高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系及其应用
技术领域
本发明涉及外生菌根培养技术领域，尤其是涉及一种高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系及其应用。
背景技术
外生菌根(Ectomycorrhiza)，是植物与外生真菌相互作用建立的共生体，通常菌丝会缠绕寄主植物根系形成菌套，如田间发现的板栗与橙黄硬皮马勃共生，肉眼清晰可见的呈白色菌套缠绕的外生菌根。外生菌根普遍地存在于温带、寒带和部分亚热带地区的森林生态系统中，促进森林生态系统中养分的循环与碳的固定。土壤中的外生菌根真菌吸收的水分与养分，通过菌丝转运到外生菌根中，进而转移到宿主植物中促进植物生长。
中国板栗(Castanea mollissima Blume)是重要的干果之一，具有重要的经济价值和生态功能。板栗大多生长在土壤贫瘠、干旱的地区，板栗可与土壤中的菌根真菌共生形成典型的外生菌根结构，而菌根形成可以显著促进宿主植物对于营养元素的吸收和转运，具有重要的产业价值。
但是现有的板栗与外生菌根真菌的共生培养方法均存在一定缺陷，主要为：(1)接种方式复杂：目前存在的接种方式有两种：第一种混合基质培养法，基质需要按照一定比例进行混合，过程繁琐并且比例难以把控。第二种离体培养法，需要配置大量培养基以及进行无菌操作，工作量大并且操作困难。(2)菌根共生效率低且不稳定：离体培养方法，通常每株板栗幼苗仅有极少数量的菌根形成或不形成菌根，几十甚至上百株板栗幼苗才可以提供试验所需菌根数量，工作量大且菌根遗传背景混乱，不易于后续实验分析。
因此，研究建立一种高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系，进而有效提高对于外生菌根的研究效率，同时也可以应用于农业生产中培育板栗菌根苗木，变得十分必要和迫切。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系，所述接种体系可以有效提高板栗种苗的根系与真菌的侵染率，缩短外生菌根的生成时间，可以在土盆中使板栗外生菌根的形成效率提升到100％，且不同植株菌根一致，有可比性。
本发明的第二目的在于提供一种利用上述高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系的板栗外生菌根的培养方法，该培养方法经检测最快15天可以检测到菌根形成，2个月左右每个植株根系都形成大量外生菌根，且共生率达到100％。
本发明的第三目的在于提供一种上述高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系，上述培养方法在制备板栗外生菌根中的应用。
本发明提供的一种高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系，所述接种体系包括培养土盆、基质、带有真菌菌丝的固态培养基以及板栗种苗；所述基质为灭菌后的蛭石；
其中，板栗种苗种植于基质为灭菌后蛭石的土盆中，带有真菌菌丝的固态培养基放置于板栗种苗的根系周围，且固态培养基上的真菌菌丝与板栗种苗的根系相接触。
进一步的，板栗种苗包括生根的板栗种子或板栗组培苗；
优选地，所述生根的板栗种子为在板栗培养基上培养至根系4～5cm的板栗种子；
优选地，所述板栗组培苗为在板栗生根培养基上培养至根系3～4cm的板栗组培苗。
进一步的，所述真菌包括橙黄硬皮马勃菌、双色蜡膜菌或硬皮马勃菌中的至少一种，优选为橙黄硬皮马勃菌。
进一步的，所述固态培养基包括P20真菌培养基、PDA真菌培养基中的任意一种，优选为P20真菌培养基；
优选地，所述固态培养基上真菌的菌落直径为2～3cm。
进一步的，所述培养土盆的规格为23cm×18cm×21.5cm。
更进一步的，所述接种体系的培养基质为蛭石，优选为1～3mm的金黄蛭石。
本发明提供的一种利用上述高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系的板栗外生菌根的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：
提供上述高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系，随后浇灌培养液进行培养，得到板栗外生菌根。
进一步的，所述培养液包括正常浓度的1/2霍格兰营养液、低氮的1/2霍格兰营养液或低磷的1/2霍格兰营养液中的任意一种；
优选地，所述低磷低氮营养液为：磷浓度20微摩尔，氮浓度1.5毫摩尔的1/2霍格兰营养液。
进一步的，所述培养的培养时间为30～60天；
优选地，所述培养液的浇灌量为150～200ml。
本发明提供的上述高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系或上述培养方法在制备板栗外生菌根中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系，该接种体系包括培养土盆、基质、带有真菌菌丝的固态培养基以及板栗种苗；其中，板栗种苗种植于培养土盆中，带有真菌菌丝的固态培养基放置于板栗种苗的根系周围，且固态培养基上的真菌菌丝与板栗种苗的根系相接触。上述接种体系采用生长有真菌的固态培养基与板栗种苗的根系相接触，可以保证真菌前期有足够的营养进行生长，为共生提供更有力的条件，这种培养方式能够极大地提高真菌与板栗根系的共生效率以及菌根的形成效率，同时，该接种体系因为在培养土盆中进行培养，更接近板栗田间生产的生理状况，选择蛭石作为基质不含矿质营养，可以通过施加低磷低氮营养液促进植物侧根发育，用含固体培养基菌丝接种，可以先保证菌丝存活和生长进而可以有效提高板栗种苗的根系与真菌的侵染率，缩短外生菌根的生成时间，可以在土盆中使板栗外生菌根的形成效率提升到100％，且不同植物菌根一致。
本发明提供的利用上述高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系的板栗外生菌根的培养方法，该方法为提供上述高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系，随后浇灌营养液进行培养，得到板栗外生菌根。上述培养方法经检测最快15天可以检测到菌根形成，2个月左右每个植株根系都形成大量外生菌根，且共生率达到100％。
本发明上述高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系，上述培养方法可以广泛应用于板栗外生菌根的制备中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例4提供的外生菌根培养的接种体系示意图；
图2为本发明实施例4提供的培养得到的板栗外生菌根实物图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，一种高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系，所述接种体系包括培养土盆、带有真菌菌丝的固态培养基以及板栗种苗；
其中，板栗种苗种植于培养土盆中，带有真菌菌丝的固态培养基放置于板栗种苗的根系周围，且固态培养基上的真菌菌丝与板栗种苗的根系相接触。
本发明提供的高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系，该接种体系包括培养土盆、基质、带有真菌菌丝的固态培养基以及板栗种苗；其中，板栗种苗种植于培养土盆中，带有真菌菌丝的固态培养基放置于板栗种苗的根系周围，且固态培养基上的真菌菌丝与板栗种苗的根系相接触。上述接种体系采用生长有真菌的固态培养基与板栗种苗的根系相接触，可以保证真菌前期有足够的营养进行生长存活，为共生提供更有力的条件，这种培养方式能够极大地提高真菌与板栗根系的共生效率以及菌根的形成效率，同时，该接种体系因为在培养土盆中进行培养，更接近板栗田间生产的生理状况，选择蛭石作为基质不含矿质营养(便于科研中进行不同浓度梯度营养元素、植物激素等处理研究)，可以通过施加低磷低氮营养液促进植物侧根发育，用含固体培养基菌丝接种，可以先保证菌丝存活和生长，进而可以有效提高板栗种苗的根系与真菌的侵染率，缩短外生菌根的生成时间，可以在土盆中使板栗外生菌根的形成效率提升到100％，且不同植物菌根一致。
在本发明的一种优选实施方式中，板栗种苗包括生根的板栗种子或板栗组培苗；
在上述优选实施方式中，所述生根的板栗种子为在板栗培养基上培养至根系4～5cm的板栗种子；
优选地，所述板栗培养基为WPM培养基，组成成分为：NH4NO3 400mg/L；Ca(NO3)2.4H2O 556mg/L；K2SO4 990mg/L；CaCl2·2H2O 96mg/L；KH2PO4 170mg/L；Na2MoO4·2H2O0.25mg/L；MgSO4·7H2O 370mg/L；MnSO4·H2O 22.4mg/L；ZnSO4·7H2O 8.6mg/L；CuSO4·5H2O0.25mg/L；FeSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2-EDTA 37.3mg/L；肌醇100mg/L；维生素B11.0mg/L；烟酸0.5mg/L；维生素B6 0.5mg/L；甘氨酸2mg/L；蔗糖30g/L；琼脂7g/L；使用0.25N KOH调节pH至5.8，121℃湿热灭菌21min。
在上述优选实施方式中，所述板栗组培苗为在板栗生根培养基上培养至根系3～4cm的板栗组培苗。
优选地，上述板栗生根培养基为RM培养基，具体的，RM培养基的组分包括：NH4NO3400mg/L；Ca(NO3)2.4H2O 556mg/L；K2SO4 990mg/L；CaCl2·2H2O 96mg/L；KH2PO4 170mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L；MgSO4·7H2O 370mg/L；MnSO4·H2O 22.4mg/L；ZnSO4·7H2O8.6mg/L；CuSO4·5H2O 0.25mg/L；FeSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2-EDTA 37.3mg/L；肌醇100mg/L；维生素B1 1.0mg/L；烟酸0.5mg/L；维生素B6 0.5mg/L；甘氨酸2mg/L；吲哚丁酸IBA0.5mg/L；蔗糖25g/L；琼脂5g/L。在具体配制时，使用KOH调节pH至5.8，121℃湿热灭菌21min。
作为一种优选的实施方式，上述根系3～4cm的板栗组培苗，组培苗通过无性方式繁殖，具有DNA遗传背景一致性的优点。
在本发明的一种优选实施方式中，所述真菌包括橙黄硬皮马勃菌、双色蜡膜菌或硬皮马勃菌中的至少一种，优选为橙黄硬皮马勃菌。
作为一种优选的实施方式，上述真菌是板栗根际的优势菌种。
在本发明的一种优选实施方式中，所述固态培养基包括P20真菌培养基、PDA真菌培养基中的任意一种，优选为P20真菌培养基；
优选地，所述固态培养基上真菌的菌落直径为2～3cm。
作为一种优选的实施方式，上述固态培养基菌丝生长旺盛。
在本发明的一种优选实施方式中，所述培养土盆的规格为23cm×18cm×21.5cm。
在本发明的一种优选实施方式中，所述接种体系的培养基质为蛭石，优选为1～3mm的金黄蛭石。
作为一种优选的实施方式，上述培养基质为蛭石，可以有效的提高接种的稳定性，同时蛭石不含任何营养成分，方便科学研究中进行人为设定不同浓度矿质营养成分，pH值，添加激素等便于研究。
根据本发明的一个方面，一种利用上述高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系的板栗外生菌根的培养方法，包括以下步骤：提供上述高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系，随后浇灌培养液进行培养，得到板栗外生菌根。
本发明提供的利用上述高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系的板栗外生菌根的培养方法，该方法为提供上述高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系，随后浇灌培养液进行培养，得到板栗外生菌根。上述培养方法经检测最快15天可以检测到菌根形成，2个月左右每个植株根系都形成大量外生菌根，且共生率达到100％。
在本发明的一种优选实施方式中，所述培养液包括正常浓度的1/2霍格兰营养液、低氮的1/2霍格兰营养液或低磷的1/2霍格兰营养液中的任意一种；
优选地，所述低磷低氮营养液为：磷浓度20微摩尔，氮浓度1.5毫摩尔的1/2霍格兰营养液。
所述低磷低氮的霍格兰营养液，具体组分包括：Ca(NO3)2.4H2O590.75mg/L；KNO3252.78mg/L；MgSO4·7H2O 246.48mg/L；NaFeEDTA(棕色瓶)18.35mg/L；KH2PO4 2.72mg/L；H3BO3 0.618mg/L；Na2MoO4·2H2O0.048mg/L；ZnSO4·7H2O 0.288mg/L；MnCl2·4H2O0.396mg/L；CuSO4·5H2O0.125mg/L；CoCl2·6H2O 0.048mg/L；HCl 456.25mg/L；MESmonohydrate106.6mg/L；NH4NO3 2.4mg/L；在具体配制时，使用0.25N KOH调节pH至6.1。
作为一种优选的实施方式，上述低磷低氮的霍格兰营养液，可以促进植物侧根生长及植物释放信号物质促进菌根共生。
在本发明的一种优选实施方式中，所述培养的培养时间为30～60天；
在本发明的一种优选实施方式中，所述培养液的浇灌量为150～200ml，保证湿度。
根据本发明的一个方面，上述高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系或上述培养方法在制备板栗外生菌根中的应用。
本发明上述高效实用的板栗外生菌根土盆接种体系，上述培养方法可以广泛应用于板栗外生菌根的制备中。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1制备生长有真菌的固态培养基：
(1)配制P20培养基真菌培养基，随后将配制好的真菌培养基倒入13cm×13cm的培养皿中，待培养基完全凝固收取留作后续使用；
其中，上述真菌培养基为P20培养基，组分为：Di-NH4-tartrat，0.5g/L；KH2PO4 1g/L；MgSO4·7H2O 0.5g/L；葡萄糖1g/L；微量元素母液(1000×)1mg/L；盐酸硫铵母液(1000×)1mg/L；琼脂为15g/L；使用0.25N KOH调节pH至5.5，121℃湿热灭菌21min。
(2)将硬皮马勃菌接种到步骤(1)中的培养皿上，每个培养皿中接种9块大小相同的菌丝块，25℃条件下暗培养14d，获得生长直径为2-3cm真菌菌落的真菌固态培养基。
实施例2制备生根的板栗种子
(1)配置板栗培养基，随后将配制好的板栗培养基倒入13cm×13cm培养皿中，待培养基完全凝固后，在培养基的一侧铺上大小为培养基表面一半的无菌滤纸；
其中，所述板栗培养基为WPM培养基，组成成分为：NH4NO3 400mg/L；Ca(NO3)2.4H2O556mg/L；K2SO4 990mg/L；CaCl2·2H2O 96mg/L；KH2PO4170mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L；MgSO4·7H2O 370mg/L；MnSO4·H2O22.4mg/L；ZnSO4·7H2O 8.6mg/L；CuSO4·5H2O 0.25mg/L；FeSO4·7H2O27.8mg/L；Na2-EDTA 37.3mg/L；肌醇100mg/L；维生素B1 1.0mg/L；烟酸0.5mg/L；维生素B6 0.5mg/L；甘氨酸2mg/L；蔗糖30g/L；琼脂7g/L；使用0.25N KOH调节pH至5.8，121℃湿热灭菌21min。
(2)将板栗种子修块后消毒接种到步骤(1)中的培养基上，使用铝箔纸包裹整个培养皿；26℃培养3d；将铝箔纸取下，改为只包裹含有滤纸的培养皿下半部分，培养条件为16小时光照，8小时黑暗，光照时26℃，黑暗时21℃；培养约5-7d后可获得根系4～5cm的生根板栗种子。
实施例3制备板栗组培苗
(1)配置板栗生根培养基，随后将配制好的板栗生根培养基倒入13cm×13cm培养皿中，待培养基完全凝固后，在培养基的一侧铺上大小为培养基表面一半的无菌滤纸；
所述板栗生根培养基为RM培养基，具体的，RM培养基的组分包括：NH4NO3 400mg/L；Ca(NO3)2.4H2O 556mg/L；K2SO4 990mg/L；CaCl2·2H2O96mg/L；KH2PO4 170mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L；MgSO4·7H2O 370mg/L；MnSO4·H2O 22.4mg/L；ZnSO4·7H2O 8.6mg/L；CuSO4·5H2O 0.25mg/L；FeSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2-EDTA 37.3mg/L；肌醇100mg/L；维生素B11.0mg/L；烟酸0.5mg/L；维生素B6 0.5mg/L；甘氨酸2mg/L；吲哚丁酸IBA 0.5mg/L；蔗糖25g/L；琼脂5g/L。在具体配制时，使用KOH调节pH至5.8，121℃湿热灭菌21min。
(2)将板栗组培苗接种到步骤(1)中的培养基上，使用铝箔纸包裹整个培养皿；26℃培养3d；将铝箔纸取下，改为只包裹含有滤纸的培养皿下半部分，培养条件为16小时光照，8小时黑暗，光照时26℃，黑暗时21℃；培养约5-7d后可获得根系3～4cm的板栗组培苗。
实施例4
一种板栗外生菌根的培养方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将实施例2制备得到的生根板栗种子移栽至蛭石基质中，进行练苗处理，并使得根系再次生长；期间移栽时蛭石培养基使用1/2霍格兰营养液浇灌，之后的培养使用去离子水进行浇灌；培养约7天，板栗种子苗完全适应培养间环境，得到练苗后的生根板栗种苗；
所述1/2霍格兰营养液，具体组分包括：Ca(NO3)2·4H2O 590.75mg·L-1；KNO3252.78mg·L-1；MgSO4·7H2O 246.48mg·L-1；NaFeEDTA(棕色瓶)18.35mg·L-1；KH2PO4136.09mg·L-1；H3BO3 0.618mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.048mg·L-1；ZnSO4·7H2O 0.288mg·L-1；MnCl2·4H2O 0.396mg·L-1；CuSO4·5H2O0.125mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.048mg·L-1；HCl456.25mg·L-1；MES monohydrate106.6mg·L-1；NH4NO3 80mg·L-1；在具体配制时，使用0.25N KOH调节pH至6.1。
(2)图1为本实施例外生菌根培养的接种体系示意图。
如图1所示，将练苗后的生根板栗种苗再次移栽至蛭石基质中，并在根系放置三块实施例1生长有直径2-3cm菌落的真菌固态培养基，其中带有菌丝的一侧紧贴于根系环绕一周，培养条件为16小时光照，8小时黑暗，恒温28℃，湿度50％-60％。期间共生时蛭石培养基使用低磷低氮的霍格兰营养液浇灌，之后使用去离子水浇灌两次，之后，使用低磷低氮的霍格兰营养液浇灌一次，去离子水浇灌两次，往复循环，约每5-7d需要浇灌一次，培养60天，得到板栗外生菌根。
其结果如图2所示，图2为本实施例培养得到的板栗外生菌根实物图。其中，白色根系皆为菌根，如“*”所示。
实施例5
本实施例除将步骤(1)中实施例2制备得到的生根板栗种子替换为实施例3制备得到的板栗组培苗外，其余同实施例4。
对比例1
与本发明有相比较的案例，目前研究经常用的有植物外生菌根离体外“三名治接种体系”。
该接种体系具体方案如下：
1、将消毒后板栗种子在超静工作台中，切成1x1x1cm的小块，放在配制灭菌的WPM固体培养基的培养皿中，密封后。放置于光照培养箱，进行培养，发芽生根。
2、同时，在P20培养基中培养菌根真菌，如橙黄硬皮马勃或者双色蜡膜。
3、待板栗发芽生根后，根长于3-5cm时，在无菌培养皿中根附近放一个菌斑，然后在菌斑和植株根上覆盖一层灭菌后的透明玻璃膜，菌和植株根系上下各有一层玻璃膜中间夹心为菌和植株根，称为“三明治接种体系”。
4、接种1到2个月后，观察和收集菌根情况。
方案效果：我们在实际中，发现以下缺陷：
(1)、虽然按照以上方式，能够形成少数菌根，但每批次以及整体的菌根侵染率非常低，且能够形成的菌根非常少。
(2)、长时间在培养皿中，植株根系生长基本受到抑制和干枯，几乎很难获得健康的菌根，无法与田间植株生长状况比较。
(3)、在进一步的根组织切片染色观察中发现，即使“三明治接种体系”中形成的菌根和田间观察的正常菌根的结构存在不同，不能真实反映出田间菌根的正常形态和生理特性。
(4)、整个过程容易污染，培养基污染后，形成的菌根和植株没有实用价值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
