血浆游离DNA文库的构建方法
技术领域tt
本发明涉及扩增前修补缺口的血浆DNA文库构建方法，特别是涉及可应用于无创产前tt诊断的孕妇血浆中游离DNA文库构建方法。tt
背景技术tt
根据医学统计，每年出生的新生儿中，约有2～3％罹患先天性疾病或出生缺陷，造成了婴tt幼儿长期卧病、残障，甚至夭折，给社会和家庭带来巨大的负担。导致先天性疾病或出生缺tt陷的原因主要有染色体异常、单基因遗传病、多基因遗传病、致畸胎因素等，其中染色体异tt常占较大比例。在讲求优生保健的现代社会，如何防治先天性疾病或出生缺陷，成为十分重tt要的课题。而产前诊断、及时发现、及时终止妊娠是预防遗传缺陷患儿出生的重要手段。传tt统的产前诊断方法是通过羊水穿刺、绒毛活检以及胎儿脐带血检查直接获取胎儿遗传物质来tt进行诊断，这些产前诊断技术都是侵入性的，有一定的风险，可能会造成胎儿损伤、母体流tt产或宫内感染，甚至胎死宫内等，难以被广大孕妇和家庭所接受。tt
1997年Lo等研究报道了孕妇血浆中有胎儿游离DNA的存在，后来有研究也报道发现孕妇tt血浆中存在胎儿RNA，这些重大发现为无创产前诊断提供了新的可能。在孕妇外周血中胎儿tt游离DNA占孕妇血浆总DNA的3％～30％，无创产前诊断就是指抽取孕妇外周血，通过对孕妇tt外周血中游离胎儿DNA进行高通量测序，通过生物信息学分析来检测胎儿是否患有21-三体综tt合征(唐氏综合征)、18-三体综合征(爱德华氏综合征)、13-三体综合征(帕陶氏综合征)等染色tt体数目异常疾病，是产前诊断领域的一项新兴技术。与侵入性产前诊断相比较，无创产前诊tt断具有安全性高、灵敏度高、特异性好、检测时间早、快速等特点。tt
目前，无创产前诊断过程中血浆游离DNA的文库构建一般是在提取孕妇血浆中的游离ttDNA后，通过末端修复→纯化→加A→纯化→连接头→纯化→扩增→纯化等步骤来完成。文tt库构建过程中，步骤繁琐，需经过多次纯化过程，会造成DNA的损失，同时在接头连接的过tt程中会出现接头自连现象，致使文库构建效率低、质量差。或者通过末端修复并加A后纯化、tt连接头后纯化、扩增、纯化等步骤来完成。虽然减少了纯化步骤，降低了DNA的损耗，但是tt仍然有接头自连的问题难以解决。tt
发明内容tt
本发明旨在提供一种高通量测序文库的构建方法，以解决现有的少量DNA样本建库，尤tt其是血浆游离DNA建库过程中DNA损耗及容易出现接头自连等问题。本方法不仅简便、高效，tttttt减少了纯化步骤，降低了文库构建过程中DNA的损失，而且使用特定的接头及平末端的连接tt方式，有效地解决微量DNA文库构建过程中容易出现接头自连的问题。同时，使用特殊的文tt库扩增聚合酶，扩增前修补缺口，保证扩增前有足够的完整的模板进行扩增反应。tt
一种少量DNA文库构建方法，采用下述顺序、方法步骤：tt
(1)对DNA片段进行末端修复成平端及5’端磷酸化，得到修复后DNA，tt
(2)修复后DNA直接与接头进行平末端连接，纯化，得到连接处带有缺口的含接头ttDNA；tt
(3)使用PCR聚合酶进行缺口的修补，得到修补后完整的含接头DNA，tt
(4)PCR扩增，纯化，最终获得高通量测序文库。tt
所述步骤(2)中的接头为接头A和接头B，接头A由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2等摩tt尔量退火组合而成，所述接头B由SEQ ID NO3和SEQ ID NO4等摩尔量退火组合而成，tt
SEQ ID NO1：tt
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’tt
SEQ ID NO2：tt
5’-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATC-3’，tt
SEQ ID NO3：tt
5’-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACIIIIIIATC-3’，tt
SEQ ID NO4：tt
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，tt所述序列3中的六个碱基“IIIIII”表示测序平台多样品混合文库中的标签序列。tt
所述测序平台为为illumina测序平台，所述“IIIIII”可以为任意六个碱基的随机组合。tt
所述碱基序列在illumina测序平台中可以为“ATCACG”,或者为“CGATGT”,或者为tt“TTAGGC”，或者为“TGACCA”,或者为“ACAGTG”,或者为“GCCAAT”,或者为“CAGATC”,tt或者为“ACTTGA”,或者为“GATCAG”,或者为“TAGCTT”,或者为“GGCTAC”,或者为tt“CTTGTA”。tt
所述步骤(1)使用T4 DNA聚合酶、大肠杆菌DNA多聚酶Ⅰ大片段使DNA修复成平tt末端。tt
所述步骤(1)使用T4多核苷酸激酶使DNA平末端5’端磷酸化。tt
所述DNA片段为血浆游离DNA，大小为100-250bp；或者为基因组DNA经超声破碎为tt100-250bp。tt
本发明的文库构建方法，首先对血浆游离DNA或片段化DNA进行末端修复成平端，并tttttt同时对5’端进行磷酸化修饰，得到修复后DNA；之后直接与人工接头进行平末端连接，得到tt连接处带有缺口的含接头DNA；经纯化后得到较纯净的连接处带有缺口的含接头DNA；然tt后在PCR扩增之前使用PCR聚合酶进行缺口的修补，得到修补后完整的含接头DNA；再进tt行PCR扩增反应，得到扩增产物；纯化后得到最终高通量测序文库。tt
本发明的文库构建方法，在进行DNA末端修复后不需进行纯化，利用修复体系直接进tt行接头的连接，减少了纯化步骤造成的DNA损失；本发明的文库构建方法，使用的接头只tt有一端是平末端，保证了与目的DNA连接的方向正确；使用的接头平末端未经过磷酸化修tt饰，保证了连接反应时不会生成接头自连产物；本发明的文库构建方法，使用特殊的DNAtt聚合酶进行连接处缺口的修补，保证PCR扩增前对连接处缺口进行完美修复。tt
在高通量测序领域，文库构建好后，通常需要对文库进行质检。质检内容包括琼脂糖凝tt胶电泳评估文库片段大小；采用实时荧光定量PCR评估文库浓度、是否有接头自连污染。当tt文库浓度较低时，无法进行后续的高通量测序。当文库中含有自连的接头时，同样无法进行tt高通量测序。以Hiseq2000为例，其要求文库浓度不低于2nM，且文库中没有自连的接头污tt染。tt
本发明的技术方案，通过采用修复末端后直接连接接头，减少了纯化步骤从而减少了ttDNA损失。本发明中所使用的单向平末端接头不进行磷酸化修饰，从而避免了文库构建过程tt中产生的接头自连现象以及保证接头连接方向的正确。本发明中所使用的PCR聚合酶在PCRtt反应前进行修补缺口的反应，保证了足够的完整的模板进行后续的PCR扩增反应。tt
附图说明tt
图1示明了本发明的文库构建流程；tt
图2示明了本发明实施例与对照例文库构建结果的电泳图；tt
图3示明了本发明实施例文库实时荧光定量PCR质检熔解曲线图；tt
图4示明了本发明对照例文库实时荧光定量PCR质检熔解曲线图；tt
图5示明了本发明实施例与对照例文库实时荧光定量PCR质检熔解曲线对比图。tt
具体实施方式tt
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。tt
按照图1所示的文库构建流程进行构建的。所使用的接头序列为上述权利要求7中所列tt序列。其中序列1与序列2等摩尔量退火组合成接头A，序列3与序列4等摩尔量退火组合tt成接头B。tt
SEQ ID NO1：tt
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’tt
SEQ ID NO2：tt
5’-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATC-3’，tt
SEQ ID NO3：tt
5’-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACIIIIIIATC-3’，tt
SEQ ID NO4：tt
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，tt所述序列3中的六个碱基“IIIIII”表示测序平台多样品混合文库中的标签序列。tt
下面实施例所使用样品为正常人血浆游离DNA。使用市售试剂盒进行血浆游离DNA抽tt提。DNA使用Qubit荧光计进行定量。tt
1、对照例：血浆DNA文库构建tt
1)样本及试剂tt
取Qubit定量后的血浆游离DNA 5ng，使用市售高通量测序文库构建试剂盒进行文库构建。tt
2)对血浆游离DNA进行末端修复及加dATPtt
反应体系如下：tt
反应条件：混匀后20℃孵育30分钟。65℃孵育30分钟。tt
3)接头连接tt
反应体系如下：tt
反应条件：混匀后20℃孵育15分钟。tt
在上述3)的体系中加入3ul市售试剂盒中酶进行酶切。tt
反应条件：混匀后37℃孵育15分钟。tt
对上述产物进行磁珠纯化。操作流程按照Ampure XP Beads纯化说明书进行。tt
4)PCR扩增tt
反应体系如下：tt
反应条件：98℃预变性30秒；然后98℃变性10秒，65℃30秒，72℃30秒，共10个循tt环；最后72℃延伸5分钟。tt
对上述产物进行磁珠纯化。操作流程按照Ampure XP Beads纯化说明书进行。tt
对步骤4)中的PCR纯化产物进行Qubit定量。tt
2、实施例：血浆DNA文库构建tt
1)样本及试剂tt
取Qubit定量后的血浆游离DNA 5ng，使用市售相关试剂进行文库构建。tt
2)对血浆游离DNA进行末端修复及5’端磷酸化修饰tt
反应体系如下：tt
DNA 25ultt
市售末端修复反应混合物 10ultt
总体积35ultt
反应条件：混匀后20℃孵育30分钟。70℃孵育15分钟使酶失活。tt
3)接头连接tt
反应体系如下：tt
反应条件：混匀后20℃孵育15分钟。65℃20分钟使酶失活。tt
对上述产物进行磁珠纯化。操作流程按照Ampure XP Beads纯化说明书进行。tt
4)修复缺口及PCR扩增tt
反应体系如下：tt
反应条件：72℃孵育15分钟，修补缺口；95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，58℃退火tt15秒，72℃延伸30秒，共10个循环；最后72℃延伸1分钟。tt
对上述产物进行磁珠纯化。操作流程按照Ampure XP Beads纯化说明书进行。tt
对步骤4)中的PCR纯化产物进行Qubit定量。tt
3、检测：文库质检tt
1)配制2％琼脂糖胶。对对照例和实施例中的两个文库各取100ng进行琼脂糖胶电泳鉴定。ttDNA marker使用TAKARA DL1000 marker 5ul。鉴定结果如图2所示，图2从左至右依次为ttTAKARA DL1000 marker、实施例文库、对照例文库。从图2可知，本发明的实施例文库与tt对照例文库主带(300bp左右)均较明显。tt
2)通过实时荧光定量PCR进一步检测对照文库与实验文库是否有接头污染。对照例和实施tt例中的两个文库各取1ul，使用KAPA BIOSYSTEMS公司的高通量测序文库定量试剂盒进行tt检测。检测结果如图3-图5所示，图4显示对照例文库有少许自连接头污染(熔解曲线温度tt82℃处)，而本发明的实施例文库无任何自连接头污染。tt
从以上描述中可以看出，上述实施例通过使用本发明的方法构建的血浆游离DNA文库，tt从根本上避免了高通量测序文库构建容易出现自连接头污染的现象，提高了文库质量。tt
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之tt内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围之内。tt
