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一种二聚体二氢杨梅素及其制备方法和作为自由基清除剂的用途

2021-04-25 17:45:21

一种二聚体二氢杨梅素及其制备方法和作为自由基清除剂的用途

  技术领域

  本发明属于天然产物应用领域,特别涉及一种二聚体二氢杨梅素及其制备方法和作为自由基清除剂的用途。

  背景技术

  二氢杨梅素为葡萄科蛇葡萄属中显齿蛇葡萄植物(藤茶)的主要活性成分,具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、消炎、抗肿瘤等多种奇特功效,对人类的呼吸系统、消化系统、心血管系统、神经系统、免疫系统和内分泌系统等功能性疾病的预防和治疗均有重要意义。

  二聚体二氢杨梅素是由2分子二氢杨梅素通过化学键聚合而成的一种稳定的化合物,对于其制备方法和用途,目前没有研究报道。

  发明内容

  为了克服现有技术中存在的缺点和不足,本发明的首要目的在于提供一种二聚体二氢杨梅素。

  本发明的再一目的在于提供一种上述二聚体二氢杨梅素的制备方法。

  本发明的又一目的在于提供上述二聚体二氢杨梅素作为自由基清除剂的用途。

  本发明目的通过以下技术方案实现:

  一种二聚体二氢杨梅素,所述二聚体二氢杨梅素具有如下式(Ⅰ)所示结构:

  

  上述的一种二聚体二氢杨梅素的制备方法,包括以下操作步骤:

  (1)称取纯度大于99%的二氢杨梅素(DMY),溶于二甲基亚砜(DMSO)溶液中,制成浓度为0.5-5.0mol/L的DMY储备液;

  (2)用pH值7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)将DMY储备液稀释至0.01-1.0mol/L;

  (3)将步骤(2)所得稀释液置于37℃恒温生化培养箱中温育72h-140h;

  (4)将经过步骤(3)温育后的溶液浓缩至原体积的1/3-2/3,然后加入2-3倍浓缩液体积的甲醇,去掉溶液中析出的磷酸盐;重复本步骤操作2-3次;(尽量使溶液中的磷酸盐全部去除)

  (5)在经过步骤(4)去除磷酸盐的溶液中,按溶液体积的1/3-2/3加入乙酸乙酯,萃取去掉溶液中的二甲基亚砜(DMSO);

  (6)浓缩、干燥上述步骤(5)去除磷酸盐和二甲基亚砜后的溶液即得二聚体二氢杨梅素混合物;

  (7)应用制备型HPLC对二聚体二氢杨梅素混合物进行制备,以二聚体二氢杨梅素为目标产物,得到纯度超过99%的二聚体二氢杨梅素。

  步骤(3)所述温育的时间为132h。

  步骤(7)所述应用制备型HPLC对二聚体二氢杨梅素混合物进行制备的具体步骤是:使用C18制备柱,上样量600μL,流速8ml/min,检测波长为292nm,流动相为甲醇-水溶液,梯度洗脱,洗脱程序为:0-10min,90-80%水;10-20min,80-70%水;20-40min,70-50%水;40-55min,50-90%水,55-60min,90%水;制备时的柱温为30℃,测定波长为292nm;制备时收集12-17分钟时的溶液,冷冻干燥后即得到纯度超过99%的二聚体二氢杨梅素。

  上述二聚体二氢杨梅素作为自由基清除剂的用途,作为自由基清除剂可以应用在食品、药品和化妆品领域中。

  本发明的原理是:

  在中性或弱碱性条件下(pH 7.4),DMY与分子氧反应生成DMY自由基(DMY·,DMYradical和超氧化物自由基(·O2-)。超氧化物自由基可与下一分子DMY反应生成DMY·和过氧化氢(H2O2)。DMY·又可以与分子氧反应生成DMY醌(DMY quinone)。DMY醌和另一分子DMY反应生成DMY二聚体。两分子的DMY醌也可以发生聚合生成二聚体(DMY dimer)。而另一种可能的形成机制为分子氧直接产生超氧化物自由基,超氧化物自由基与一分子DMY反应生成DMY·和H2O2。DMY·与另一分子的DMY反应生成DMY醌和超氧化物自由基,进而形成二聚体(如图1)。二聚体二氢杨梅素是由2分子二氢杨梅素通过共价键结合而成的一个化合物,和其它黄酮类化合物一样,分子结构上同样具有抗氧化物质所拥有的3',4'邻位二羟基结构。另外,它由二氢杨梅素分子聚合一起,较二氢杨梅素更稳定,在开发利用过程中作为抗氧化剂使用时的稳定性更好。

  本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:

  本发明二聚体二氢杨梅素是由2分子的二氢杨梅素通过共价键的方式结合而成的聚合物,是研究二氢杨梅素氧化分解及其代谢途径所需要的一种重要原料;另外二聚体二氢杨梅素在食品、药品和化妆品领域中可以起到抗氧化作用。目前尚无关于该二聚体制备方法和应用的报道。

  附图说明

  图1为DMY降解产生DMY二聚体的可能原理图。

  图2为不同温育时间下,二氢杨梅素在PBS溶液中的高效液相色谱图(37℃,pH7.4)。

  图3为在PBS(37℃,pH 7.4)溶液中,二氢杨梅素和其降解产物的高效液相色谱图。

  图4为二氢杨梅素主要降解产物的二级质谱图和可能的裂解方式。

  图5为HPLC制备二聚体二氢杨梅素时的收集图。

  图6为二聚体二氢杨梅素混合物对ABTS自由基的清除作用图。

  具体实施方法

  下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。

  实施例中,实验方法如下:

  1、HPLC对二氢杨梅素的降解行为进行检测方法:HPLC检测采用装备AgilentZORBAX SB-C18色谱柱(150×4.6mm,3.5μm)的Agilent 1260高效液相色谱仪。HPLC的工作条件为:0.1%乙酸水(A)和甲醇(B)为流动相,采用梯度洗脱,流速为1ml/min,柱温为35℃,进样体积为20μL,检测波长为292nm,洗脱程序为:0-5min 90%A,5-10min 90%-70%A,10-20min 70%A,20-25min

  70%-90%A,25-30min 90%A。

  2、HPLC-QTOF-MS/MS对二氢杨梅素降解产物进行了确定和推导:采用装备AgilentEclipse Plus C18柱(2.1×100mm,1.8μm)的ekspert ultraLC 110液相系统(AB-SCIEX,USA)对温育后的DMY溶液进行色谱分离。流动相由0.1%甲酸水(A)和甲醇(B)组成,采用梯度洗脱,流速为0.3ml/min,柱温为30C。洗脱程序为:0-5min 90%A,5-10min 90%-70%A,10-15min 70%-50%A,15-20min50%A,20-25min 50%-90%A,25-30min 90%A。进样量为5μL。配备有电喷雾电离源(ESI)的Triple TOF 5600三重四级杆质谱仪(AB-SCIEX,USA)在负离子扫描模式下操作。质谱采集的质量数范围为m/z 100-2000。质谱参数如下:去溶剂化温度400C,雾化气50Psi,辅助气50Psi;喷雾电压-4500V。使用PeakView软件(AB-SCIEX,USA)进行数据分析。

  3、ABTS自由基清除能力测定

  按照ABTS总抗氧化能力试剂盒方法要求操作,测定DMY(二氢杨梅素)、TF(总黄酮)、DDPsM(二氢杨梅素降解产物混合物)和阳性对照Vc(维生素C)的ABTS自由基清除能力,平行测定三份。样品对ABTS自由基清除能力的结果以TEAC值(mmol/L Trolox)表示,TEAC值高,则代表样品清除ABTS自由基的能力强。

  实施例1:

  准确称取10g纯度大于99%的二氢杨梅素(DMY)溶于二甲基亚砜(DMSO)溶液中,制成浓度为2.0mol/L的DMY储备液。用磷酸盐缓冲液PBS(pH 7.4)将其稀释至0.5mol/L,置于37℃恒温生化培养箱中进行温育72小时。之后,用旋转蒸发仪将上述温育后的溶液浓缩至原体积的1/2,然后加入2-3倍浓缩液体积的甲醇,去掉溶液中析出的磷酸盐。同时,在去除磷酸盐的溶液中,按溶液体积的1/2加入乙酸乙酯,萃取去掉溶液中的二甲基亚砜(DMSO)。浓缩干燥上述去除磷酸盐和二甲基亚砜后的溶液即得二聚体二氢杨梅素混合物。

  温育过程中,分别在不同时间内取出1ml DMY的PBS稀释液与3ml冷甲醇(-20℃)混合后,并在-20℃冰箱中静置30min,然后于4C 1200g离心10min。取上清液过滤膜后,用HPLC检测其降解行为,并用HPLC-QTOF-MS/MS确定降解产物的结构。

  根据HPLC对二氢杨梅素在PBS中的降解行为的检测图谱可以看出(图2),DMY在不同时间的温育实验中,DMY的峰面积(浓度)随着温育时间的延长逐渐降低(温育72小时,DMY的降解率为33%),说明DMY在PBS溶液中均发生了降解,并且随着时间的延长,降解程度增加。

  另外,从适当放大的检测图谱(图3)可以看到,DMY经温育实验后,HPLC检测图谱中出现了多个DMY之外的色谱峰(DMY分解产物),说明DMY随着时间的降解产生了多个降解产物;另外,在所有降解产物中有一个居于主导地位。

  进一步,根据峰面积的变化,对DMY在PBS溶液中72h的变化趋势进行拟合,发现其降解方程符合一级动力学模型,相关参数见表1。由二氢杨梅素的半衰期为5.5天可以看出,要想制备较高得率的二聚体二氢杨梅素,温育时间一般可设置为5.5天(132小时)。

  表1二氢杨梅素在PBS(37C,pH 7.4)溶液中的降解特性(72h)

  

  根据HPLC-QTOF-MS/MS对二氢杨梅素降解产物进行确定和推导的实验可以看出(表2),二氢杨梅素的主要降解产物的保留时间为18.49min,负离子模式下m/z为637.0813Da,比母体化合物二氢杨梅素高318Da,这暗示二聚体的形成。

  另外,从图4也可以看出,Q-TOF MS2碎片产生m/z为619.0747,511.0532,178.9982和151.0031的产物离子。m/z为619.0747的产物离子是由于脱羟基产生的,m/z为151.0033的产物离子是由于RDA裂解产生的。因此,可以确认主要降解产物为DMY为经氧化聚合产生的二聚体,其结构如下式(Ⅰ)所示:

  

  表2PBS中二氢杨梅素主要降解产物的MS数据

  

  实施例2:

  准确称取10g纯度大于99%的二氢杨梅素(DMY)溶于二甲基亚砜(DMSO)溶液中,制成浓度为5.0mol/L的DMY储备液。用磷酸盐缓冲液PBS(pH 7.4)将其稀释至1.0mol/L,置于37℃恒温生化培养箱中进行温育132小时,即得二聚体二氢杨梅素混合物。之后,用旋转蒸发仪将上述温育后的溶液浓缩至原体积的1/2,然后加入2-3倍浓缩液体积的甲醇,去掉溶液中析出的磷酸盐。同时,在去除磷酸盐的溶液中,按溶液体积的1/2加入乙酸乙酯,萃取去掉溶液中的二甲基亚砜(DMSO)。余下所得溶液即为二聚体二氢杨梅素混合物溶液。之后应用制备型HPLC对上述混合物进行制备,以二聚体二氢杨梅素为目标产物,可得纯度超过99%以上的二聚体二氢杨梅素。具体制备采用的方法如下:

  制备时,使用C18制备柱,上样量600μL,流速8ml/min,检测波长为292nm,流动相为甲醇(A)-水(B)溶液,梯度洗脱(洗脱程序为:0-10min,90-80%B;10-20min,80-70%B;20-40min,70-50%B;40-55min,50-90%B,55-60min,90%B),制备时的柱温为30C,测定波长为292nm。制备时收集12-17分钟时的溶液(图5),冷冻干燥后即为二聚体二氢杨梅素。

  实施例3:

  取一定量的实施例2所得二聚体二氢杨梅素,进行ABTS自由基清除能力实验,其中DMYD、TF和Vc分别代表二聚体二氢杨梅素、藤茶总黄酮和维生素C。

  ABTS自由基阳离子是一种能够稳定存在的绿色物质,在抗氧化物质存在时,ABTS自由基阳离子的产生会被抑制,根据抗氧化物质对ABTS溶液吸光度的影响可以判断其清除自由基的能力,进而反映抗氧化能力。由图6可以看出。各成分对ABTS自由基均有一定的清除能力,并与浓度呈一定的量效关系。当浓度不小于90μg/mL时,二聚体二氢杨梅素和TF对ABTS自由基的清除作用均强于阳性对照Vc。当浓度为210μg/mL时,二聚体二氢杨梅素的自由基清除能力最强,为0.87±0.011TEAC值,高于TF的0.83±0.043TEAC值,说明二聚体二氢杨梅素有较好的清除ABTS自由基的能力。

  实施例4:

  取100公斤茶油毛油,经脱水、脱色、脱臭、脱蜡等环节生产一级茶油(精炼油),按重量比0.5%的比例在一级油中加入实施例2所得二聚体二氢杨梅素0.5公斤,搅拌均匀,灌装即得能防止油脂自动氧化的精制茶油。

  实施例5:

  取100公斤面粉,加入白砂糖、小苏打、食盐等辅料后,按0.5%的比例加入实施例2所得二聚体二氢梅素,经调粉、静置、辊轧、成型后,将饼胚送入烤箱烘烤后,可得含有二聚体二氢杨梅素的饼干,其中饼干中加入的二聚体二氢杨梅素能清除饼干贮藏过程中产生的各类自由基,使饼干贮藏期延长。

  上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

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