第一、技术领域
本发明涉及生物反应器领域，尤其是涉及一种植物组织培养反应器及其放大培养方法。
第二、背景技术
植物组织培养的主要是将剪接植物器官或组织作为外植体，接种在人工配置的培养基中，配合良好的营养条件、激素条件、温度条件与光照条件等，通过无菌培养的手段，使得外植体经过脱分化形成愈伤组织，再经过再分化形成组织或器官，经过培养发育成一颗完整的植株。
生物反应器是大规模细胞悬浮培养的核心设备，为细胞生长提供适宜的环境，能够有效增加细胞单位体积的培养密度。悬浮培养有利于植物细胞均匀地接受营养物质、气体、光照等。
目前，在人工植物组织培养过程中，均采用人工剪切再分装下级放大培养，整个过程需要人为介入，极大增加了培养基液污染的风险，其生产效率低下，且不利于自动化控制，因此，还有改善的空间。
第三、发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种植物组织培养反应器，实现了植物组织在反应器内部剪切和反应器间的无菌转移，不需人为介入，减少污染的风险，且提高了生产效率的优点。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种植物组织培养反应器，其特征在于，包括种子罐(1)、一级放大培养罐(2)和二级放大培养罐(3)，所述种子罐(1)通过无菌管路与一级放大培养罐(2)连通，所述一级放大培养罐(2)通过无菌管路与二级放大培养罐(3)连通，所述种子罐(1)、一级放大培养罐(2)、二级放大培养罐(3)的顶部分别设有种子罐搅拌装置(4)、一级放大搅拌装置(5)和二级放大搅拌装置(7)，所述一级放大培养罐(2)底部转动连接有剪切装置(6)，所述剪切装置(6)上设有一级放大剪切桨叶(10)，所述一级放大剪切桨叶(10)与一级放大搅拌装置(5)之间留有距离。
本发明进一步设置为：所述一级放大剪切桨叶(10)包括背面(12)和正面刀口(13)，当种子罐搅拌装置(4)正转时，所述背面(12)顺时针旋转，当种子罐搅拌装置(4)反转时，所述正面刀口(13)逆时针旋转。
种子罐集成植物组织培养和植物组织剪切于一体，植物组织培养时种子罐搅拌装置正转，使得背面发生转动，使得搅拌较为均匀，植物组织培养效果更佳;当种子罐搅拌装置反转时，正面刀口不会对植物组织形成损伤，植物组织剪切时搅拌快速反转，一级放大剪切桨叶的正面刀口高速切断植物组织，提高了生产的效率，且一级放大剪切桨叶具有三层桨叶均匀分布，一级放大剪切桨叶高度分层有利于提高植物组织剪切效率。
本发明分为种子罐、一级放大培养罐和二级放大培养罐三级放大培养，三级放大培养实现植物组织无菌管路转移，无需人工剪切植物组织和转移，极大提高植物组织放大培养效率，减少组织细胞的损伤率和培养载体的污染风险。
本发明进一步设置为：所述背面(12)呈凹陷钝状，所述正面刀口(13)呈锋利状。
通过一级放大剪切桨叶的背面呈凹陷钝状，且背面比较钝，减少一级放大剪切桨叶的背面损伤植物细胞;通过一级放大剪切桨叶的正面刀口呈锋利状，可迅速切断植物组织，提高了生产效率。
本发明进一步设置为：所述一级放大搅拌装置(5)包括一级放大搅拌桨叶(9)和一级放大搅拌轴。
当植物组织在一级放大培养罐培养时，由于一级放大搅拌桨叶与一级放大剪切桨叶分开运行，使得一级放大搅拌桨叶可用于正常组织细胞的培养和剪切时下沉植物组织，一级放大剪切桨叶位于一级放大培养罐底部有利于提高剪切效率。
本发明进一步设置为：二级放大搅拌装置(7)包括二级放大搅拌桨叶(11)和二级放大搅拌轴。
本发明还提供了一种植物组织放大培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将培育好的植物组织细胞置于种子罐(1)内进行自动化培养，培育至7～10CM长度的植物组织，种子罐(1)的参数设置为温度35～37℃，转速200～600rpm/min，溶氧量40%～60%，pH值6.2～7.2，空气、氧气流量为0.2～0.4L/min，0.05～0.14L/min;
S2.当植物组织的长度培育至7～10CM时，开启种子罐搅拌装置(4)高速反转，搅拌速度为1000～3000rpm/min，搅拌时间5～10min，使得植物组织的长度为1～2CM，然后通过无菌管路转移至一级放大培养罐(2)进行自动化培养，培育至7～10CM长度的植物组织，一级放大培养罐(2)的参数设置为温度35～37℃，转速400～600rpm/min，溶氧量40%～50%，pH值6.8～7.4，空气、氧气流量为0.2～0.4L/min，0.05～0.14L/min;
S3.植物组织在一级放大培养罐(2)自动化培养后，开启剪切装置(6)，植物组织在一级放大搅拌桨叶(9)搅拌下沉，搅拌10～15min，搅拌速度100～300rpm/min，使得一级放大剪切桨叶(10)上的正面刀口(13)剪切植物组织，剪切后的植物组织长度为1～2CM，然后植物组织通过无菌管路进入至含有培养基液的二级放大培养罐(3)放大培养成成品植株。
本发明增加通气(即存在更快速的气体交换)，具体为增加氧气、空气，能提高培养中的细胞的生长效率，用于植物组织培养的生物反应器在进口处以0.2～0.4L/min，0.05～0.14L/min的空气、氧气流量提供气体交换，提高了生产效率，且当种子罐和一级放大培养罐的pH值分别为6.2～7.2、6.8～7.4时，提高代谢产物质量，减少了组织细胞的损伤率。
本发明进一步设置为：所述步骤S3中的培养基液包括以下质量百分比的原料：蔗糖10%～15%、FeSO4 5%～10%、NH4NO310%～15%、赖氨酸2%～5%、天冬氨酸10%～15%、L-蛋氨酰基甘氨酸盐酸盐4%～9%和去离子水10%～30%。
植物细胞在经过多次传代后，植物细胞的活性会下降，通过在二级放大培养罐加入改善的培养基液，使得进入二级放大培养罐的植物细胞生物活性增强，使得培养得到的植物细胞效果较佳。
本发明进一步设置为：所述步骤S3中的培养基液包括以下质量百分比的原料：蔗糖12%、FeSO4 6%、NH4NO312%、赖氨酸3%、天冬氨酸14%、L-蛋氨酰基甘氨酸盐酸盐5%和去离子水28%。
本发明进一步设置为：所述植物组织选自根细胞、芹菜细胞、藻类细胞、胡萝卜细胞和烟草细胞。
本发明进一步设置为：所述植物组织选自藻类细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供的一种植物组织培养反应器，实现了植物组织在反应器内部剪切和反应器间的无菌转移，无需人为操作，降低了生产成本，提高了生产效率;
2.本发明提供的一种植物组织放大培养方法，通过温度，转速，溶氧量，pH值，空气、氧气流量等参数设置，减少植物细胞的损伤程度;
3.本发明提供的一种植物组织放大培养方法，培养基液可提高植物细胞的生物活性，使得培养得到的植物细胞效果较佳。
第四、附图说明
图1为本发明植物组织培养反应器结构示意图;
图2为本发明一级放大剪切桨叶结构示意图。
图中：1、种子罐;2、一级放大培养罐;3、二级放大培养罐;4、种子罐搅拌装置;5、一级放大搅拌装置;6、剪切装置;7、二级放大搅拌装置;8、种子罐搅拌桨叶;9、一级放大搅拌桨叶;10、一级放大剪切桨叶;11、二级放大搅拌桨叶;12、背面;13、正面刀口。
第五、具体实施方式
以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。
在以下实施例和对比例中，原料均可以通过商业渠道进行购买。
实施例1、本发明的植物组织培养反应器
根据图1所示，本发明的植物组织培养反应器包括种子罐1、一级放大培养罐2和二级放大培养罐3，种子罐1的底部通过无菌管路与一级放大培养罐2侧边相连通，一级放大培养罐2的底部通过无菌管路与二级放大培养罐3的侧边连通，种子罐1、一级放大培养罐2、二级放大培养罐3的顶部分别设有种子罐搅拌装置4、一级放大搅拌装置5和二级放大搅拌装置7，一级放大培养罐2底部转动连接有剪切装置6。
根据图1和图2所示，剪切装置6上设有一级放大剪切桨叶10，一级放大剪切桨叶10与一级放大搅拌装置5之间留有距离，一级放大剪切桨叶10延伸方向与一级放大搅拌装置5延伸方向呈夹角，一级放大剪切桨叶,10包括背面12和正面刀口13，背面12呈凹陷钝状，正面刀口13呈锋利状，当种子罐搅拌装置4正转时，背面12发生顺时针旋转，当种子罐搅拌装置4反转时，正面刀口13逆时针旋转，高速切断植物组织。
种子罐搅拌装置4、一级放大搅拌装置5和二级放大搅拌装置7的设置方向相互平行，分别竖直伸至种子罐1、一级放大培养罐2和二级放大培养罐3的内部，种子罐搅拌装置4包括种子罐搅拌桨叶8和种子罐搅拌轴，一级放大搅拌装置5包括一级放大搅拌桨叶9和一级放大搅拌轴，二级放大搅拌装置7包括二级放大搅拌桨叶11和二级放大搅拌轴。
植物组织培养反应器侧壁上设有开口，使得可以添加去离子水等溶剂，调节pH值，调节空气、氧气流量、溶氧量等参数值。
实施例2、本发明的植物组织放大培养方法
本发明的植物组织放大培养方法，包括以下步骤：
S1.将人工培育的芹菜植物剪切至长度1～2CM，置于种子罐(1)内进行自动化培养，培育至7CM长度的植物组织，种子罐(1)的参数设置为温度35～37℃，转速200rpm/min，溶氧量40%，pH值6.2，空气、氧气流量为0.2L/min，0.05L/min;
S2.当植物组织的长度培育至7CM时，开启种子罐搅拌装置(4)高速反转，搅拌速度为1000rpm/min，搅拌时间5min，使得植物组织的长度为1～2CM，然后通过无菌管路转移至一级放大培养罐(2)进行自动化培养，培育至8CM长度的植物组织，一级放大培养罐(2)的参数设置为温度35～37℃，转速400rpm/min，溶氧量50%，pH值6.8，空气、氧气流量为0.2L/min，0.1L/min;
S3.植物组织在一级放大培养罐(2)自动化培养后，开启剪切装置(6)，植物组织在一级放大搅拌桨叶(9)搅拌下沉，搅拌10min，搅拌速度100rpm/min，使得一级放大剪切桨叶(10)上的正面刀口(13)剪切植物组织，剪切后的植物组织长度为1～2CM，然后植物组织通过无菌管路进入至含有培养基液的二级放大培养罐(3)放大培养成成品植株;
其中步骤S3中的培养基液包括以下质量百分比的原料：蔗糖10%、FeSO4 5%、NH4NO310%、赖氨酸2%、天冬氨酸10%、L-蛋氨酰基甘氨酸盐酸盐4%和去离子水10%。
实施例3、本发明的植物组织放大培养方法
本发明的植物组织放大培养方法，包括以下步骤：
S1.将人工培育的藻类植物剪切至长度1～2CM，置于种子罐(1)内进行自动化培养，培育至8CM长度的植物组织，种子罐(1)的参数设置为温度35～37℃，转速400rpm/min，溶氧量50%，pH值6.6，空气、氧气流量为0.3L/min，0.1L/min;
S2.当植物组织的长度培育至8CM时，开启种子罐搅拌装置(4)高速反转，搅拌速度为2000rpm/min，搅拌时间8min，使得植物组织的长度为1～2CM，然后通过无菌管路转移至一级放大培养罐(2)进行自动化培养，培育至8CM长度的植物组织，一级放大培养罐(2)的参数设置为温度35～37℃，转速500rpm/min，溶氧量45%，pH值7.0，空气、氧气流量为0.3L/min，0.05L/min;
S3.植物组织在一级放大培养罐(2)自动化培养后，开启剪切装置(6)，植物组织在一级放大搅拌桨叶(9)搅拌下沉，搅拌15min，搅拌速度200rpm/min，使得一级放大剪切桨叶(10)上的正面刀口(13)剪切植物组织，剪切后的植物组织长度为1～2CM，然后植物组织通过无菌管路进入至含有培养基液的二级放大培养罐(3)放大培养成成品植株;
其中步骤S3中的培养基液包括以下质量百分比的原料：蔗糖12%、FeSO4 7%、NH4NO313%、赖氨酸4%、天冬氨酸11%、L-蛋氨酰基甘氨酸盐酸盐7%和去离子水25%。
实施例4、本发明的植物组织放大培养方法
本发明的植物组织放大培养方法，包括以下步骤：
S1.将人工培育的胡萝卜剪切至长度1～2CM，置于种子罐(1)内进行自动化培养，培育至10CM长度的植物组织，种子罐(1)的参数设置为温度35～37℃，转速600rpm/min，溶氧量60%，pH值7.2，空气、氧气流量为0.4L/min，0.14L/min;
S2.当植物组织的长度培育至10CM时，开启种子罐搅拌装置(4)高速反转，搅拌速度为3000rpm/min，搅拌时间10min，使得植物组织的长度为1～2CM，然后通过无菌管路转移至一级放大培养罐(2)进行自动化培养，培育至8CM长度的植物组织，一级放大培养罐(2)的参数设置为温度35～37℃，转速600rpm/min，溶氧量50%，pH值7.4，空气、氧气流量为0.4L/min，0.14L/min;
S3.植物组织在一级放大培养罐(2)自动化培养后，开启剪切装置(6)，植物组织在一级放大搅拌桨叶(9)搅拌下沉，搅拌15min，搅拌速度300rpm/min，使得一级放大剪切桨叶(10)上的正面刀口(13)剪切植物组织，剪切后的植物组织长度为1～2CM，然后植物组织通过无菌管路进入至含有培养基液的二级放大培养罐(3)放大培养成成品植株;
其中步骤S3中的培养基液包括以下质量百分比的原料：蔗糖15%、FeSO410%、NH4NO315%、赖氨酸5%、天冬氨酸15%、L-蛋氨酰基甘氨酸盐酸盐9%和去离子水30%。
实施例5、本发明的植物组织放大培养方法
本发明的植物组织放大培养方法，包括以下步骤：
S1.将人工培育的藻类植物剪切至长度1～2CM，置于种子罐(1)内进行自动化培养，培育至7CM长度的植物组织，种子罐(1)的参数设置为温度35～37℃，转速550rpm/min，溶氧量45%，pH值6.8，空气、氧气流量为0.35L/min，0.12L/min;
S2.当植物组织的长度培育至7CM时，开启种子罐搅拌装置(4)高速反转，搅拌速度为2500rpm/min，搅拌时间8min，使得植物组织的长度为1～2CM，然后通过无菌管路转移至一级放大培养罐(2)进行自动化培养，培育至7CM长度的植物组织，一级放大培养罐(2)的参数设置为温度35～37℃，转速480rpm/min，溶氧量48%，pH值7.2，空气、氧气流量为0.3L/min，0.08L/min;
S3.植物组织在一级放大培养罐(2)自动化培养后，开启剪切装置(6)，植物组织在一级放大搅拌桨叶(9)搅拌下沉，搅拌15min，搅拌速度270rpm/min，使得一级放大剪切桨叶(10)上的正面刀口(13)剪切植物组织，剪切后的植物组织长度为1～2CM，然后植物组织通过无菌管路进入至含有培养基液的二级放大培养罐(3)放大培养成成品植株;
其中步骤S3中的培养基液包括以下质量百分比的原料：蔗糖12%、FeSO4 6%、NH4NO312%、赖氨酸3%、天冬氨酸14%、L-蛋氨酰基甘氨酸盐酸盐5%和去离子水28%。
实施例6、本发明的植物组织放大培养方法
本发明的植物组织放大培养方法，包括以下步骤：
S1.将人工培育的烟草细胞剪切至长度1～2CM，置于种子罐(1)内进行自动化培养，培育至7CM长度的植物组织，种子罐(1)的参数设置为温度35～37℃，转速550rpm/min，溶氧量45%，pH值6.8，空气、氧气流量为0.35L/min，0.12L/min;
S2.当植物组织的长度培育至7CM时，开启种子罐搅拌装置(4)高速反转，搅拌速度为2500rpm/min，搅拌时间8min，使得植物组织的长度为1～2CM，然后通过无菌管路转移至一级放大培养罐(2)进行自动化培养，培育至7CM长度的植物组织，一级放大培养罐(2)的参数设置为温度35～37℃，转速480rpm/min，溶氧量48%，pH值7.2，空气、氧气流量为0.3L/min，0.08L/min;
S3.植物组织在一级放大培养罐(2)自动化培养后，开启剪切装置(6)，植物组织在一级放大搅拌桨叶(9)搅拌下沉，搅拌15min，搅拌速度270rpm/min，使得一级放大剪切桨叶(10)上的正面刀口(13)剪切植物组织，剪切后的植物组织长度为1～2CM，然后植物组织通过无菌管路进入至含有培养基液的二级放大培养罐(3)放大培养成成品植株;
其中步骤S3中的培养基液包括以下质量百分比的原料：蔗糖12%、FeSO4 6%、NH4NO312%、赖氨酸3%、天冬氨酸14%、L-蛋氨酰基甘氨酸盐酸盐5%和去离子水28%。
对比例1、本发明的植物组织放大培养方法
与实施例5相同，与实施例5区别仅在于：步骤S3中的培养基液不包括L-蛋氨酰基甘氨酸盐酸盐，其他参数与实施例5类似。
对比例2、本发明的植物组织放大培养方法
与实施例5相同，与实施例5区别仅在于：种子罐和一级放大培养罐的pH值分别为6.0和6.5，其他参数与实施例5类似。
对比例3、本发明的植物组织放大培养方法
与实施例5相同，与实施例5区别仅在于：种子罐和一级放大培养罐的pH值分别为7.5和7.6，其他参数与实施例5类似。
试验例一、藻类细胞的活性测定
取本发明经过种子罐、一级放大培养罐和二级放大培养罐放大培养的藻类细胞用胰酶消化对数期细胞然后接种到96孔板中，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至6×104/ml，过夜培养待贴壁后，分别在孔板中加入实施例2～6及对比例1～3的培养基液1ml，设置6个复孔，12h后，再加入10μl MTT(5mg/ml，即0.5%MTT)，37℃孵育4h后吸去培养基和MTT，加入DMSO，在摇床上室温反应30min，之后用化学发光仪在570nm波长处测定吸光值，并且本试验设置一个空白对照组(添加去离子水)，结果如表1所示。
组别OD值存活率实施例20.6140.952实施例30.6200.950实施例40.6180.959实施例50.6250.961实施例60.6160.954对比例10.5480.654对比例20.6060.943对比例30.6090.942空白对照组0.5150.591
从表1的数据可知，实施例2～5添加了L-蛋氨酰基甘氨酸盐酸盐的培养基液，OD值较对比例1～3较高，植物细胞的存活率较高，其中以藻类细胞的存活率最高，可高达96.1%;
与实施例5相比，对比例1不添加L-蛋氨酰基甘氨酸盐酸盐的培养基液，藻类细胞的OD值和存活率较低，但仍然比空白对照组的存活率高，说明L-蛋氨酰基甘氨酸盐酸盐可以提高植物细胞的OD值和存活率;
与实施例5相比，对比例2或对比例3中降低或提高种子罐和一级放大培养罐的pH值，会影响到植物细胞的OD值和存活率，说明pH值的范围对在植物组织放大培养方法中发挥着至关重要的作用。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
