RORCE2基因敲除小鼠，所述RORCE2基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述小鼠模型的小鼠脾脏
5.一种小鼠模型的构建方法，敲除小鼠RORCE2基因，并对繁殖的子代小鼠进行基因型鉴定，最终得到稳定的纯合系RORCE2基因敲除小鼠，所述RORCE2基因的序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明的有益效果在于：本发明从多角度发现并证明了序列RORCE2对RORγt启动子活性有显著地增强作用，在敲除RORCE2或者抑制RORCE2的作用时，脾CD4+T淋巴细胞中RORγt和IL-17A mRNA的相对表达量都显著降低；且Th17细胞的频率和Th17细胞中RORγt的平均荧光强度明显低于WT小鼠；但并不影响Th1、Th2细胞的分化，也不影响IFN-γ从Th1细胞的分泌、IL-4从Th2细胞的分泌。还进一步发现并证明Sox5可介导RORCE2上3号检测位点(test site 3，TS3)和RORγt启动子之间的相互作用。这对于Th17细胞相关疾病的临床预防和治疗又增加了一个可靠的新的靶点，在预防或治疗上提供新的药物制备方向。本发明提供的RORCE2基因敲除的小鼠模型构建方法得到的小鼠模型，其脾CD4+T淋巴细胞中RORγt和IL-17A mRNA的相对表达量都显著降低；且Th17细胞的频率和Th17细胞中RORγt的平均荧光强度明显低于WT小鼠；但并不影响Th1、Th2细胞的分化，也不影响IFN-γ从Th1细胞的分泌、IL-4从Th2细胞的分泌。更进一步在RORCE2-KO小鼠与对照的WT小鼠建立EAE疾病模型中显示RORCE2-KO小鼠发病时间更晚，疾病程度更轻，临床评分更低，HE和LFB染色显示RORCE2-KO小鼠脊髓的白质区中浸润的单核细胞更少，脱髓鞘现象更轻。通过FCM的方法验证，与WT小鼠相比，RORCE2-KO小鼠脊髓浸润的淋巴细胞中，Th17细胞的频率明显降低，而Th1和Th2细胞的频率无明显变化。以上结果表明RORCE2的敲除降低了小鼠脊髓中致炎性Th17淋巴细胞的频率，从而抑制了EAE疾病的发展程度。充分说明由此方法建立的小鼠模型可以作为研究Th17分化或RORγt、IL-17A表达紊乱引起的相关疾病的动物模型，也可以作为研究以上疾病的药物的动物模型。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为小鼠的Th17、Th1和ILC细胞(固有淋巴细胞，innate lymphoid cells)H3K4me2的ChIP-seq数据比对分析，以及RORCE1、RORCE2、RORCE3和不同的组合片段的体外双荧光素酶报告实验。
图2为人的Th17和Th0(即为
图3为RORCE1、RORCE2和RORCE3具体的位置信息，以及用于ChIP-qPCR实验的引物位置。
图4为流式分选的高纯度CD4+GFP+Th17细胞及对照细胞。
图5为ChIP-qPCR证实在Th17细胞中RORCE2相对于其他两个区域发生了更强的与增强子活化密切相关的组蛋白修饰(H3K4me1、H3K27ac和H3ac)。
图6 RORCE2基因敲除小鼠(RORCE2-KO)示意图及鉴定结果。
图7 RT-QPCR检测RORCE2-KO和对照野生型小鼠中RORγt以及IL-17A mRNA的表达。
图8流式细胞技术检测RORCE2-KO和对照野生型小鼠脾脏中Th17细胞的频率和RORγt平均荧光强度。
图9 RT-QPCR和流式细胞技术检测RORCE2-KO和对照野生型小鼠小肠中ILC3细胞频率以及RORγt基因的表达。
图10 RORCE2-KO和对照野生型小鼠中Th1和Th2细胞的频率及其谱系特异基因的表达。
图11 RORCE2-KO和对照野生型小鼠脾脏中
图12 RORCE2-KO和对照野生型小鼠脾脏中
图13 RORCE2-KO和对照野生型小鼠脾脏中
图14 RORCE2-KO和对照野生型小鼠在EAE疾病模型中的临床评分和HE、LFB染色。
图15在EAE疾病模型中RORCE2-KO和对照野生型小鼠脊髓中浸润的Th17、Th1和Th2的细胞频率对比。
图16 3C-qPCR实验引物设计及其位置信息，以及在EL4和小鼠脾脏分选的Th17细胞的3C-qPCR实验结果。
图17 RORCE2-KO和对照野生型小鼠脾脏中
图18转录因子Sox5的结合位点信息和ChIP实验结果，以及EL4和体外分化的Th17细胞的ChIP-loop实验结果。
图19构建的RORCE上转录因子Sox5结合位点缺失的小鼠(sox5-BS-deficient，sox5-BS-/-)示意图及ChIP、3C-qPCR和ChIP-loop实验结果。
图20 Th17细胞及EL4细胞中Sox5的表达。
图21 Sox5-BS-/-和对照野生型小鼠的各种实验结果对比部分图。
图22 Sox5-BS-/-和对照野生型小鼠的各种实验结果对比部分图。
图23在EAE疾病模型中Sox5-BS-/-和对照野生型小鼠的各种实验结果对比。
图24转录因子STAT3的结合位点信息，以及STAT3的ChIP-qPCR和双荧光素酶报告实验结果。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
图1为小鼠的Th17、Th1和ILC细胞(固有淋巴细胞，innate lymphoid cells)H3K4me2的ChIP-seq数据比对分析，以及RORCE1、RORCE2、RORCE3和不同的组合片段的体外双荧光素酶报告实验。
对小鼠Th17、Th1和ILC细胞H3K4me2的ChIP-seq数据进行分析，在RORγt基因上游发现一段Th17细胞特异性的高富集H3K4me2修饰的区域，该序列长约3.4kb，其可能是调控RORγt基因表达的潜在增强子序列，将其命名为RORCE(图1中A的方框所示)，全长序列如SEQ ID NO.1所示；进一步利用Roadmap Epigenomics Project数据库，发现相对于对照组Th0(即为
后续实验中发现这个区域是由三个连续的H3K4me2 peak组成，根据这些特征，将其分为三个连续的片段，即RORCE1、RORCE2以及RORCE3，如图3所示，图3为RORCE1、RORCE2和RORCE3具体的位置信息，以及用于ChIP-qPCR实验的引物位置，其中RORCE1序列如SEQ IDNO.2所示；RORCE2序列如SEQ ID NO.3所示；RORCE3序列如SEQ ID NO.4所示。利用IL17-IRES-EGFP小鼠，流式细胞荧光分选技术(Fluorescence-activated cell sorting，FACS)分选出高纯度的CD4+GFP+Th17细胞(96.3％)及对照细胞(97.7％)用于后续实验(如图4所示)；用ChIP-qPCR证实Th17细胞中RORCE2相对于其他两个区域发生了更强的与增强子活化密切相关的组蛋白修饰(H3K4me1、H3K27ac和H3ac)，分别如图5中A、B和C所示。
将RORCE1、RORCE2、RORCE3以及这三个片段不同的组合克隆至含有RORγt启动子的pGL3报告质粒中(如图1中B所示)，在EL4(小鼠淋巴瘤细胞)和293T(人胚肾细胞)中利用双荧光素酶实验表明RORCE2对RORγt启动子活性有显著地增强作用(如图1中C和D所示)。
实施例2
通过北京百奥赛图公司基于CRISPR/Cas9技术制备RORCE2敲除的模式小鼠，并对繁殖的子代小鼠进行基因型鉴定，最终得到RORCE2敲除的纯合小鼠(标记为RORCE2-KO)，如图6所示。本文中所述
通过RT-qPCR实验证实，与WT(野生型)小鼠脾脏
而在同样对比，Th1和Th2细胞的频率及其谱系特异基因(Tbx21、GATA3、IFN-γ、IL-4)的表达在RORCE2-KO和WT小鼠中并无明显变化，其结果如图10所示。
体外诱导分化模型中(见R&D公司CellXVivo Mouse Th17 Cell DifferentiationKit:CDK017)，利用FCM的方法进一步验证发现可改为RORCE2敲除对于CD4+T细胞分化的影响，结果如图11-图13所示。图11为RORCE2-KO和对照野生型小鼠脾脏中
以上均表明RORCE2通过调节RORγt基因的表达，进一步影响Th17细胞的分化，敲除或者抑制RORCE2的作用可明显降低Th17细胞的频率。RORCE2基因可以作为靶点应用在Th17细胞相关的多种炎症性疾病，如实验性自身免疫性脑炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、哮喘等。还可以敲除小鼠RORCE2基因构建的小鼠模型，其脾CD4+T淋巴细胞中RORγt和IL-17A mRNA的相对表达量都显著降低；且Th17细胞的频率和Th17细胞中RORγt的平均荧光强度明显低于WT小鼠；但并不影响Th1、Th2细胞的分化，也不影响IFN-γ从Th1细胞的分泌、IL-4从Th2细胞的分泌。可以作为研究Th17分化或RORγt、IL-17A表达紊乱引起的相关疾病的动物模型，也可以作为研究以上疾病的药物的动物模型。
实施例3
实验性变态反应性脑炎(EAE)是一种以特异性致敏的CD4+T细胞介导为主的，以中枢神经系统内小血管周围出现单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病，是人类多发性硬化(MS)的理想动物模型，在临床神经免疫学的研究中具有重要意义。
利用实施例2制备的RORCE2-KO小鼠与对照的WT小鼠建立EAE疾病模型，图14为RORCE2-KO和对照野生型小鼠在EAE疾病模型中的临床评分和HE、LFB染色。图15在EAE疾病模型中RORCE2-KO和对照野生型小鼠脊髓浸润的Th17、Th1和Th2的细胞频率对比。其中图14A结果表明RORCE2-KO小鼠发病时间更晚，疾病程度更轻，临床评分更低；图14B通过HE和LFB染色发现RORCE2-KO小鼠脊髓的白质区中浸润的单核细胞更少，脱髓鞘现象更轻；图15通过FCM的方法验证，与WT小鼠相比，RORCE2-KO小鼠脊髓浸润的淋巴细胞中，Th17细胞的频率明显降低，而Th1和Th2细胞的频率无明显变化。以上结果表明RORCE2的敲除降低了小鼠脊髓中致炎性Th17淋巴细胞的频率，从而抑制了EAE疾病的发展程度。
实施例4
图16和图17为RORCE序列中8个限制性内切酶Nla III的酶切位点与RORγt启动子之间的相互作用的各种检测结果。
通过对RORCE序列研究发现RORCE序列中存在8个限制性内切酶Nla III的酶切位点，依次为test site 1(TS1)-test site 8(TS8)，根据这一特点我们设计相应的引物，通过3C-qPCR对这8个位点与RORγt启动子之间的相互作用进行检测，如图16中A所示。图16中B结果证明：在表达RORγt的小鼠淋巴细胞株EL4中，RORCE2中TS3相比于其他位点而言，可以与RORγt启动子存在很强的相互作用。
在FACS分选的高纯度Th17细胞中，TS3与RORγt基因启动子发生更强的相互作用，而对照细胞中无这种现象，图16中C所示。
如图17所示，在Th17的体外诱导模型中，WT小鼠来源的诱导型Th17，TS3与RORγt基因启动子发生相互作用，而
实施例5
图18和图19为证实Sox5介导了TS3和RORγt启动子之间的相互作用的各种实验结果。
通过生物信息学预测RORCE上可能结合的转录因子，并综合转录因子结合位点的位置信息(必须在TS3上游且距离较近)、相对评分以及文献提示，选择了Sox5为研究的候选目标(图18中A和B所示)，其结合位点(Sox5-Bing site，Sox5-BS)位于TS3上游约50bp。在EL4以及体外分化的Th17细胞中，首先检测了Sox5的表达，表达结果如图20所示；然后通过ChIP-qPCR证实Sox5高富集在Sox5-BS与以及RORγt启动子区域(图18中C和D所示)。
通过ChIP-loop实验证实(主要检测了TS3)，无论是EL4还是体外分化的Th17细胞中，Sox5都介导了TS3和RORγt启动子之间的相互作用(图18中E和F所示)；而在体外分化的Th1和Th2细胞中未发现这种相互作用(附图19中A和B所示)。
综合以上结果，可以判断转录因子Sox5在RORCE2的TS3和RORγt启动子之间的相互作用中起到了关键的作用，为了进一步了解其中的机制，基于CRISPR/Cas9技术构建了RORCE上转录因子Sox5结合位点缺失的小鼠(sox5-BS-deficient，sox5-BS-/-)(图19中C所示)。利用ChIP-qPCR发现在体外分化的Th17细胞中，Sox5-BS的缺失导致Sox5在Sox5-BS上的富集显著降低(图19中D所示)；
3C-qPCR和ChIP-loop的结果显示Sox5-BS的缺失严重破坏了TS3和RORγt启动子之间的相互作用(图19中E和F所示)。
RT-qPCR结果表明Sox5-BS-/-与WT小鼠相比，Sox5-BS-/-的CD4+T细胞中RORγt和IL-17A mRNA的相对表达量都显著降低(附图21中A和C所示)，利用FCM的方法进一步验证，Sox5-BS-/-小鼠脾CD4+T淋巴细胞中Th17细胞的频率和平均荧光强度明显低于WT小鼠(附图21中B和D所示)。Th17的体外诱导模型中，利用FCM的方法进一步验证，Sox5-BS-/-小鼠脾脏
实施例6Sox5结合位点的缺失抑制了EAE疾病的发展
进一步在Sox5-BS-/-和WT小鼠上构建了EAE的疾病模型，如图23所示，Sox5-BS-/-对EAE的影响与RORCE2-KO类似。
发现在RORCE上Sox5-BS下游的临近位置存在转录因子STAT3的结合位点(STAT3binding site，STAT3-BS)(附图24中A所示)，在EL4和体外分化的Th17细胞中，ChIP-qPCR结果显示该结合位点存在转录因子STAT3的富集(附图24中B、C所示)，而当Sox5结合位点缺失后，这种富集显著下降(附图24中C所示)，此外利用pGL3报告系统，发现RORCE2缺失了STAT3-BS，RORCE2增强活性明显下降(附图24中D所示)。
本发明证实了RORCE2是RORγt基因的增强子，并且缺失RORCE2或者抑制RORCE2可以减少或降低RORγt基因的表达以及Th17分化。并且Sox5和STAT3可以共同介导RORCE2增强子的活性，从而也减少或降低RORγt基因的表达以及Th17分化。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> RORCE2基因作为药物靶点在制备Th17细胞相关疾病药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3404
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcagtcttcc acatcaagta attgcaatca agagaatccc ccactgacat acccacaggc 60
caacatgatc tagacttttc tcttcccaag agattctaga ctgtgtcaag ttgacaatta 120
aaactaacca tcacaggtcc ctcgagtcta acaaaaccct gcgctttcag agagcccttg 180
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<210> 2
<211> 1207
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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acagtggaat aaaagtgggt catcttgtgt ttacctccta cctgaaagcc cttgacgtca 780
gcagtgacct tctctctgcc tcttccttcc tgggaacttg ttcctcctgc cagacttgga 840
agagggatag agaaaggcag gtacacagca ggccctagac cacttcctcc ttcctcttag 900
cctttctcac ttcccatggt gccaattgtc cccgtatagg acctgcttct tcttaacaaa 960
aatctcagca ggggcagcta cacatacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 1020
cacacacaca cacaagtcac ccttctcaag ctccttctac ctccactagg ttcccaccac 1080
caatccccag gccaaagaaa ccttgctcca gttgtccacc agatggcagc attgaccaaa 1140
caatcctccg tgctgacagc aacctgatca atgggtagga tggacagctt caaacattag 1200
ttcctcc 1207
<210> 3
<211> 1163
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggcaactgc ctctaaggtg agtgtacagt tgttattcaa catgaccttc gcccttagac 60
agataataaa gaagaaaact aggtgacatg actcaaggta cttgtcacga agtctgacag 120
tcttgagttt aatcctagag atccacttgg tggaaggaga ccaatacaca catataatgt 180
aacttctaaa atctgtatta aaagcctgaa gggtttcttc ttcccgggat aatagctctt 240
cagtcacttc acaacctggc acttcgcact taaacctgtg aactctgaga agtccgccca 300
ctccccaagc tctatctgtg ctgtgctgtg ctgtgctctg tgtgtacatc ggccctcaag 360
ttctttcata acaatcccta gtgagcaatg caacttggaa gtatctggaa ggatgtctat 420
aggtcagttt gcccgccttc atcagttcct ccagcaatgg tgggtgctat aggatgccag 480
gcactggggc cagcaggctt gaaaacaaac gcaggaatca agtgagtcag aaaatgaaca 540
aatatcagta aagaactagc tggcgatggg ccgtagagaa aagtaaagta agaaagggga 600
gggaggcaaa attacaggaa tggaaaagag agggagggcc tgaaatactt ttttagctgc 660
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cctgaggatt ggctttggct gtgaggaagg cttctaacag cgactctata ccaacatcct 840
ctgccacaac ccagcccagg aatttgggga gtctatgaga tagaaaacac ctccccccaa 900
aaaaaatgtt ctgtcacatt cccagccccc ggggctcaga caggtacacc gagtccccca 960
gtctcagata cataccatgg gagcaaatga agcctaagaa cccatcctgt gtgcaaggag 1020
ctgaggcctc taagtaccgc cattagcaca gtactgccac caacgcaggt cagcaccatg 1080
gttctccccc tttttagctg tgacaggatt cagggcgcat gggtgacacc cagcaaacca 1140
cactgttaaa gtcttccttg tcc 1163
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<211> 1034
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccaaaccag acctcccaat tttgttcctc gtaattgttt ttgaggcata ctctaatgta 60
gcccaggcta gcctcaaact ccctacccag ctgaggatgg cagtgaactc ctcctgctct 120
tccagcctct accttccaag gctagacata cagtaaagcc ctgccaccgt gtcacgttat 180
gaggtgctgt aggttgaatc tcgggctcca tctccagccc tccactcctg attttcaatc 240
ctcccacctc cagtcccacc tcagtgttaa ttgggaaatg agagctataa gcagttccag 300
ggtagggcta aagtccatct ttcccgctac tcctccatac tggggctcta cataggtacc 360
aacggggatg cagaaaccac ggatgtgcca aagagcttgc aatgtctttt ttttttttaa 420
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agaatgtatt tgagtttgct aggcccggca tagtctcaca agagagagct atatctgggt 900
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ttgtctctgt aact 1034
