检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片及试剂盒与方法

检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片及试剂盒与方法

　　技术领域tt

　　本发明涉及动物医学诊断，特别是涉及一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片、试tt剂盒及方法tt

　　背景技术tt

　　近年来，我国养禽业的发展非常迅速，已成为我国畜牧业的支柱产业之一。可是随着养tt禽业的快速发展，各种内在及外在因素也正严重地威胁着养禽业的健康发展，其中疫病已成tt为威胁养禽业的头号大敌。虽然通过使用疫苗接种及药物控制等手段，使禽类主要传染病的tt防制取得了一定的成效，但在各地鸡场的生产实践中免疫接种过的鸡群仍会不断发生各种疾tt病，其中不容忽视的原因之一就是禽类免疫抑制病。禽免疫抑制病是由单一或多种致病因素tt共同作用，导致鸡只免疫系统受损、免疫功能降低的疾病的总称。引起家禽免疫抑制的病毒tt有鸡传染性贫血病病毒(CAV)、禽白血病病毒(ALV)、网状内皮增生症病毒(REV)、传染性法tt氏囊病病毒(IBDV)、马立克氏病病毒(MDV)等。其中禽淋巴白血病(AL)、鸡传染性贫血病(CIA)tt以及网状内皮增生症(RE)是目前对我国养鸡业危害最为严重的免疫抑制病，与其他鸡病相比，tt它们具备垂直传播、亚临床感染的特性，传统方法诊断困难。在2007年由农业部科技司和兽tt医局立项的农业公益性科技研究专款项目“鸡白血病学的流行病学调查和防控示范性研究”实tt施过程中，崔治中老师进行的血清学调查结果显示：对AB亚群和J亚群ALV感染呈阳性的tt鸡群分别占47.9%和52.8%，个体感染率分别为3.4%和5.7%。而据他2008年统计数据显示：tt我国白羽肉种鸡CIAV抗体阳性率达90%，REV抗体阳性率12.3%，黄羽肉种鸡抗体阳性率tt90%，REV抗体阳性率36.8%。并且在200份病料样品中，ALV、CAV、REV单独或协同感tt染的检出率达10%-6.5%。这一结果表明，上述三种免疫抑制病在我国鸡群中相当普遍。由于ttALV、CIAV、REV及其制备物在灭活的同时其免疫原性会遭到不同程度的破坏，培育无致病tt性的弱毒株亦未取得重要进展，因此至今针对上述三种免疫抑制病仍未研制出临床上有实用tt价值的疫苗，尤其对于ALV和REV来说，由于先天性感染的雏鸡具有的免疫耐受性以及这tt种感染的普遍性，也使的疫苗的应用前景十分暗淡，一旦种鸡感染整个鸡群便会同时感染，tt使养禽业损失惨重。但就目前来看更好的防控手段是及时对鸡群中ALV、CIAV、REV检测tt并净化，切断其垂直传播的途径，以避免该病的扩散。因此，加强便捷、快速、敏感的检测tt手段的研究迫在眉睫。tt

　　现有ALV、CIAV以及REV的检测手段也存在着各种缺陷，不能满足高特异性、大批量tt的样品检测，而基因芯片技术在高通量和准确性等方面具有得天独厚的优势。与传统检测方tt法相比，它可以在1张芯片同时对多个样品进行多种疾病的检测；无需机体免疫应答反应，tttttt能及早诊断，待测样品用量小；能检测病原微生物的耐药性和亚型；极高的灵敏度和可靠性；tt自动化程度高，利于大规模推广应用。这些特点可使兽医工作者在短时间内掌握大量的疾病tt诊断信息。应用基因芯片不仅可以提高疾病诊断的效率，而且可以诊断出疾病的具体类型、tt发病阶段、严重程度和愈后指示。tt

　　因此本课题拟研究开发检测ALV、CAV、REV的基因芯片，能达到同步检测上述三种鸡tt免疫抑制病、并可同步区分ALV E亚群和J亚群的检测方法，为我国鸡免疫抑制病的净化与tt控制提供技术支撑；为大批量样品的检测和大面积的流行病学调查提供快速、平行、灵敏的tt检测手段。tt

　　发明内容tt

　　本发明针对上述领域的空白和需要，提供一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片、tt试剂盒及方法，能够同时检测ALV、CAV、REV这三种病毒并可以同时区分ALV的A、C、Dtt和J亚群，为正确防治疫病提高效率、节约时间。tt

　　一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片，其特征在于：在芯片基质上设置有鸡淋巴tt白血病病毒ALV的四个亚群A亚群、C亚群、D亚群和J亚群、鸡传染性贫血病毒CAV、禽网状tt内皮增生症病毒REV的特异性探针序列，所述特异性探针序列如下：tt

　　鸡淋巴白血病病毒A亚群（A1），TTTTTTTGTCTCAGGGGGAGGCCACACGGTTTCTC；tt

　　鸡淋巴白血病病毒A亚群（A2）,TTTTGGTTGGTCTAGACAGGAGGCCACGCGGTTTC；tt

　　鸡淋巴白血病病毒A亚群（A3）,TTTTGGATGGACTAGACAGGAAGCCACACGGTTCC；tt

　　鸡淋巴白血病病毒A亚群（A4），TTTTTGCTTTCAGATTGGTCCAGGCCGCAACTCAC；tt

　　鸡淋巴白血病病毒C亚群（C1），TTTTGGATGTGTATATTTCGCCCCAAGGGCCACTG；tt

　　鸡淋巴白血病病毒D亚群（D1），TTTTTTTTGGCCGGGAAGAGGTGACACACATCCTC；tt

　　鸡淋巴白血病病毒C亚群（J3），TTCTTAGTCTACAGTCAGCGACCTCGCCATTCCGC；tt

　　鸡淋巴白血病病毒C亚群（J4），CTTAGTCTACAGTCAGCTACCTCTCCCTTCCGCAC；tt

　　鸡传染性贫血病病毒(CAV),TTTTTTTTTGGGCAGTGAATCGGCGCTTAGCCG；tt

　　网状内皮增生症病毒(REV),TTTTTTTTTCTTGCTCGGGGTCGCCGTCCTACA。tt

　　一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片试剂盒，其特征在于包括如下组件：tt

　　（1）上述基因芯片；tt

　　（2）七条引物：tt

　　鸡淋巴白血病病毒ALV的A、C、D、J四个亚群通用上游引物J-U:tt

　　5’-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3’；tt

　　J亚群下游引物J-L:5’-CGAACCAAAGGTAACACACG-3；tt

　　A、C和D亚群通用下游引物Tong:5'-CTGTAGCCATATGCACC-3'；tt

　　CAV上游引物C-U:5’-ACATACCGGTCGGCAGTAGG-3’；tt

　　CAV下游引物C-L:5’-AGCTCGCTTACCCTGTACTC-3’；tt

　　REV上游引物R-U:5’-CTACGGATTCAGTCCGGATC-3’；tt

　　REV下游引物R-L:5’-CATACTGAGCCAATGGTTGTA-3’；tt

　　且J-L、Tong、C-L与R-L的5’端有Cy3荧光标记。tt

　　所述的基因芯片试剂盒，还包括除通用引物和DNA探针之外的PCR扩增所需试剂、杂交tt液、芯片洗液。tt

　　所述杂交液的成分为：3×SSC溶液，25%甲酰胺，0.2%SDS，5×Denhardt溶液。tt

　　所述芯片洗液包括洗液A和洗液B；洗液A的配方为2×SSC，0.2%SDS；洗液B为0.2×SSC。tt

　　所述基因芯片试剂盒，还包括PCR阴性对照模板和阳性对照模板，所述阴性对照模板为tt双蒸水，所述阳性对照模板为CAV参考毒株CUX的质粒DNA。tt

　　上述任一所述的基因芯片试剂盒，所述七条引物混合存放在两个引物管中，；两个引物tt管中的引物及其混合浓度比例为：J-U:J-L:Tong=5:2:3；（C-U+C-L）:（R-U+R-L）=1:3tt

　　一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片检测方法，包括如下步骤：tt

　　（1）提取待测毒株的基因组DNA，tt

　　（2）用如下引物对待测毒株的基因组DNA进行PCR扩增，tt

　　J-U:5’-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3’；tt

　　J-L:5’-CGAACCAAAGGTAACACACG-3；tt

　　Tong:5'-CTGTAGCCATATGCACC-3'；tt

　　C-U:5’-ACATACCGGTCGGCAGTAGG-3’；tt

　　C-L:5’-AGCTCGCTTACCCTGTACTC-3’；tt

　　R-U:5’-CTACGGATTCAGTCCGGATC-3’；tt

　　R-L:5’-CATACTGAGCCAATGGTTGTA-3’；tt

　　所述J-L、Tong、C-L与R-L的5’端有Cy3荧光标记；tt

　　所述PCR扩增分为两组分别进行，tt

　　其中一组PCR扩增采用以下混合引物：其中引物浓度比J-U:J-L:Tong=5:2:3；tt

　　另一组PCR扩增采用以下混合引物：其引物浓度比为：C-U+C-L:R-U+R-L=1:3。tt

　　（3）扩增产物与上述基因芯片杂交，tt

　　（4）杂交后处理及扫描结果。tt

　　所述PCR扩增的体系为2×PCR mix25μl，模板DNA3μl，10μmol/L混合引物7～8μl，加无菌tt双蒸水至50μl；tt

　　PCR反应条件95℃，5min；95℃50S，56℃50S，72℃1min，30个循环；72℃10min。tt

　　在步骤（2）前，先对所述基因芯片进行如下预处理：置于37℃湿盒内固定12h，用双蒸tt水清洗3次，在封闭液中封闭5分钟后离心甩干，4℃保存备用，所封闭液的配方为：0.75%PBStttttt溶液，25%乙醇，0.2%NaBH4；tt

　　步骤（2）中以人工合成的ALV的A C D J亚群、REV的质粒DNA、CAV参考毒株CUX的tt质粒DNA做为阳性对照模板，以双蒸水做为阴性对照模板；tt

　　所述杂交指：向杂交盒内加入300μL双蒸水，将所述基因芯片放入杂交盒内；将PCR扩增tt产物与杂交液以体积比7：8混匀，95℃变性5min后马上冰浴5min，取15μl变性后的混合tt液转移至所述基因芯片反应区，基因芯片连同杂交盒置于42℃湿润条件下杂交过夜；tt

　　所述杂交后处理指：杂交后的基因芯片依次在洗液A：2×SSC、0.2%SDS中于42℃洗涤tt2min，重复洗片2次；洗液B：0.2×SSC中于42℃洗涤2min，重复洗片3次。tt

　　本发明提供一种能够同时检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片，包括该基因芯片的试tt剂盒，以及利用该试剂盒或者基因芯片检测鸡三种免疫抑制病的方法。tt

　　（一）本发明的基因芯片制作过程及优点如下：从Genbank收集CAV REV ALV的A、C、Dtt和J四个亚群各参考毒株的cDNA全基因或包含env高变异区域的基因序列共459条，分别对459tt条序列按CAV REV ALV三种病毒建库，选出每种病毒的代表序列各10条，用DNAStar软件的ttClustal W程序对所选的序列进行比对，找出它们的保守区和变异区。截取所需的目的序列，tt送上海生工生物公司合成目的序列，经测序结果无误。利用Oligo6软件,在变异区对每种病毒tt的序列数据库设计各自的种特异性探针，共设计了针对上述三种病毒的10条特异性探针；借tt助Primer Premier5.0软件在设计出上述10条候选探针序列的高变异区域外侧的保守区设计了7tt条引物，即扩增ALV A、C、D、J的一条通用上游引物，一条J亚群下游引物，一条A、C、Dtt和J亚群通用下游引物；扩增CAV的上下游引物；扩增REV的上下游引物，上述引物均能够对tt所扩增病毒进行特异性地扩增。引物序列见表3。tt

　　利用上述引物对三种病毒的参考毒株的目的DNA序列的合成质粒进行PCR扩增，然后将ttPCR产物分别与杂交液混匀后与点有10条特异性探针的基因芯片杂交、扫描及结果分析。探tt针序列见表2。对扫描结果进行取值，对含有非特异性荧光信号的探针进行阈值设定，结合阈tt值来判定荧光信号是否为特异性杂交信号。tt

　　本发明选取的特异性探针能特异地检测出属于同一亚群的菌株，如表1中没有带星号的菌tt株也能被这些特异性探针捕获出来，本发明的基因芯片可检测的范围包括CAV、REV以及ALVttA、C、D、J四个亚群下的任一菌株，集实用性与高效性于一身，可用于高通量地检测ALV、ttCAV、REV感染情况，为高效率检测或鉴别疫情提供了最关键的方法。tt

　　（二）本发明还提供一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的试剂盒，该试剂盒的特征在于包含tt有本发明提供的上述基因芯片和引物。该试剂盒在具备芯片扫描仪的分子生物学实验室条件tt下，可方便快捷地检测待测鸡群的CAV、REV以及ALV A、C、D、J亚群的感染状况，作为优tt选，在试剂盒中还可以包括除芯片和引物之外的PCR试剂和杂交液，使得该试剂盒更便于使tt用。试剂盒中还包括三种病中的任意一种病毒的含有目的基因的载体质粒DNA作为PCR阳性tttttt对照模板，用于排除假阴性；双蒸水为阴性模板，用于排除污染造成的假阳性。tt

　　（三）本发明还提供了检测鸡三种免疫抑制病病毒的检测方法，该方法主要特征在于采tt用本发明提供的基因芯片及引物。7条引物将待测毒株模板进行扩大若干倍，从而提高了毒株tt的检出灵敏度，同时本研究中还采取了多重PCR体系对上述三种病毒进行同时扩增，检测过tt程既简便又灵敏。tt

　　本发明提供的优化方案是：分别对所有引物对中的下游引物的5’端进行荧光标记，引物tt浓度比为：J-U:J-L:Tong=5:2:3；C-U+C-L:R-U+R-L=1:3；上述引物以多重PCR体系对待测模tt板进行扩增，多重PCR的目的是通过在一个体系中加入多条引物，从而能同时扩增出不同病tt毒的目的序列，为在临床检测中对ALV、CEV、REV的检测以及对ALV的分型提高效率。tt

　　为了提高芯片杂交的准确性，排除假阳性或假阴性，芯片上点有阳性对照探针、阴性对tt照探针。tt

　　综上所述本发明提供了一种检测鸡三种免疫抑制病病毒的基因芯片，同时提供了试剂盒tt与优化的检测方法，能针对多种病原进行高通量、快速、准确的检测，适合于突发传染病病tt原检验，提供的试剂盒使检测方法简便高效，使兽医实验室工作人员能在较短的时间内对感tt染性疾病做出正确诊断，防止传染性疾病传播，提高我国对动物感染性疾病的控制能力，降tt低养殖风险。tt

　　附图说明tt

　　图1：基因芯片对三种病毒检测的有效性评价结果。tt

　　1：CAV毒株；2：REV毒株；3：ALV A亚群毒株；4：ALV C亚群毒株；5：ALV Dtt亚群毒株；6：ALV J亚群毒株。tt

　　图2：基因芯片对多重PCR产物的检测评价结果。tt

　　1：ALV C+J毒株DNA模板等体积混合；2：ALV A+D毒株DNA模板等体积混合；3：ttREV PCR产物与ALV A+DPCR产物等体积混合；4：REV+CAV质粒DNA模板等体积混合。tt图3：基因芯片敏感性检测评价结果。tt

　　4-1：M:Marker，1-5：ALV A亚群毒株DNA模板起始浓度的10-2～10-6倍稀释；4-2：ttM:Marker，1-6：ALV C亚群毒株DNA模板起始浓度的10-2～10-7倍稀释；4-3：M:Marker，tt1-3：ALV D亚群毒株DNA模板起始浓度的10-2～10-4倍稀释；4-4：M:Marker，1-6：ALV Jtt亚群毒株DNA模板起始浓度的10-2～10-7倍稀释。4-5：M:Marker，1-7：REV毒株DNA模tt板起始浓度的10-2～10-8倍稀释；4-6：M:Marker，1-4：CAV毒株模板起始浓度的10-2～10-5倍稀释。tt

　　图4：琼脂糖凝胶电泳敏感性检测评价结果。tt

　　A1-A5：ALV A亚群毒株DNA模板起始浓度的10-2～10-6倍稀释；C1-C6：ALV C亚群tt毒株DNA模板起始浓度的10-2～10-7倍稀释；D1-D3：ALV D亚群毒株DNA模板起始浓度tttttt的10-2～10-4倍稀释；J1-J6：ALV J亚群毒株DNA模板起始浓度的10-2～10-7倍稀释；R1-R7：ttREV毒株DNA模板起始浓度的10-2～10-8倍稀释；CA1-CA4：CAV毒株模板起始浓度的10-2～tt10-5倍稀释。tt

　　图5：基因芯片特异性检测评价结果。tt

　　1：REV PCR产物与ALV A+DPCR产物等体积混合；2：传染性法氏囊病病毒（IBDV）；tt3：鸡马立克氏病病毒（MDV）；4：鸡胚成纤维细胞；5：DF-1细胞。tt

　　具体实施方式tt

　　主要试剂tt

　　DNA及RNA提取试剂盒均购自QIAGEN公司。tt

　　质粒小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司产品。tt

　　PCR Mix购自GenStar公司。tt

　　琼脂糖凝胶染料Goldview购自北京赛百盛基因技术有限公司。tt

　　醛基片购自博奥生物科技有限公司。tt

　　甲酰胺、SDS、硼氢化钠、50×Denhardt均购自北京希尔诚兴业科技有限公司。tt

　　主要仪器设备tt

　　PCR仪、Power-PAC200电泳仪和Gel Doc2000凝胶成像系统均为BioRad公司产品。tt

　　制冰机为Grant公司产品。tt

　　5415D台式离心机和5804R台式冷冻离心机均为Eppendorf公司产品。tt

　　芯片点样仪Personal Arrayer16为博奥生物有限公司产品。tt

　　芯片杂交仪Bio MixerⅡ为博奥生物有限公司产品。tt

　　芯片洗干仪Slide Washer8为博奥生物有限公司产品。tt

　　微阵列芯片扫描仪Lux Scan10K-A为博奥生物有限公司产品。tt

　　生物材料的来源或记载出处：tt

　　NX0101毒株的来源：为已知毒株，记载在申请日之前的文献中。本发明所用的由tt山东农大崔治中老师惠赠。tt

　　RAV-1毒株购自中国兽医药品监察所：tt

　　鸡传染性贫血病毒（CIAV）、网状内皮增生病病毒（REV）、传染性法氏囊病病毒tt（IBDV）、鸡马立克氏病病毒（MDV）均为已知毒株，记载在申请日之前的文献中，tt本实验室有保存。tt

　　引物设计所依据的序列的选取tt

　　REV以及ALV的A、C、D、J四个亚群共11个参考毒株的cDNA全序列均由美tt国国家生物技术信息中心（NCBI）基因库下载（见表1），截取目的序列，由上海生工tt生物公司合成。tt

　　J亚群NX0101毒株接种于DF-1细胞上，用QIAGEN公司的DNA提取试剂盒提tt取cDNA。tt

　　CAV组织毒由本试验保存，用QIAGEN公司的DNA提取试剂盒提取DNA。tt

　　（表1）。tt

　　表1.本试验使用的参考毒株tt

　　实施例1.探针和引物的设计以及基因芯片的制备tt

　　步骤1.特异性探针的设计tt

　　从Genbank收集CAV、REV以及ALV A、C、D、J四个亚群各自的参考毒株cDNA全基因tt序列459条。对459条序列按种建库，经比对选出每个亚群的参考毒株序列共13条，其中CAVtt参考毒株序列GenBank编号为M55918；REV参考毒株序列GenBank编号为DQ387450、ttNC006934；ALV A亚群的参考毒株序列GenBank编号为HM452339、M19113、M14901、ttHM452340、AB617819；ALV C亚群的参考毒株序列GenBank编号为V01197；ALV D亚群的tt参考毒株序列GenBank编号为D10652；ALV J亚群的参考毒株序列GenBank编号为ttAY027920、GU982307。tt

　　用DNAStar软件的Clustal W程序对这些序列进行比对，找出它们的保守区和变异区。利tt用Oligo6软件,在变异区对每个亚群的序列数据库设计各自的特异性探针。共设计了10条特异tt性探针。设计出的探针根据以下设计原则进行优化：长度控制在20～40个碱基；探针的熔解tttttt温度(Tm)在较小范围内，一般控制在65℃～75℃；亚群基因型之间的同源序列有3个以上的tt错配；5’端加15个以内的碱基T，以减小空间位阻；在5’端进行氨基化修饰，从而与醛基基片tt结合紧密，具体探针序列见表2。tt

　　表2.寡核苷酸探针序列tt

　　步骤2.多重PCR引物的设计tt

　　根据基因芯片探针设计的需要，待检样品通用引物的设计目标，在各目的片段前后寻找tt保守区域，在这些保守区域中设计并筛选出扩增效率高的引物。利用DNA Star软件对各个病tt毒的代表毒株进行比对，确定上、下游保守区域；通过Primer Premier5.0软件设计和优化引tt物，最终确定了扩增各病毒的特异性引物。同时，合成时在下游引物5’端加Cy3荧光标记物，tt从而使PCR产物带有荧光信号，具体引物序列见表3。tt

　　表3.多重PCR引物序列tt

　　表3的引物由上海生工生物有限公司合成，下游通用引物的5'端用荧光染料Cy3进行了tt标记。tt

　　步骤3.制备低密度的基因芯片tt

　　用双蒸水将探针稀释至50μmol/L，取5uL加入A384空板中，与等体积芯片点样液混匀，tt按下表微阵列布局用Personal Arrayer16芯片点样仪将10条特异性探针、1条阳性质控探针、ttHEX点样质控探针点于醛基化玻璃基片上，矩阵为7×9，每块芯片点制10个相同阵列，点样tt完成后将芯片于37℃湿盒内固定12h以上，使得探针序列5’端的氨基和载玻片表面的醛基紧tt密结合。固定后的芯片在封闭液中封闭5分钟，用超纯水清洗，氮气吹干或离心甩干，4℃保tt存备用。探针在芯片上的布局见表4。tt

　　表4.终选13条探针的矩阵图tt

　　实施例2.待测样品的DNA模板的制备tt

　　本研究室保存的CAV组织毒（即携带有CAV cDNA的质粒），用QIAGEN公司的DNAtt提取试剂盒提取DNA，最后检测核酸浓度，并置于-20℃保存备用。tt

　　REV以及ALV（A、C、D、J亚群）相应目的序列已由上海生工生物公司合成并连接到ttPCU57载体质粒上，取含有合成质粒的菌液培养物，用天根公司的质粒小题试剂盒对菌液培tt养物进行质粒提取，最后检测核酸浓度，并置于-20℃保存备用。tt

　　实施例3.优化多重PCR扩增体系tt

　　多重PCR的目的是用尽量少的引物扩增目标序列，以减少实验时间和步骤，提高检测效tt率；两个多重PCR体系分别为：体系一、在同一个体系中能够同时扩增ALV A、C、D、Jtt四个亚群毒株的目的序列；体系二：在同一个体系中能够同时扩增CAV和REV两个毒株的tt目的序列。tt

　　本研究在ALV、CAV、REV中各选取一个参考毒株的基因序列作为代表序列，并将浓tt度均调整到1ng/μL后等体积混合，用上述引物分别对其进行PCR扩增，引物初始浓度均为tt10μmol/L，通过多次实验的重复和优化，最终确定的反应体系和反应条件见表5、6、7。tt

　　表5.优化后的多重PCR反应体系tt

　　表6.优化后的多重PCR反应条件tt

　　表7.优化后的多重PCR反应条件tt

　　实施例4.芯片有效性评价tt

　　步骤1.待测PCR产物的制备tt

　　分别以提取的CAV M55918毒株、REV DQ387450毒株和ALV A亚群HM452339、ttM14901；C亚群V01197；D亚群D10652；J亚群AY027920、GU982307毒株的质粒DNAtt作为标准样品模板，将各模板的起始浓度调整到100ng/μL，以实施例3中优化好的多重PCRtt体系和条件分别进行扩增，得到的荧光标记PCR产物置于-20℃保存备用。tt

　　步骤2.芯片杂交及杂交后处理tt

　　取300μL双蒸水加入杂交盒内，将实施例1制备的基因芯片点阵面朝上置于杂交盒中，tt取7μL荧光标记的PCR产物与8μL杂交液混匀，95℃变性5min，立即冰浴5min，加入到tt每个反应阵列中，使得液体覆盖整个微阵列区域，42℃杂交过夜；杂交完毕后将芯片取出放tt入42℃清洗液I（2×SSC，0.2%SDS）中清洗2分钟，重复2次；再将芯片放入42℃清洗液IItt（0.2×SSC）中清洗2分钟，重复3次，最后离心甩干。tt

　　步骤3.芯片杂交结果扫描tt

　　将芯片放入微阵列芯片扫描仪Lux Scan10K-A中，设定参数：荧光通路Cy3、power90、ttPMT600、分辨率10μm，扫描结果并进行结果分析，芯片杂交结果见图1。tt

　　对实验结果中的荧光信号进行取值，为D1探针和CAV探针设定一个阈值来界定非特异tt性杂交信号的有效性。经过对大量实验结果的对比分析，最终设定D1探针的阈值为4.32，ttCAV探针的阈值为4.98。tt

　　实施例5.芯片对多重PCR产物的检测评价tt

　　将实施例4中调整好浓度的参考毒株DNA模板，各取1μL等体积混合，以实施例3中tt优化好的多重PCR体系和条件同时进行扩增试验，扩增得到的荧光标记的PCR产物以实施tt例4的方法与制备好的芯片杂交，洗片和结果扫描也与实施例4中方法相同。tt

　　芯片杂交结果见图2。tt

　　结果显示芯片能够同时检测出上述三种病毒，探针与待检样品结合率高，试验结果准确tt清晰。tt

　　实施例6.芯片的敏感性评价tt

　　分别以提取的CAV M55918毒株、REV DQ387450毒株和ALV A亚群HM452339；C亚群ttV01197；D亚群D10652；J亚群AY027920毒株的质粒DNA作为标准样品模板，测定样品核酸tt浓度，所有核酸均调整原始浓度为150ng/ul,并计算DNA拷贝数，然后按10-2～10-10倍数对其进tt行稀释，以实施例3中优化好的多重PCR体系和条件分别进行扩增实验，用基因芯片法和琼脂tt糖凝胶电泳法检测，比较两种方法的灵敏度。tt

　　杂交、洗片和结果扫描与实施例4中方法相同。tt

　　芯片杂交结果见图3。tt

　　琼脂糖凝胶电泳检测结果见图4。tt

　　结果显示基因芯片检测方法对ALV A亚型的灵敏性为107copies/ml，对ALV C、J亚型的灵tttttt敏性为106copies/ml，对ALV D亚型的灵敏性为109copies/ml，对CAV的灵敏性为108copies/ml，tt对REV的灵敏性为105copies/ml；tt

　　PCR检测方法对ALV A亚型的灵敏性为109copies/ml，对ALV C、J亚型的灵敏性为tt107copies/ml，对ALV D亚型的灵敏性为1010copies/ml，对CAV的灵敏性为109copies/ml，tt对REV的灵敏性为106copies/ml，由结果可知基因芯片检测方法比PCR检测方法要敏感一个tt到两个梯度梯度，所检测结果清晰准确。tt

　　实施例7.芯片的特异性检验tt

　　在相同条件下，将传染性法氏囊病病毒（IBDV）、鸡马立克氏病病毒（MDV）、鸡胚成tt纤维细胞（CEF）、以及DF-1细胞的核酸样品按照实施例3中优化好的多重PCR体系和条件tt进行PCR扩增，再按照实施例4中的方法仅行杂交、洗片和扫描试验，验证芯片对ALV的tt特异性检测。tt

　　芯片杂交结果见图5。tt

　　芯片检测结果表明，除HEX点样质控探针和阳性杂交质控探针出现荧光信号外，其他探tt针均未出现荧光信号,说明该芯片具有较高的ALV检测特异性，这对鉴别诊断ALV具有重要tt意义。tt

　　实施例8.芯片对临床样品的检验tt

　　从某鸡场随机采集鸡抗凝血和血清各50份，编号为1-50号。用IDEXX公司的ALV Jtt亚群和AB亚群抗体检测试剂盒CAV REVQIAGEN公司的DNA提取试剂盒对50份抗凝血进tt行基因组DNA提取，利用优化好的多重PCR方法进行扩增，按照实施例3中优化好的多重ttPCR体系和条件进行PCR扩增，用制备好的基因芯片检测其扩增产物,并将扩增结果与IDEXXtt公司的抗体试剂盒检测结果进行比对。tt

　　具体结果见表8。tt

　　表8.临床样品检测结果比较tt