白蚁SelT基因及其dsRNA结合金龟子绿僵菌在白蚁防治中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种黑胸散白蚁SelT基因及其dsRNA结合金龟子绿僵菌在白蚁防治中的应用。
背景技术
SelT是主要定位于细胞内质网和高尔基体的硫氧还蛋白样酶，不仅涉及内分泌胰腺的结构完整性，而且参与血糖稳态，并发挥调节Ca2+稳态和氧化还原稳态等多种功能。沉默SelT基因有助于病原菌对秀丽隐杆线虫的侵染，影响线虫对伤害性刺激的反应。因此，SelT可能是降低宿主免疫力的有效靶标基因。
社会性昆虫白蚁已有2.5亿年的生活史，因其分布范围广、适应力强，具有构筑地下巢穴、取食木材和纤维制品等习性，不仅对人们的日常生活带来了严重困扰，也给国民经济造成了重大损失。目前，喷施化学农药和使用毒饵诱杀是防治白蚁的主要手段，但随之而来的环境污染等问题不容忽视。近年来，随着科研人员对白蚁致病菌的深入研究，开发和利用致病菌防治白蚁具有广阔的应用前景。
金龟子绿僵菌是应用最为广泛的真菌杀虫剂之一，可制备成原粉剂、粉剂、可湿性粉剂、乳剂等剂型用于防治害虫。室内试验表明，用1×108孢子/mL浓度的金龟子绿僵菌孢子悬浮液处理白蚁后，第5 d出现死亡，18 d后死亡率100%（见《湖北农业科学》，2006，45(1)：62-64）。但是野外试验表明，群体生活的白蚁能够通过理毛、隔离和埋尸等一系列的卫生行为和生理免疫机制来干扰和抑制绿僵菌的侵染过程（见《Journal of EconomicEntomology》，2008，101(3)：885-893），这大大降低了绿僵菌对白蚁的防治效果。正是因为白蚁群体进化出多种社会免疫策略（如主动免疫：健康个体通过接触染菌个体获得亚致死剂量的分生孢子，激活自身免疫系统提高免疫力），导致单一的绿僵菌生物制剂对野外白蚁的防治效果不理想。因此，打破和瓦解白蚁群体抵御绿僵菌侵染的社会免疫策略是提高绿僵菌防治白蚁效果的关键所在。鉴于此，本发明提供了一种黑胸散白蚁SelT基因及其dsRNA结合金龟子绿僵菌来防治白蚁，相比于单纯使用绿僵菌生物制剂，本发明可以瓦解白蚁群体的社会免疫，显著提高绿僵菌对白蚁的防治效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够瓦解白蚁巢群免疫防御机制的靶标基因SelT及其dsRNA，并结合金龟子绿僵菌来防治白蚁。
本发明提供的一种黑胸散白蚁硒蛋白SelT基因片段，该基因的核苷酸序列为SEQID NO: 1所示的序列。核苷酸序列的获得是根据黑胸散白蚁转录组数据库搜索获得目的基因片段（NCBI Nucleotide-BLAST进行序列比对，确定获得1条白蚁SelT基因片段），据此设计上游引物SEQ ID NO: 2和下游引物SEQ ID NO: 3，进行PCR扩增，纯化PCR产物与pMD18-T载体连接，同时转入trans-T1感受态细胞中并接种于含氨苄抗性的LB平板上培养，随后挑取白色单菌落接入含氨苄抗性LB液体培养基中继续培养，将检测含有目的条带的菌液送入公司测序，测序结果于NCBI网站比对，获得该基因的核苷酸长度572 bp，核苷酸序列为SEQID NO: 1。
采用上述得到的黑胸散白蚁硒蛋白SelT基因片段设计的黑胸散白蚁SelT基因片段，核苷酸序列SEQ ID NO: 6。并将所述的黑胸散白蚁SelT基因片段合成的SelT基因dsRNA。
本发明根据上述提供的白蚁SelT基因dsRNA探讨及对靶标基因表达量的干扰效果：基于白蚁SelT基因的核苷酸序列，分别设计一条均含T7启动子的上游引物SEQ ID NO:4和下游引物SEQ ID NO: 5，通过PCR扩增获得一段长度为358 bp的DNA片段，其序列为SEQID NO: 6所示（两端均含有T7启动子）。随后，利用酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）的方法纯化PCR产物，并将其作为模板体外转录合成dsRNA，然后使用显微注射仪在工蚁胸部侧面第二胸节与第三胸节节间膜处注射进入体积为100 nL总量为2 μg的dsRNA，检测SelT基因表达量。将注射SelT基因dsRNA（dsSelT）的白蚁为处理组，将注射等量dsGFP的白蚁为对照组。结果显示注射dsSelT后，白蚁体内SelT基因表达量显著降低。
本发明提供的一种白蚁SelT基因dsRNA结合金龟子绿僵菌在白蚁防治中的应用：采用“昆虫宿主-昆虫病原真菌”系统，即1头直接感染金龟子绿僵菌的白蚁（称为直接染菌白蚁，下同）与5头无菌同伴白蚁共同接触培养，同伴白蚁通过理毛行为从直接染菌白蚁表皮获得少量绿僵菌孢子，因此称为受菌同伴白蚁（下同）。将1头直接感染绿僵菌孢子的白蚁与5头已注射dsRNA两天的同伴白蚁一起置于直径3.5 cm培养皿内共同培养1 d。以注射SelT基因dsRNA（dsSelT）的受菌同伴白蚁为处理组，以注射等量dsGFP的受菌同伴白蚁为对照组。检测同一培养皿内5头受菌同伴白蚁的抗菌活性。此外，将1头直接染菌白蚁与5头已注射dsRNA两天的同伴白蚁一起置于直径3.5 cm培养皿中共同培养17d，每天统计受菌同伴白蚁的存活情况，以上处理作为染菌组。同时，实验设置未染菌组，与染菌组的区别在于用0.1% Tween 80替换绿僵菌孢子。因此存活率检测实验包含4种处理：注射dsSelT的未受菌同伴白蚁、注射dsGFP的未受菌同伴白蚁、注射dsSelT的受菌同伴白蚁、注射dsGFP的受菌同伴白蚁。结果显示，与其他3组相比，注射dsSelT的受菌同伴白蚁的抗菌活性和存活率均显著降低，由此表明利用RNAi技术沉默SelT基因后打破了受菌同伴白蚁抵御绿僵菌侵染的主动免疫，显著提高了绿僵菌对白蚁的防治效果。
本发明的有益效果：本发明获得了黑胸散白蚁硒蛋白T（SelT）cDNA的保守序列，设计了dsSelT，利用RNAi技术抑制了白蚁体内SelT基因的表达量；通过接触直接感染绿僵菌的白蚁，注射dsSelT的受菌同伴白蚁的抗菌活性和存活率显著降低，表明受菌同伴白蚁的主动免疫被打破，并显著提高了绿僵菌对白蚁的防治效果。本发明可应用于RNAi技术结合金龟子绿僵菌防治黑胸散白蚁。本发明防治黑胸散白蚁具有特异性强、效果优异、环境友好等特点。
附图说明
图1：dsSelT注射入白蚁体内3 d后，白蚁体内SelT基因的mRNA表达图。注射dsGFP的白蚁为对照组，注射dsSelT的白蚁为处理组；β-actin和GAPDH作为内参基因；柱形图数据为平均值±标准差，**表示P < 0.01。
图2：注射dsSelT显著降低受菌同伴白蚁的抗菌活性。注射dsGFP的受菌同伴白蚁为对照组，注射dsSelT的受菌同伴白蚁为处理组；柱形图数据为平均值±标准差，*表示P <0.05。
图3：注射dsSelT显著降低受菌同伴白蚁的存活率。注射dsSelT的未受菌同伴白蚁、注射dsGFP的未受菌同伴白蚁和注射dsGFP的受菌同伴白蚁均为对照组，注射dsSelT的受菌同伴白蚁为处理组；图中不同字母表明不同处理的存活率差异显著，P < 0.05。
具体实施方式
实施例1：获得黑胸散白蚁SelT基因序列
1. 设计PCR扩增所需引物
从黑胸散白蚁的转录组数据库中进行搜索，然后使用NCBI Nucleotide-BLAST进行序列比对，确定获得1条白蚁SelT基因片段。根据搜索获得的SelT基因片段，使用NCBIPrimer-BLAST在线设计上游引物ATGGTGGAAGCTGGGTATTTGT（SEQ ID NO: 2）和下游引物TGGCAAATCCAGGTTTTAGTTC（SEQ ID NO: 3）。将设计好的引物送往武汉擎科生物技术有限公司合成。
2. 制备PCR扩增所需模板
选取大小一致、生长状况良好的3头成熟工蚁放入2 mL离心管内，置于液氮中使样品迅速冷却，采用RNAiso Plus（Trizol）法提取总RNA。随后，参照PrimeScriptTM RT reagentKit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒说明书进行反转录，以1 μg RNA为模板合成cDNA，从而获得PCR扩增所需模板。
3. PCR扩增SelT基因cDNA
PCR扩增获得黑胸散白蚁硒蛋白SelT基因序列，1 %琼脂糖凝胶电泳检测。使用试剂盒E.Z.N.A.®Gel Extraction Kit回收PCR产物。将回收的DNA片段进行pMD18-T载体连接，同时转入trans-T1感受态细胞中并接种于含氨苄抗性的LB平板上培养，随后挑取白色单菌落接入含氨苄抗性LB液体培养基中继续培养。将检测含有目的条带的菌液送入武汉擎科生物技术有限公司测序，测序结果于NCBI网站比对，获得该基因的核苷酸长度为572 bp，核苷酸序列为SEQ ID NO: 1所示的序列。
实施例2：合成黑胸散白蚁SelT基因dsRNA
1.黑胸散白蚁SelT基因dsRNA合成所需引物
基于测序结果黑胸散白蚁硒蛋白SelT基因序列的核苷酸序列SEQ ID NO: 1，分别设计一条均含T7启动子（GGATCCTAATACGACTCACTATAGGG）的上游引物ACGAGCTCTAATGGTTGAGGC（SEQ ID NO: 4）和下游引物TGTTCATTATAGTCCCCCTGG（SEQ ID NO: 5），将设计好的引物送往武汉擎科生物技术有限公司合成。
2.制备SelT基因dsRNA合成所需模板
将均含有T7启动子的dsRNA合成所需引物与含有SelT基因的质粒结合进行PCR扩增，获得一段长度为355 bp的DNA片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 6所示的序列。采用酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）方法纯化PCR产物，以此作为SelT基因dsRNA模板。
3.合成SelT基因dsRNA
利用上述合成的SelT基因dsRNA为模板，在无酶PCR管中配置反应体系体外转录合成dsRNA。使用紫外分光光度计测定dsRNA浓度和纯度，同时琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA质量，并将其保存于-80 ºC超低温冰箱中备用。
实施例3：检测黑胸散白蚁SelT基因dsRNA的干扰效果
1. 注射白蚁SelT基因dsRNA
挑取30头大小一致、生长状况良好的成熟工蚁用于dsRNA注射。冰上冷冻麻醉白蚁后，利用显微注射仪在工蚁胸部侧面第二胸节与第三胸节节间膜处注射进入体积为100 nL总量为2 μg的dsRNA。注射白蚁被置于直径9 cm培养皿中饲养，培养皿底部铺有润湿滤纸作为食物。将注射SelT基因dsRNA（dsSelT）的15头白蚁为处理组，将注射等量dsGFP的15头白蚁为对照组。
2. 检测白蚁SelT基因片段mRNA表达
dsRNA注射3 d后，分别从处理组和对照组中选取3头状况良好的白蚁作为一个生物学重复检测SelT基因片段mRNA表达。采用RNAiso Plus（Trizol）法提取总RNA。并参照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒说明书将提取的RNA进行反转录。随后，使用Real-time PCR方法检测目的基因（SelT）和内参基因β-actin和GAPDH的mRNA表达，从而对SelT基因dsRNA的干扰效率进行分析。每种处理设置12个生物学重复，来自3个不同巢体。结果显示，mRNA表达数据不符合正态分布，因此使用Wilcoxon test；注射dsSelT后，白蚁体内SelT基因表达量下降57.8%（图1，n=12, P =0.002）。
实施例4： SelT基因dsRNA对受菌同伴白蚁抗菌活性的影响
1. 制备绿僵菌孢子悬浮液感染白蚁
金龟子绿僵菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，置于气候箱中25 ºC恒温培养10 d左右，交替进行12 h光照、12 h黑暗。随后，在培养基内加入适量0.1 % Tween 80溶液，使用涂布器刮取培养基表面的绿僵菌孢子，制备萌发率大于95 %的孢子悬浮液（107个孢子/mL）。冰上冷冻麻醉白蚁后，用移液枪将0.35 μL孢子悬浮液滴于白蚁腹部背面，随后将染菌白蚁（称为直接染菌白蚁，下同）置于4 ºC冰箱30 min以使染菌白蚁活动能力暂时降低，待绿僵菌孢子充分沉降到白蚁腹部表皮。对照组将绿僵菌孢子悬浮液替换成0.35 μL无菌的0.1 % Tween 80溶液。
2.检测受菌同伴白蚁抗菌活性
采用“宿主-病原真菌”系统，将1头直接染菌白蚁与5头已注射dsRNA两天的同伴白蚁一起置于直径3.5 cm培养皿内共同培养1 d。共同培养期间，注射白蚁可以通过理毛行为从直接染菌白蚁体表获得少量的绿僵菌孢子，从而称为受菌同伴白蚁（下同）。以注射dsSelT的受菌同伴白蚁为处理组，以注射等量dsGFP的受菌同伴白蚁为对照组。每种处理设置9个生物学重复，来自3个不同巢体。每个重复提取同一培养皿内的5头受菌同伴白蚁组织液，检测其体内抗绿僵菌活性。结果显示，抗菌活性数据符合正态分布，采用linear mixed model分析数据差异显著性；与对照组相比，注射dsSelT的受菌同伴白蚁抗绿僵菌活性降低15.5%（图2，F = 25.995, P = 0.004）。
实施例5： SelT基因dsRNA对受菌同伴白蚁存活率的影响
1. 制备绿僵菌孢子悬浮液感染白蚁
具体操作方法参考实施例4 SelT基因dsRNA对受菌同伴白蚁抗菌活性的影响“1. 制备绿僵菌孢子悬浮液感染白蚁”方法。
2. 检测受菌同伴白蚁存活率
采用“宿主-病原真菌”系统，将1头直接染菌白蚁与5头已注射dsRNA两天的同伴白蚁一起置于直径3.5 cm培养皿中共同培养17 d，以湿润滤纸作为食物平铺在培养皿底部；共同培养期间，注射白蚁可以通过理毛行为从直接染菌白蚁体表获得少量的绿僵菌孢子，因此称为受菌同伴白蚁（下同），以上处理为染菌组。未染菌组与染菌组的区别在于用0.1 %Tween 80溶液替换绿僵菌孢子。因此，本实验共有4种处理：注射dsSelT的未受菌同伴白蚁、注射dsGFP的未受菌同伴白蚁、注射dsSelT的受菌同伴白蚁、注射dsGFP的受菌同伴白蚁。实验进行期间，每天统计同伴白蚁的存活情况，并及时清除死亡白蚁。每种处理设置6个生物学重复，来自3个不同巢体。使用Kaplan-Meier methods分析不同实验处理间白蚁存活率的差异显著性。结果如图3所示，注射dsSelT的受菌同伴白蚁的存活率与其他三组同伴白蚁的存活率相比显著降低（dsSelT+Fungus vs. dsSelT+Tween 80: X2= 60.624, P< 0.001;dsSelT+Fungus vs.dsGFP+Fungus: X2= 4.458, P = 0.035; dsSelT+Fungus vs.dsGFP+Tween 80: X2= 63.988, P< 0.001）；注射dsGFP的受菌同伴白蚁与未染菌同伴白蚁组相比，存活率显著降低（dsGFP+Fungus vs.dsSelT+Tween 80: X2= 23.466, P< 0.001;dsGFP+Fungus vs.dsGFP+Tween 80: X2= 25.999, P< 0.001）；注射不同dsRNA未对未染菌同伴白蚁组的存活率造成显著影响（dsSelT+Tween 80 vs. dsGFP+Tween 80: X2 =1.000, P = 0.317）。
序列表
<110>华中农业大学
<120>白蚁SelT基因及其dsRNA结合金龟子绿僵菌在白蚁防治中的应用
<160>6
<210> SEQ ID NO: 1
<211>572 bp
<212>DNA
<213>黑胸散白蚁Reticulitermes chinensis Snyder
<400>1
<210>SEQ ID NO: 2
<211>22 bp
<212>DNA
<213>上游引物
<210>SEQ ID NO: 3
<211>22 bp
<212>DNA
<213>下游引物
<210>SEQ ID NO: 4
<211>47 bp
<212>DNA
<213>含T7启动子的上游引物
<210>SEQ ID NO: 5
<211>47 bp
<212>DNA
<213>含T7启动子的下游引物
<210>SEQ ID NO: 6
<211>355 bp
<212>DNA
<213>SelT基因dsRNA
<110>华中农业大学
<120>白蚁SelT基因及其dsRNA结合金龟子绿僵菌在白蚁防治中的应用
<160>6
<210> SEQ ID NO: 1
<211>572 bp
<212>DNA
<213>黑胸散白蚁Reticulitermes chinensis Snyder
<400>1
atgggggtag ctccgtggtg gaagaatggt ggaagctggg tatttgtatc tcacactctt 60
catatgttct gcccttttca gcccttttca tttacttatt cagtcggaac cagatgcaaa 120
gctctgcttg tgggtaccag aaagcgtacc agaattatgg gaatatttta cgtgaagcat 180
atccagaaat cacagttgaa ggtgttcatt atagtccccc tggttatatg acgtttcttg 240
cgagaacatt gggatttgga aaactgctta taatagtctg tatcatgagt ggtgtaaata 300
tttttggttc cattgggtgt gttgaaccat catggtggaa gtggtgtgtg gagaacaaaa 360
tttattcctg tgtgctaatg ttttacatgt gcaatgccct ggaaggacat ctgcttgcaa 420
ctggagcatt tgaaatatat ttcaatgatg tgcccgtttg gtcaaagctt gagacaggaa 480
gaatgcctca accattagag ctcgtccaga ttattgataa tcatttgcag ttccaaacaa 540
aagtagaact aaaacctgga tttgccaaat aa 572
<210>SEQ ID NO: 2
<211>22 bp
<212>DNA
<213>上游引物
atggtggaag ctgggtattt gt 22
<210>SEQ ID NO: 3
<211>22 bp
<212>DNA
<213>下游引物
tggcaaatcc aggttttagt tc 22
<210>SEQ ID NO: 4
<211>47 bp
<212>DNA
<213>含T7启动子的上游引物
ggatcctaat acgactcact atagggacga gctctaatgg ttgaggc 47
<210>SEQ ID NO: 5
<211>47 bp
<212>DNA
<213>含T7启动子的下游引物
ggatcctaat acgactcact atagggtgtt cattatagtc cccctgg 47
<210>SEQ ID NO: 6
<211>355 bp
<212>DNA
<213> SelT基因dsRNA
ggatcctaat acgactcact atagggacga gctctaatgg ttgaggcatt cttcctgtct 60
caagctttga ccaaacgggc acatcattga aatatatttc aaatgctcca gttgcaagca 120
gatgtccttc cagggcattg cacatgtaaa acattagcac acaggaataa attttgttct 180
ccacacacca gatggttcaa cacacccaat ggaaccaaaa atatttacac cactcatgat 240
acagactatt ataagcagtt ttccaaatcc caatgttctc gcaagaaacg tcatataacc 300
agggggacta taatgaacac cctatagtga gtcgtattag gatcc 355
