全基因组甲基化测序文库及其构建方法
技术领域tt
本发明涉及高通量测序文库构建领域，具体而言，涉及一种全基因组甲基化测序文库及tt其构建方法。tt
背景技术tt
DNA甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式。近年来，大量研究表明DNAtt甲基化修饰对于维持正常细胞功能、传递基因组遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生，起tt着至关重要的作用。甲基化研究成了表观遗传学的热点，相应的技术也是层出不穷，根据实tt验目的的不同，这些技术大体能够分成两类：全基因组甲基化研究技术以及特异性甲基化位tt点研究技术。tt
WGBS(Whole genome bisulfite sequencing)，即全基因组重亚硫酸盐测序。实验原理是：tt前期用重亚硫酸处理，将基因组中未发生甲基化的C碱基转化成U，进行PCR扩增后变成T，tt与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来；以第二代高通量测序平台为基础，结合全基因组tt重亚硫酸处理和生物信息数据分析技术，进行低成本、高效率、高准确度的全基因组DNA甲tt基化水平图谱绘制。tt
随着二代测序的飞速发展，测序成本大幅度下降，WGBS技术可以绘制单碱基分辨率的tt全基因组DNA甲基化图谱，对于研究来讲具有绝对的技术优势。从芯片到第二代高通量测序，tt从特异性甲基化位点到全基因组甲基化研究，相应的技术也是层出不穷。测序成本大幅度下tt降使得甲基化组(methylome)的研究成为可能。目前，基于第二代测序平台的基因组甲基化tt研究，主要包括WGBS、RRBS和MeDIP三种技术，如下表1所示，对于不同的甲基化区域，tt可以选择不同的技术来实现：tt
提到甲基化测序，首先想到的必然是“金标准”全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome ttbisulfite sequencing)，简称BS-seq。该方法的实验原理是前期用Bisulfite处理，将基因组中未tt发生甲基化的C碱基转换成U，进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰的C碱基区tt分开来，再结合高通量测序技术，特别适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。ttWGBS技术可以绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱，对于研究来讲具有绝对的技tt术优势。tt
到目前为止，全基因组重亚硫酸盐测序是DNA甲基化研究比较好的方法，但是该方法本tt身存在设计缺陷，导致生物信息学分析时会降低甲基化程度评估的准确性，阻碍了其应用，tt因而，仍需要对现有的全基因组甲基化测序方法进行改进，以提高后续甲基化程度评估的准tt确性。tt
表1：tt
发明内容tt
本发明的主要目的在于提供一种全基因组甲基化测序文库及其构建方法，以降低现有技tt术中所构建的文库影响后续全基因组甲基化程度评估的准确性。tt
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种全基因组甲基化测序文库的构tt建方法，该构建方法包括以下步骤：S1，对全基因组DNA进行片段化，得到DNA片段；S2，tt采用由dATP、dTTP和dGTP混合形成的dNTP进行末端修复对DNA片段进行末端修复，得tt到修复片段；S3，对修复片段进行3’末端加“A”，得到3’末端带“A”片段；S4，采用经过“C”tt到“T”转化处理的接头序列对3’末端带“A”片段进行接头连接，得到带接头的片段；S5，对带tt接头片段进行“C”到“T”转化处理，得到处理片段；S6，对处理片段进行扩增，得到全基因组tt甲基化测序文库。tt
进一步地，在步骤S1之后，以及步骤S2之前，构建方法还包括对DNA片段进行纯化的tt步骤。tt
进一步地，纯化的步骤采用DNA亲和柱进行纯化。tt
进一步地，纯化的步骤采用QIAquick PCR纯化试剂盒对DNA片段进行纯化。tt
进一步地，在步骤S2中，采用End-It试剂盒中的dATP、dTTP和dGTP混合形成的dNTPtt对DNA进行末端修复，得到修复片段。tt
进一步地，在步骤S2之后，以及步骤S3之前，构建方法还包括对修复片段进行纯化的tt步骤。tt
进一步地，在步骤S3之后，以及步骤S4之前，还包括采用Ampure XP磁珠对3’末端带tt“A”片段进行纯化的步骤。tt
进一步地，在步骤S4之后，以及步骤S5之前，构建方法还包括对带接头片段进行定量tt的步骤。tt
进一步地，在步骤S5中，采用EZ DNA Methylation-LightningTM试剂盒对带接头片段进tt行“C”到“T”转化处理，得到处理片段。tt
根据本发明的另一方面，提供了一种全基因组甲基化测序文库，采用上述任一种构建方tt法构建而成。tt
应用本发明的技术方案，通过在末端修复步骤中将末端修复酶的dNTP原料由dATP、ttdCTP、dTTP和dGTP的混合物改进为dATP、dTTP和dGTP的混合物，进而在修复过程中，tt避免了非甲基化的C引入DNA片段末端，从而提高了后续甲基化程度评估分析的准确性。tt
附图说明tt
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实tt施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：tt
图1示出了根据本发明的全基因组甲基化文库构建的流程示意图；tt
图2示出了本发明实验一中的基因组片段化处理后的电泳结果图；tt
图3示出了本发明实验三中的PCR扩增后的电泳结果图；tt
图4示出了本发明实验四中所构建的全基因组甲基化文库中GC分布度和GC含量图；以tt及tt
图5示出了本发明实验四中甲基化比对的原理图。tt
具体实施方式tt
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。tt下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。tt
现有技术中，在进行甲基化文库构建的过程中，在末端修复步骤中采用常规的包含dATP、ttdCTP、dTTP和dGTP的dNTP作为末端修复酶的原料对片段化的DNA片段进行修复，忽略tttttt了采用这种dNTP会在片段化的DNA片段上人为引入非甲基化的C，进而对后续甲基化程度tt评估的准确性产生不利影响。tt
针对现有技术中的上述问题，在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种全基因组甲tt基化测序文库的构建方法，如图1所示，该构建方法包括以下步骤：S1，对全基因组DNA进tt行片段化，得到DNA片段；S2，采用由dATP、dTTP和dGTP混合形成的dNTP对DNA片tt段进行末端修复，得到修复片段；S3，对修复片段进行3’末端加“A”，得到3’末端带“A”片段；ttS4，采用经过“C”到“T”转化处理的接头序列对3’末端带“A”片段进行接头连接，得到带接头片tt段；S5，对带接头片段进行“C”到“T”转化处理，得到处理片段；S6，对处理片段进行扩增，tt得到全基因组甲基化测序文库。tt
本发明的上述构建方法，通过在末端修复步骤中将末端修复酶的包含dATP、dCTP、dTTPtt和dGTP的dNTP原料改进为以dATP、dTTP和dGTP混合而成的dNTP，进而在修复过程中，tt避免了非甲基化的C引入DNA片段末端，从而保证了后续甲基化程度评估分析的准确性。tt
在本发明的上述构建方法中，对全基因组DNA进行片段化的步骤可以采用物理打断或化tt学打断的方式进行片段化。在本发明一种优选实施例中，优选采用物理打断的方式进行片段tt化，采用物理破碎的方式进行片段化，使得片段大小主要集中在150～300bp之间，简单易操tt作，且重复性和可控性好。tt
在本发明的构建方法中，在步骤S1之后，以及步骤S2之前，优选上述构建方法还包括tt对DNA片段进行纯化的步骤。进行该纯化步骤能够将不满足片段大小的DNA片段进行去除，tt从而得到片段更加集中且纯度更高的DNA片段。tt
上述纯化步骤中，具体纯化的方法采用本领域常规的纯化方法均可。优选上述纯化采用ttDNA亲和柱进行纯化，采用DNA亲和柱进行纯化使DNA片度的纯度更高。在本发明一种更tt优选的实施例中，上述纯化的步骤采用QIAquick PCR纯化试剂盒对DNA片段进行纯化。ttQIAquick PCR纯化试剂盒对片段化的DNA片段纯化效果更好。tt
在本发明的构建方法中，在步骤S2中，对DNA片段进行末端修复时，只要采用的dNTPtt中不含有dCTP即可，这样可以避免人为引入非甲基化的C，进而影响测序数据中非甲基化的ttC的含量，从而导致甲基化程度分析的准确性下降。在本发明一种优选的实施例中，采用End-Ittt试剂盒中的dATP、dTTP和dGTP混合形成的dNTP对DNA进行末端修复，得到修复片段。tt在使用该试剂盒中的dNTP时，不加入其中的dCTP，与该试剂盒中的末端修复酶配合使用，tt修复率较高，能够得到高含量的末端修复片段，尤其对取材难、质量少的样本，能够提高建tt库的成功率。tt
在本发明的构建方法中，进行修复之后即可进入3’末端加“A”的步骤。为了使加“A”的连tt接效果更好，在上述步骤S2之后，以及步骤S3之前，优选该构建方法还包括对修复片段进tt行纯化的步骤。通过对末端修复后的修复片段进行纯化，可以直接去除掉未被修复的片段，tt富集修复好的片段，以提高后续的加“A”效率。在本发明一种更优选的实施例中，上述纯化的tt步骤采用Ampure XP磁珠对修复片段进行纯化。在该步骤采用磁珠纯化，通过合理调整AmpurettttttXP磁珠的用量和待纯化的修复片段的量之间的比例，能够利用Ampure XP磁珠筛选得到目的tt片段大小的片段，进一步去除过大或过小的修复片段，提高目的大小片段的富集程。tt
在本发明的构建方法中，在末端修复之后，采用常规的方法进行3’末端加“A”的步骤，得tt到3’末端带“A”的片段，然后进行接头连接步骤，得到带接头片段。此时，为了节省建库时间，tt可以直接进入“C”到“T”转化处理步骤。“C”到“T”转化处理是检测基因甲基化的经典处理方式，tt其原理为：用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)tt被转化为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶则不变。因而，经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处tt理后，甲基化的位点产生类似于一个C/T的多核苷酸多态性(SNP)。基因组DNA经亚硫酸盐tt处理后，扩增目的片段，此时尿嘧啶(U)全部转化为胸腺嘧啶(T)，最后对PCR产物进行测序tt就可以判断是否发生甲基化。tt
在接头连接步骤中，连接的接头为已经经过“C”到“T”转化处理的接头。在常规的全基因tt组甲基化测序文库构建时，在接头连接步骤考虑到了连入的接头中的非甲基化的C是需要经tt过亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐处理的，而忽略了在末端修复步骤中引入的非甲基化的C也会影tt响最终甲基化的C含量的计算。因而，片段化之后的DNA片段中，有单链DNA，有平末端tt的双链DNA，还有双端都带有突出碱基的非平末端双链DNA，在这些突出碱基中有碱基Gtt的，修复时就会人为引入非甲基化的C。tt
在发明另一种优选的实施例中，在进行上述接头连接步骤之前，还包括采用Ampure XPtt磁珠对上述3’末端带“A”片段进行纯化的步骤，通过Ampure XP磁珠纯化步骤能够将3’末端tt未连上“A”的一些片段去除。tt
在本发明又一种优选的实施例中，在上述步骤S4之后，以及步骤S5之前，该构建方法tt还包括对带接头片段进行定量的步骤。在进行“C”到“T”转化处理之前，对待处理的带接头片tt段进行定量，能够准确计算所需的亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐的量，既能使带接头片段中的Ctt都转化成U，又不致过量使用亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐，从而减少浪费，节约成本。tt
上述“C”到“T”转化处理的步骤中，可以采用自己配置的亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐溶液进tt行处理，也可以采用常规的甲基化处理试剂盒进行处理，只要能够使所处理的带接头片段中tt的目的片段中的非甲基化的C与甲基化的C区分开来即可。在本发明又一种优选的实施例中，tt在步骤S5中采用EZ DNA Methylation-LightningTM试剂盒对带接头片段进行“C”到“T”转化处tt理，得到处理片段。EZ DNA Methylation-LightningTM试剂盒处理效率高。tt
在本发明另一种典型的实施方式中，提供了一种全基因组甲基化测序文库，该全基因组tt甲基化测序文库采用上述任一种构建方法构建而成。本发明的全基因组甲基化测序文库因在tt末端修复步骤中使用不含有dCTP的dNTP，进而避免了在建库过程中引入非甲基化的C，从tt而使所构建的全基因组甲基化测序文库中的甲基化的C含量更接近其真实含量，提高了全基tt因组甲基化程度分析或评估的准确性。tt
下面将结合具体实施例进一步说明本发明的效果。应当理解的是，这些实施例仅用于说tt明本发明而不用于限制本发明的范围。tt
实验一tt
1.以拟南芥种子DNA为样本，每个样本取5.2μg基因组DNA，分别加26ng(0.5％)的阴tt性对照(λDNA)，然后用水补齐至130μl，加到Covaris管中。tt
2.用Covaris S220设备进行物理破碎，根据大量实验总结的经验，将Covaris S220的参数tt设置为循环数8％～12％，峰值入射功率170～180瓦；循环数/爆发200～220；处理时间250～330s；tt温度4～8℃范围内时，均能破碎得到的片段大小主要在150～300bp之间，该实验中按照下表2tt中的数据进行设置。tt
表2：tt
3.取20-30ng(1μl)样品进行2％琼脂糖凝胶电泳(120V，25min)，检测打断是否集中，具tt体检测结果见图2。tt
在图2中，最左边是DNA分子大小标记，从下至上的5条带大小分别为：100bp、200bp、tt300bp、400bp和500bp，从图2中可以看出，经Covaris S220打断后的DNA片段的大小都集tt中在150～300bp之间。tt
4.用QIAquick PCR纯化试剂盒的说明书纯化DNA片段。tt
5.用End-It试剂盒(Epicenter)进行末端修复，冰上在PCR管中按照以下组分比例形成tt反应体系，并用移液器混匀，室温放置45分钟。tt
上述反应体系的组成为：tt
6.用Ampure XP磁珠纯化末端修复产物。tt
具体步骤如下：tt
(1)在反应体系中加入60ul Ampure XP磁珠，用移液器重复混匀，室温静置5分钟。tt
(2)将PCR管放置在magnetic stand上，静置5分钟，至溶液变澄清。用移液器将上清tt液吸出并丢弃。tt
(3)(保持PCR管在磁力架上)加入200ul 80％乙醇，静置30秒，将乙醇吸出丢弃。tt
(4)重复步骤3)一次。用10ul枪头再吸一次，保证没有乙醇溶液残留。tt
(5)(继续保持PCR管在磁力架上)室温静置至磁珠干燥。tt
(6)在干燥的磁珠上加入39ul水，将PCR管从磁力架取下，用移液器将管中的水和磁tt珠混匀，室温静止2分钟，放在磁力架上吸附磁珠5分钟，将37ul上清转移到新的PCR管中。tt
7.3’末端加A。tt
在冰上按下面体系在PCR管中加入试剂。(如果样品较多，应该将其他试剂混成mix,再分tt装到各个反应体系之中)tt
用移液器混匀，将PCR管置于PCR仪上37℃反应30分钟。tt
8.用Ampure XP磁珠纯化3’末端加A产物。tt
(1)在反应体系中加入50ul Ampure XP磁珠，用移液器重复混匀，室温静置5分钟。tt
(2)将PCR管放置在magnetic stand上，静置吸附磁珠5分钟，至溶液变澄清。用移液tt器将上清液吸出并丢弃。tt
(3)(保持PCR管在磁力架上)加入200ul 80％乙醇，静置30秒，将乙醇吸出丢弃。tt
(4)重复步骤3)一次。用10ul枪头再吸一次，保证没有乙醇溶液残留。tt
(5)(继续保持PCR管在磁力架上)室温静置至磁珠干燥。tt
(6)在干燥的磁珠上加入33ul水，将PCR管从磁力架取下，用移液器将管中的水和磁tt珠混匀，室温静止2分钟，放在磁力架上吸附磁珠5分钟，将31ul上清转移到新的PCR管中。tt
9.接头连接。按照下面的反应体系将各组成成分加入PCR管中。tt
用移液器混匀，置于PCR仪中，16℃连接过夜。tt
其中，甲基化接头24(NEXTflexTM Bisulfite-Seq Barcodes–12，Bioo)的序列为：SEQ ID ttNO.1：tt
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；ttSEQ ID NO.2：tt
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACGGTAGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCttTTG。tt
10.用Ampure XP磁珠纯化加接头产物并定量tt
(1)在反应体系中加入40ul Ampure XP磁珠，用移液器重复混匀，室温静置5分钟。tt
(2)将PCR管放置在magnetic stand上，静置吸附磁珠5分钟，至溶液变澄清。用移液tt器将上清液吸出并丢弃。tt
(3)(保持PCR管在磁力架上)加入200ul 80％乙醇，静置30秒，将乙醇吸出丢弃。tt
(4)重复步骤3)一次。用10ul枪头再吸一次，保证没有乙醇溶液残留。tt
(5)(继续保持PCR管在磁力架上)室温静置至磁珠干燥。tt
(6)在干燥的磁珠上加入51ul水，将PCR管从磁力架取下，用移液器将管中的水和磁珠tt混匀，室温静止2分钟，放在磁力架上吸附磁珠5分钟，将50ul上清转移到新的PCR管中。tt
(7)向PCR管中加入50ul Ampure XP磁珠，用移液器充分混匀，室温静置5分钟。tt
(8)重复步骤2)～5)tt
(9)在干燥的磁珠上加入22.5ul水，将PCR管从磁力架取下，用移液器将管中的水和磁tt珠混匀，室温静止2分钟，放在磁力架上吸附磁珠5分钟，将20ul上清转移到新的PCR管中。tt
(10)将磁力架上管中的2.5ul吸出1ul用Qubit HsDNA定量。tt
实验二tt
CT转化处理(用EZ DNA Methylation-LightningTM Kit，Zymo Research)tt
1.准备工作：tt
(1)分装Lightning Conversion Reagenttt
每管Lightning Conversion Reagent为10个反应的量，如果转化的样品少，可以提前分装tt并避光保存。tt
(2)准备M-Wash Buffertt
无水乙醇：M-Wash Buffer＝4：1tt
24ml M-Wash Buffer中加入96ml无水乙醇。tt
2.实验步骤：tt
(1)按照定量的结果取400ngDNA样品进行CT转化，不足400ng的用所有20ul加接头tt产物，超过400ng的取400ng的产物，加水补置20ul。加130μl Lightning Conversion Reagent到tt20μl DNA样品中，用移液器充分混匀样品。反应的体积不能超过PCR仪有效的最大反应体tt积，否则要分装到多个管中反应(例如，在最大反应体积为50ul的PCR仪中，应将150ul反tt应体系平均分装在3个PCR管中)。tt
(2)将样品管放到循环变温器并按以下表3所示步骤操作：tt
表3：tt
反应结束后平衡到室温进行下述操作或者在4℃下存储(最长20小时)tt
(3)将Zymo-SpinTM IC Column放置在试剂盒提供的Collection Tube中，并添加600μltt的M-Binding Buffer到柱子中。tt
(4)将步骤(2)中的反应液加入含有M-Binding Buffer的Zymo-SpinTM IC Column中，tt盖上盖子将柱子颠倒数次来混合样品。(Optional：如果起始DNA量较小，应先将反应液中加tt入8ug Carrier RNA,再将反应液加入到Column中与M-Binding Buffer混匀)tt
注意：步骤(3)和步骤(4)不能颠倒。tt
(5)离心30秒(>10,000g)，倒掉液体。tt
(6)加100μl M-Wash Buffer到柱中，离心30秒。tt
(7)加200μl M-Desulphonation Buffer到柱中并且在室温(20℃-30℃)下放置15-20分tt钟。温育结束后，离心30秒。tt
(8)加200μl的M-Wash Buffer到柱中，离心30秒。重复一次。tt
(9)空甩1min。tt
(10)将柱子放入新的1.5ml Eppendorf管中，打开盖子静置2分钟tt
(11)加13μl的M-Elution Buffer到柱子中，静置2min，离心1分钟洗脱DNA。tt
(12)重复步骤11，共得到约23ul的回收产物，如果不足23ul，加水补至23ul。tt
实验三tt
PCR扩增tt
1.冰上加入以下试剂并充分混匀(如果样品较多，先将试剂混成mix，再分装到各个反应tt体系之中)。tt
重亚硫酸氢盐处理的DNA 23ultt
KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix(2X) 25ultt
NEXTflexTM引物混合物 2ultt
PCR反应程序如下表4：tt
表4：tt
将PCR扩增后的片段去1ul进行电泳检测最终文库的大小，检测结果见图3。tt
在图3中，最左边是DNA分子大小标记，从下至上的5条带大小分别为：100bp、200bp、tt300bp、400bp和500bp。从图3中可以看出，本发明的扩增后得到的文库的大小都集中在tt250～450bp之间。tt
2.用Ampure XP磁珠纯化PCR产物。tt
(1)在反应体系中加入50ul Ampure XP磁珠，用移液器重复混匀，室温静置5分钟。tt
(2)将PCR管放置在magnetic stand上，静置吸附磁珠5分钟，至溶液变澄清。用移液tt器将上清液吸出并丢弃。tt
(3)(保持PCR管在磁力架上)加入200ul 80％乙醇，静置30秒，将乙醇吸出丢弃。tt
(4)重复步骤3)一次。用10ul枪头再吸一次，保证没有乙醇溶液残留。tt
(5)(继续保持PCR管在磁力架上)室温静置至磁珠干燥。tt
(6)在干燥的磁珠上加入22ul水，将PCR管从磁力架取下，用移液器将管中的水和磁珠tt混匀，室温静止2分钟，放在磁力架上吸附磁珠5分钟，将20ul上清转移到新的PCR管中。tt
(7)将磁力架上的PCR管中剩余的液体取1ul用Qubit hsDNA定量。tt
3.出库tt
给文库编号，原文库用1.5ml管，稀释一份2ng/μl的文科，用500ul管装。tt
实验四tt
将所得到的全基因组甲基化测序文库进行上机测序，得打测序数据，并通过测序数据对tt所建文库进行GC分离度和GC含量进行评估，如图4所示，本发明上述实施例中所构建的全tt基因组甲基化测序文库显示GC分离，且GC含量低。因为经过重亚硫酸盐处理后的文库中，ttC、G含量会低，且由于试验建库策略中得到的序列(reads)保留了链的方向性，所以GC分tt布图上第一端序列(read1)的C含量非常低，T含量非常高，第二端序列(read2)是G含量tt非常低，A含量非常高。tt
生物信息学分析：采用Bimark(Krueger，2011，底层调用Bowtie2)进行甲基化数据的tt参考基因组的比对分析。分析原理如图5所示，Bismark将测序的结果和参考基因组都进行了ttC到T和G到A(反向互补)的转化，将转化后的测序结果和基因组分别进行两两比对，得tt到的比对结果如下表5。tt
表5：tt
从上表5中的各染色体各种类型的甲基化水平可以看出，相比现有技术所能检测到的各tt染色体上的CG、GHG和CHH三种类型的甲基化程度，采用本发明的构建方法，由于避免了tttttt人为因素增加的非甲基化的C的含量，所构建的全基因组甲基化测序文库得到的各染色体上tt的CG、GHG和CHH三种类型的甲基化程度更高，更接近其真实水平，因而检测准确性更高。tt
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员tt来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等tt同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。tt
