ZmSBP12基因在调控玉米抗旱性、株高及穗位高中的用途
技术领域
本发明涉及ZmSBP12基因的新用途，尤其涉及ZmSBP12基因在调控玉米抗旱性、株高以及穗位高等方面的新用途，属于ZmSBP12基因在玉米育种应用领域。
背景技术
玉米已成为中国第一大粮食作物，年种植面积达5亿亩。中国作为一个农业大国，面临着用世界7％的土地养活世界22％的人口的难题，并且近年来中国对国外进口玉米的依赖不断加重，造成严重的粮食安全隐患。因此迫切需要培育抗逆性强(抗旱)、抗倒伏的具有高产潜力的杂交种。
干旱是影响中国及世界玉米稳产的重要环境因子，世界上干旱及半干旱地区约占地球陆地面积的34.9％，占耕地面积的42.9％，每年因干旱造成粮食减产量约占各种自然灾害造成粮食损失的60％。干旱是影响中国及世界玉米稳产的重要环境因子，中国玉米近70％的面积分布在东北、华北、西南和西北依靠自然降雨的丘陵旱地或平原旱地上，种植面积最大的吉林省一般干旱年份减产25％以上，大旱年减产30％～35％，严重旱灾年部分地区几乎绝收。因此，筛选营养和水分高效利用基因型，培育水、肥资源节约型和环保型的新品种已成为中国玉米生产的迫切要求和抗旱育种的重要目标。并且随着全球变暖及环境恶化，还将有更多的地方受到干旱的威胁。为此需要加快对玉米及其他作物抗旱性的研究。
目前关于玉米抗旱方面的研究尚不完善，目前具有应用潜力的基因仅有ZmVPP1等为数不多的几个基因。长期的玉米生产实践表明，培育矮秆、耐密、适宜机械化作业的玉米新品种是增产、增效的另一关键技术措施。已有报道显示，株高升高会使更多的同化物用于营养生长而不是生殖生长，直接影响玉米产量；较高的株高还会使玉米的重心升高，并伴随植株徒长、茎秆变细、维管束减少、细胞壁木质素纤维素的组成和含量改变、茎秆机械强度降低，进而加重倒伏的发生。因此，有效降低株高是培育高产稳产玉米新品种的基本要求。在水稻和小麦中，半矮杆基因sd1和rht 1的利用直接导致了第一次绿色革命，作物的产量得到了很大的提升，然而在玉米中类似这种绿色革命基因的、既能有效降低株高又没有明显穗部负向效应的主效半矮杆基因依然没有找到。
ZmSBP12基因是一个受miR156调控的玉米SQUAMOSA-PROMOTE R BINDINGPROTEIN-LIKE(SPL)转录因子。ZmSPL12基因具有4个外显子，3个内含子。其主要的功能区域包含miR156调控位点(CATGC TCTCTCTCTTCTGTCA)及SBP结构域。
玉米的抗旱性、株高、穗位高往往受到许多微效数量性状位点(QTL) 的控制，现在的玉米育种依然需要通过不断累积这些微效QTL来提高抗旱性、降低株高、穗位高，选择效率低下。因此挖掘控制玉米抗旱、株高、穗位高的主效基因，解析其遗传调控网络具有重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明的主要目的是提供ZmSBP12基因在调控玉米抗旱性、株高或穗位高中的用途；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明将ZmSBP12基因在玉米中过表达后，玉米突变体植株出现抗旱性增加、株高及穗位高降低等性状。ZmSBP12基因过表达导致抗旱性增加、株高及穗位高降低，表明ZmSBP12基因对玉米的抗旱、株型(株高)等起着至关重要的作用。
因此，通过改变ZmSBP12基因在玉米中的表达丰度能够调控玉米的抗旱性增加、株高及穗位高；譬如，通过提高ZmSBP12在玉米中的表达丰度能够提高玉米抗旱性、降低玉米株高或穗位高；相反，降低ZmSBP12 基因在玉米中的表达丰度，则能够降低玉米抗旱性、使玉米株高或穗位高升高。
本发明通过提高ZmSBP12基因的表达丰度达到了提高玉米抗旱性、降低玉米株高和穗位高的效果，因此，所有涉及通过调控ZmSBP12基因的mRNA和蛋白丰度来提高玉米抗旱性、降低玉米株高和穗位高的方法都应属于本发明的保护范围，这里所述的方法应该包括所有人工合成和设计核苷酸或蛋白的方法及利用未曾报道的自然变异。
至于如何提高ZmSBP12基因在玉米中的表达丰度以及降低ZmSBP12 基因在玉米中的表达丰度，这均是本领域技术人员可以通过各种常规的技术手段来实现，譬如，通过构建ZmSBP12基因的过表达载体，使ZmSBP 12基因在玉米中过表达或超表达，进而使玉米的抗旱性提高或降低玉米的株高或穗位高，进而选育得到抗逆性强(抗旱)、抗倒伏的转基因植物；或者通过基因编辑技术或基因敲除技术等将植物体内的ZmSBP12基因进行功能缺陷突变得到不抗旱、株高及穗位高升高的转基因植物。
本发明还涉及所述ZmSBP12基因在玉米育种中的应用；包括玉米自交系和杂交种的培育过程中；具体的，在玉米杂交种其中一个亲本中过表达ZmSBP12基因即可达到降低玉米株高、穗位高，提高玉米抗旱性的效果。
本发明提供了一种提高玉米抗旱的方法，包括：(1)构建含有所述 ZmSBP12基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将ZmSBP12基因在植物组织或细胞中进行过表达。
本发明还提供了提高玉米抗倒伏的方法，包括：(1)构建含有所述 ZmSBP12基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将ZmSBP12基因在植物组织或细胞中进行过表达。
本发明中所述提高玉米抗旱性、降低株高及穗位高体现在转基因植物与野生型在相同条件下抗旱性增强、株高及穗位高降低。
将所述ZmSBP12基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区、SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。
所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。
另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.2所示的多核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率。例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达效率；或者将SEQ ID No.2所示的多核苷酸进行位点改造得到改造后的变体，作为一种优选的实施方案，所述变体的多核苷酸序列为SEQ ID No.6所示。
本发明还提供了含有ZmSBP12基因的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。
本发明中所述ZmSBP12基因的编码氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
所述ZmSBP12基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。
本发明还涉及检测ZmSBP12基因表达量的特异性扩增引物，其序列分别为SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示；
上游引物：5’-AGCTCATCTGACTTAAAGCCCC-3’
下游引物：5’-TTCATTGGCCAAGGCTCATCT-3’
利用该特异性扩增引物对玉米进行扩增，其产物片段为155bp，产物序列为SEQ IDNo.5所示。
本发明通过提高ZmSBP12基因的表达丰度达到了提高玉米抗旱性、降低玉米株高和穗位高的效果，能够应用于辅助选育抗旱及抗倒伏的玉米新品种，还可应用于玉米优良自交系和杂交种的培育。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/ 或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和 Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。
所述“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQ ID No.1所示氨基酸序列的多核苷酸变体或者是通过重组的方法(例如 DNA改组)。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性：DNA结合活性、蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中表达的效应等。
本发明中所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下) (因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC， 1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
本发明中所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。
术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f 配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。
术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。
术语“转化”指将编码基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法等。“稳定转化”指被引入的多核苷酸构建体整合至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；“瞬时转化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暂时性表达或存在。
术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。
术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。
术语“重组植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。
附图说明
图1为ZmSBP12基因过表达载体Ubi::ZmSBP12-eGFP的示意图。
图2对纯合体转基因植株进行ZmSBP12基因的qPCR检测结果。
图3为野生型及突变体ZmSBP12-OE经干旱处理后的表现。
图4为纯合突变体ZmSBP12-OE的形态学特征。突变体ZmSBP12-O E在自然日照条件下与野生型比较：1、8展开叶时期，植株高度略低，叶间距减小；野生型SAM已达到小花分化时期，而突变体则刚达到小穗分化时期。
图5为自然光照条件下，突变体ZmSBP12-OE与野生型的株高统计。从统计数据看，突变体ZmSBP12-OE的株高显著低于野生型。图中YW7 84-785代表OE-1；YW786-788代表OE-2；YW789-790代表OE-3；YW 791-792代表OE-3。从样本量N≥30，P值≤0.005视为达到极显著水平。
图6为自然光照条件下，突变体ZmSBP12-OE与野生型的地上各节长度的统计。
图7为自然光照条件下，突变体ZmSBP12-OE的地上各节长度相对于野生型的地上各节长度的变化量(可以看出地上1～3节降低最为显著，该数据显示这一表型与抗倒伏密切相关)。
图8为野生型及ZmSBP12-OE与骨干亲本(WL1、WL2、WL3、WL 4、WL5)组配F1的株高、穗位高统计(可以看ZmSBP12-OE也可以显著降低杂交种的株高和穗位高)。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中的玉米自交系“Xiang249”公众可以从中国农业科学院生物技术研究所获得。
实施例1ZmSBP12基因的获得及突变体ZmSBP12-OE的构建
一.ZmSBP12基因的获得及改造
利用Trizol法(参考赛默飞世尔试剂公司Trizol说明书)提取B73 自交系V2时期植株的总RNA，反转录(参考天根生化科技反转录试剂盒(KR106-02)说明书)。由于ZmSBP12基因是一个受miR156调控的玉米SQUAMOSA-PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE(SPL)转录因子，所以需要见miR156调控位点(CATGCTCTCTCTCTTCTGTCA) 进行改造，以使miR156不能识别切割ZmSBP12。
改造方法如下：利用引物
6827-F1/R1： GTTTGGTGTTACTTCTGCAGATGGAGTGGACGGCCCCGAA/ GCTGAGCAGGCTCAGGGCATGCTGAAGATCCGCTGCTC；以上述反转录得到的cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增得到片段1；利用引物 6827-F2/R2:GCCCTGAGCCTGCTCAGCGCCGGCGCTTGTGGACTGCC TGATT/TGCCACCACCGGATCCATTTATCTGGTTTACACCAAAGAAA 以上述反转录得到的cDNA为模板，进行第二轮PCR扩增得到片段2；
再利用引物
6827-F1/R2： GTTTGGTGTTACTTCTGCAGATGGAGTGGACGGCCCCGAA/TGCCA CCACCGGATCCATTTATCTGGTTTACACCAAAGAAA；
以上述片段1和片段2的混合物为模板进行第三轮PCR-重叠PCR 得到位点改造后的ZmSPL12的基因编码序列(SEQ ID No.6)。
二突变体ZmSBP12-OE的创制及生物学特征
1、ZmSBP12过表达载体pCAMBIA-Ubi::ZmSBP12-eGFP的构建
采用同源重组的方法将序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子插入到改造后的pCAMBIA载体的PstI和BamHI酶切位点间，获得了ZmSBP12 过表达载体pCAMBIA-Ubi::ZmSBP12-eGFP。并对载体进行测序。测序结果表明：载体pCAMBIA-Ubi::ZmSBP12-eGFP为将序列表中SEQ ID No.2 所示的DNA分子插入到改造后的pCAMBIA的PstI和BamHI酶切位点间，且保持改造后的pCAMBIA载体的其他序列不发生改变得到的载体。
2、重组菌的获得
将步骤1获得的ZmSBP12过表达载体 pCAMBIA-Ubi::ZmSBP12-eGFP在超净台内通过电击的方法转入农杆菌 EHA105中得到重组菌pCAMBIA-Ubi::ZmSBP12-eGFP/EHA105，用于转化Xiang249野生型幼胚愈伤。
3、突变体ZmSBP12-OE的构建
利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法：(1)制备农杆菌侵染液； (2)侵染与共培养：用所述侵染液对玉米幼胚进行侵染，侵染结束后，将幼胚盾面朝上，放入共培养培养基中暗培养；(3)筛选、继代和植株再生；(4)诱导；(5)分化；(6)生根；(7)炼苗，转田间种植，得到T0代转基因玉米。
参照上述方法，以序列表中SEQ ID No.6所示的DNA分子获得突变体Ubi::ZmSBP12-eGFP。
4、转基因突变体ZmSBP12-OE的鉴定
通过喷洒1/1000(V/V)的Basta溶液进行筛选鉴定，若植株为阴性植株(不含有转基因成分)则叶片在涂抹Basta溶液三天后会枯萎，而阳性植株(含有转基因成分)的叶片无变化。
5、突变体ZmSBP12-OE的抗旱性鉴定
将突变体ZmSBP12-OE与野生型在光照培养箱(14h光照，10h黑暗；光照下温度28℃，黑暗下温度22℃)生长至两叶一心，开始干旱处理，至野生型叶片全部萎蔫干枯，复水，恢复培养2天，统计成活率，结果表明突变体ZmSBP12-OE比野生型显著耐旱(图3)。
6、突变体ZmSBP12-OE的形态学特征
在自然日照条件下，8展开叶时期，突变体ZmSBP12-OE较野生型植株高度略低，叶间距减小(图4)；植株发育迟缓，野生型SAM已达到小花分化时期，而突变体则刚达到小穗分化时期(图4)。成熟植株株高降低。在相同生长条件下，对突变体ZmSBP12-OE与野生型的地上各节长度的统计，发现突变体大部分节间长度较野生型都有所下降，但也有一些节的节间长度较野生型略长。同时，对突变体ZmSBP12-OE的地上各节长度相对于野生型的地上各节长度的变化量做了统计，发现突变体的地上 1～3节降低最为显著，生产实践及研究表明，玉米的茎折即发生在地上1～3 节并且茎折会造成玉米减产甚至绝产，这一表型与抗倒伏密切相关。
7、过表达ZmSBP12可降低杂交种的株高和穗位高
通过将野生型及ZmSBP12-OE突变体与骨干亲本(WL1、WL2、WL3、WL4、WL5)组配F1，并于廊坊进行表型观察，种植密度6000株/亩，管理同一般玉米大田管理，待株形固定后(授粉后30天)进行表型测量，统计结果如图8。结果表明，过表达ZmSBP12基因可降低杂交种的株高和穗位高，该结果表明ZmSBP12基因的表达量的提高有助于提高抗倒伏密性能。
综上所述，将ZmSBP12基因在玉米中进行过表达后，玉米突变体植株的抗旱性增加、株高及穗位高降低，表明ZmSBP12基因对玉米的抗旱、株型(株高)等起着至关重要的作用且具有重大的育种应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院生物技术研究所华南农业大学
<120> ZmSBP12基因在调控玉米抗旱性、株高及穗位高中的用途
<130> BJ-2002-190304A
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 332
<212> PRT
<213> Zea manys L
<400> 1
Met Glu Trp Thr Ala Pro Lys Pro Ala Ser Ser Pro Pro Leu Leu Trp
1 5 1015
Asp Trp Gly Asp His Ala Ala Thr Gly Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ala
202530
Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Glu Arg Glu Ala Lys Arg Ala Arg Ala
354045
Gly Glu Asp Arg Gly Gly Gly Glu Leu Arg Cys Gln Val Glu Gly Cys
505560
Gly Leu Asp Leu Ser Arg Val Lys Asp Tyr His Arg Lys His Arg Val
65707580
Cys Glu Ala His Thr Lys Ser Pro Arg Val Ile Val Ala Gly Gln Glu
859095
Arg Arg Phe Cys Gln Gln Cys Ser Arg Phe His Ala Leu Ser Glu Phe
100 105 110
Asp Gln Lys Lys Arg Ser Cys Arg Arg Arg Leu Ser Asp His Asn Ala
115 120 125
Arg Arg Arg Lys Pro Gln Pro Asp Ala Phe Thr Phe Ala Ser Ala Lys
130 135 140
Leu Pro Ser Thr Leu Phe Asp Asp Arg Arg Gln Ile Ser Phe Val Trp
145 150 155 160
Asn Lys Ala Pro Val Ser His Val Arg Pro Phe Thr Ser Pro Trp Asp
165 170 175
Ser Ser Ser Asp Leu Lys Pro Pro Tyr Ala Lys Glu Ile Ser Asp Val
180 185 190
Ser Thr Lys Val Gly Thr Ile Thr Gly Gln Val His Leu Asp Lys Ser
195 200 205
His Met Phe Asn Ala Ile Pro Thr Leu Ser His Gly Lys Asp Glu Pro
210 215 220
Trp Pro Met Lys Gly Leu Asp Met Ser Ile Ser Ala Ser Lys Phe Asp
225 230 235 240
Gly Ala Ala Asp Leu Gln His Ala Leu Ser Leu Leu Ser Ala Gly Ala
245 250 255
Cys Gly Leu Pro Asp Ser Val His Gln Thr Ser Cys Ile Ile Gln Phe
260 265 270
Asn Gly Ala Ser Glu Asn Ser Ser Asp Leu His Val Thr His Gly Arg
275 280 285
Asn Ser Gly Pro Ala Ser Cys Ala Asp Ala Gln His Ile Ala Ala Gln
290 295 300
Pro Gln Ser Gln Leu Phe His Phe Thr Thr Asp Thr Gly Asn Thr Val
305 310 315 320
Tyr Glu Pro Ser Phe Phe Gly Val Asn Gln Ile Asn
325 330
<210> 2
<211> 999
<212> DNA
<213> Zea manys L
<400> 2
atggagtgga cggccccgaa gcccgcctca tcgcctcccc tcctctggga ctggggagac 60
cacgccgcca cgggctcggg ctcctccagc gacgccccgg cgcggcgcgg cgggaaggag 120
cgggaggcga agcgtgccag ggccggcgag gaccgcgggg gaggtgagct gaggtgccag 180
gtcgaggggt gcggattgga cctcagcagg gtcaaggact accaccgtaa gcaccgcgtc 240
tgcgaggccc acaccaagtc cccccgcgtc atcgtcgccg gccaggagcg ccggttctgc 300
cagcagtgca gccgattcca tgcgctgtca gagtttgatc agaagaagag gagctgcagg 360
aggcgtctgt ctgatcacaa tgcccgccgc cggaagcctc agccagatgc attcaccttc 420
gcctctgcaa agctgccttc gacattgttt gatgataggc ggcaaataag ttttgtctgg 480
aataaagctc ctgttagcca tgtaagaccc ttcacttctc catgggacag ctcatctgac 540
ttaaagcccc cttatgcaaa ggaaataagt gatgtatcaa caaaagttgg gacaattact 600
ggacaagttc atttggataa atctcacatg ttcaatgcta ttccaacact tagccatggc 660
aaagatgagc cttggccaat gaaaggtctg gacatgtcta tatctgcttc aaaattcgat 720
ggagcagcgg atcttcagca tgctctctct cttctgtcag ccggcgcttg tggactgcct 780
gattctgtac atcaaacatc ttgcattatc caattcaatg gtgccagcga gaacagcagt 840
gaccttcatg taacgcatgg caggaactct ggtccagcat catgcgccga tgcgcagcat 900
atagctgccc agcctcagtc tcagctgttt cattttacca cagataccgg caatactgtt 960
tatgagccca gtttctttgg tgtaaaccag ataaattaa 999
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 3
agctcatctg acttaaagcc cc 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 4
ttcattggcc aaggctcatc t 21
<210> 5
<211> 155
<212> DNA
<213> Zea mays L
<400> 5
agctcatctg acttaaagcc cccttatgca aaggaaataa gtgatgtatc aacaaaagtt 60
gggacaatta ctggacaagt tcatttggat aaatctcaca tgttcaatgc tattccaaca 120
cttagccatg gcaaagatga gccttggcca atgaa 155
<210> 6
<211> 996
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 6
atggagtgga cggccccgaa gcccgcctca tcgcctcccc tcctctggga ctggggagac 60
cacgccgcca cgggctcggg ctcctccagc gacgccccgg cgcggcgcgg cgggaaggag 120
cgggaggcga agcgtgccag ggccggcgag gaccgcgggg gaggtgagct gaggtgccag 180
gtcgaggggt gcggattgga cctcagcagg gtcaaggact accaccgtaa gcaccgcgtc 240
tgcgaggccc acaccaagtc cccccgcgtc atcgtcgccg gccaggagcg ccggttctgc 300
cagcagtgca gccgattcca tgcgctgtca gagtttgatc agaagaagag gagctgcagg 360
aggcgtctgt ctgatcacaa tgcccgccgc cggaagcctc agccagatgc attcaccttc 420
gcctctgcaa agctgccttc gacattgttt gatgataggc ggcaaataag ttttgtctgg 480
aataaagctc ctgttagcca tgtaagaccc ttcacttctc catgggacag ctcatctgac 540
ttaaagcccc cttatgcaaa ggaaataagt gatgtatcaa caaaagttgg gacaattact 600
ggacaagttc atttggataa atctcacatg ttcaatgcta ttccaacact tagccatggc 660
aaagatgagc cttggccaat gaaaggtctg gacatgtcta tatctgcttc aaaattcgat 720
ggagcagcgg atcttcagca tgccctgagc ctgctcagcg ccggcgcttg tggactgcct 780
gattctgtac atcaaacatc ttgcattatc caattcaatg gtgccagcga gaacagcagt 840
gaccttcatg taacgcatgg caggaactct ggtccagcat catgcgccga tgcgcagcat 900
atagctgccc agcctcagtc tcagctgttt cattttacca cagataccgg caatactgtt 960
tatgagccca gtttctttgg tgtaaaccag ataaat 996
