芋螺毒液管cDNA文库及其构建方法和用途

芋螺毒液管cDNA文库及其构建方法和用途

　　技术领域tt

　　本发明涉及构建芋螺毒液管cDNA文库的方法，具体地，涉及芋螺毒液管cDNA文库tt及其构建方法和用途。更具体，涉及芋螺毒液管cDNA文库及其构建方法，确定芋螺毒液管tt中芋螺毒素肽全长基因序列的方法。tt

　　背景技术tt

　　芋螺毒素具有高度遗传多样性，其化学结构新颖，富含二硫键，且生物活性功能强，可tt高选择性地作用于配体门控离子通道、电压门控离子通道和G蛋白相关受体等靶标，并能tt对各种离子通道亚型及其亚基进行区分，已成为药理学和神经科学研究的重要工具和新药开tt发的新来源，引起了国际生物学与药学界的广泛关注。虽然芋螺毒素种类繁多，但迄今为止，tt已发现和研究的芋螺多肽还不到估计总数量的千分之一，这表明芋螺毒液是一个潜力无限的tt“天然海洋药物宝库”，尚待人类深入的研究、开发与利用。近年来，研究芋螺毒素、开发tt成新型神经多肽类药物已成为国际上的热门研究方向。tt

　　传统的芋螺毒素药物筛选大多是从自然界活体芋螺的毒液管中分离天然芋螺毒素，然后tt直接用于研究和应用或以此作为药物化学的先导化合物，再进一步设计、加工、合成，筛选tt有效的功能药物。但此方法具有一定的盲目性，筛选周期长。tt

　　因此，关于芋螺毒素的筛选方面的研究仍有待深入。tt

　　发明内容tt

　　本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提tt出一种高通量筛选芋螺毒素全长基因的方法。tt

　　根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建芋螺毒液管cDNA文库的方法。根据本tt发明的实施例，该方法包括以下步骤：将所述芋螺毒液管的总RNA反转录为cDNA；以及tt酶切回收所述cDNA中400-1400bp的片段，以便获得目的片段，所述目的片段构成所述芋tt螺毒液管cDNA文库。由此，利用本发明的方法能够高效构建针对特异长度目的片段的芋螺tt毒液管全长cDNA文库，进一步基于该cDNA文库确定芋螺毒液管中芋螺毒素肽全长基因tt序列，能够有效提高获得芋螺毒素的机率。tt

　　根据本发明的实施例，利用Trizol LS法提取所述芋螺毒液管的总RNA。由此，提取获tttttt得的芋螺毒液管的总RNA质量较高、完整性好、未降解，且操作简单，方便快捷。tt

　　根据本发明的实施例，利用Creator SMART cDNA试剂盒进行所述反转录，其中所述ttCreator SMART cDNA试剂盒中的CDSIII/3primer引物被CDS-3M adapter代替，所述CDS-3M ttadapter的序列为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCGAGGCGGCCd(T)20VN-3’。tt由此，能够有效得到RNA序列的反转录产物cDNA。tt

　　根据本发明的实施例，在进行所述酶切回收之前，进一步包括：将所述cDNA进行均一tt化处理。由此，降低了文库中高拷贝存在的cDNA的丰度，提高了发现随机序列和稀有基因tt的几率，从而能够获得更多低丰度的芋螺毒素cDNA，进而有效克服了基因转录水平上的巨tt大差异给文库筛选和分析带来的障碍。tt

　　根据本发明的实施例，利用Trimmer-Director试剂盒进行所述均一化处理。由此，能够tt有效实现全长cDNA的均一化，且均一化效果较好。tt

　　根据本发明的实施例，利用SfiⅠEnzyme进行所述酶切。由此，能够高效对cDNA进tt行酶切处理，获得特定长度的目的片段，提高酶切效率。tt

　　根据本发明的实施例，利用QIAquick Gel Extraction试剂盒进行所述回收。由此，目的tt片段的回收率较高，且操作简单，方便快捷。tt

　　根据本发明的实施例，进一步包括对各步骤产物进行纯化。由此，可以提高各步骤产物tt的质量，利于后续步骤的进行。tt

　　根据本发明的实施例，进一步包括将所述目的片段连接至载体并转化至大肠杆菌中。由tt此，能够有效建立芋螺毒液管全长cDNA文库。tt

　　根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种芋螺毒液管cDNA文库。根据本发明的实tt施例，该芋螺毒液管cDNA文库是通过期前面所述的构建芋螺毒液管cDNA文库的方法构tt建获得的。由此，基于本发明的芋螺毒液管cDNA文库确定芋螺毒液管中芋螺毒素肽全长基tt因序列，能够有效提高获得芋螺毒素的机率。tt

　　进而，根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种确定芋螺毒液管中芋螺毒素肽全长tt基因序列的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：根据前面所述的构建芋螺毒tt液管cDNA文库的方法，构建所述芋螺毒液管的cDNA文库；对所述cDNA文库进行测序，tt以便获得测序结果；以及基于所述测序结果，确定所述芋螺毒液管中芋螺毒素肽全长基因序tt列。由此，利用本发明的方法能够大大提高获得芋螺毒素的机率，能一次性、大量地获取芋tt螺毒素多肽的cDNA序列，并且得到的芋螺毒素序列可信度高，可对转录组测序数据进行验tt证，弥补转录组数据组装错配问题。tt

　　根据本发明的实施例，利用选自Hiseq2000、SOLID、454和单分子测序装置的至少一tt种进行所述测序。tt

　　根据本发明的实施例，基于所述测序结果，确定所述芋螺毒液管中芋螺毒素肽全长基因tt序列进一步包括：将所述测序结果进行预处理，以便获得经过预处理的测序结果；将所述经tt过预处理的测序结果与芋螺毒素库进行比对，以便确定所述芋螺毒液管中芋螺毒素的芋螺毒tt素肽全长基因序列。由此，可以高效确定芋螺毒素肽全长基因序列，准确度较高。tt

　　需要说明的是，本发明至少具有以下优点：tt

　　（1）本发明是基于编码芋螺毒素肽的mRNA构建全长cDNA文库，获得芋螺毒素的完tt整开放阅读框（ORF），进而获得全长的芋螺毒素前体肽；tt

　　（2）均一化处理可以获得更多低丰度的芋螺毒素cDNA；tt

　　（3）切取针对特异长度的目的片段cDNA，能够大大提高获得芋螺毒素的机率；tt

　　（4）本发明利用的高通量测序方法能一次性、大量地获取芋螺毒素多肽的cDNA序列；tt

　　（5）利用本发明的方法得到的芋螺毒素序列可信度高，可对转录组测序数据进行验证，tt弥补转录组数据组装错配问题。tt

　　本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明tt显，或通过本发明的实践了解到。tt

　　附图说明tt

　　本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和tt容易理解，其中：tt

　　图1显示了根据本发明一个实施例的芋螺毒素总RNA的电泳检测图；tt

　　图2显示了根据本发明一个实施例的二链cDNA合成后的电泳检测图；tt

　　图3显示了根据本发明一个实施例的经过均一化处理的cDNA电泳检测图；tt

　　图4显示了根据本发明一个实施例的经过均一化处理的cDNA二次PCR扩增产物的电tt泳检测图；以及tt

　　图5显示了根据本发明一个实施例的菌落PCR电泳检测图。tt

　　具体实施方式tt

　　下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而tt不能理解为对本发明的限制。tt

　　芋螺毒液管cDNA文库及其构建方法tt

　　根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建芋螺毒液管cDNA文库的方法。根据本tt发明的实施例，该方法包括以下步骤：将所述芋螺毒液管的总RNA反转录为cDNA；酶切tt回收所述cDNA中400-1400bp的片段，以便获得目的片段，所述目的片段构成所述芋螺毒tttttt液管cDNA文库。由此，利用本发明的方法能够高效构建针对特异长度目的片段的芋螺毒液tt管全长cDNA文库，进一步利用该cDNA文库确定芋螺毒液管中芋螺毒素肽全长基因序列，tt能够有效提高获得芋螺毒素的机率。tt

　　根据本发明的实施例，提取所述芋螺毒液管的总RNA的方法不受特别限制，只要能够tt获得完整、未降解的RNA，本领域技术人员可以根据具体情况灵活选择。根据本发明的一tt个实施例，利用Trizol LS法提取所述芋螺毒液管的总RNA。由此，提取获得的芋螺毒液管tt的总RNA质量较高、完整性好、未降解，且操作简单、方便快捷。tt

　　根据本发明的实施例，所述反转录的方法不受特别限制，只能能够有效获得芋螺毒素全tt长cDNA，本领域技术人员可以根据具体实验条件进行选择。根据本发明的一个实施例，利tt用Creator SMART cDNA试剂盒进行所述反转录，其中所述Creator SMART cDNA试剂盒中tt的CDSIII/3primer引物被CDS-3M adapter代替，所述CDS-3M adapter的序列为：tt5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCGAGGCGGCCd(T)20VN-3’（SEQ ID NO：1，tt其中，该CDS-3M adapter序列也可以直接表示为：tt5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCGAGGCGGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVttN-3’）。由此，能够有效得到RNA序列的反转录产物cDNA。tt

　　根据本发明的实施例，在进行所述酶切回收之前，需要将所述cDNA进行均一化处理。tt根据本发明的一个实施例，对将所述cDNA进行均一化处理的方法包括但不限于利用ttTrimmer-Director试剂盒进行所述均一化处理。由此，降低了文库中高拷贝存在的cDNA的tt丰度，提高了发现随机序列和稀有基因的几率，从而能够获得更多低丰度的芋螺毒素cDNA，tt进而有效克服了基因转录水平上的巨大差异给文库筛选和分析带来的障碍。tt

　　为了提高获得芋螺毒素的机率，需要对芋螺毒素cDNA进行酶切处理，以便获得特异长tt度的目的片段cDNA，并对目的片段进行回收。根据本发明的实施例，所述酶切处理的方法tt不受特别限制，只要能够高效获得目的片段cDNA，本领域技术人员可以根据具体条件灵活tt选择。根据本发明的一个实施例，利用SfiⅠEnzyme进行所述酶切。由此，能够高效对cDNAtt进行酶切处理，获得特定长度的目的片段，提高酶切效率。根据本发明的另一个实施例，对tt目的片段cDNA进行回收的方式包括但不限于利用QIAquick Gel Extraction试剂盒进行所述tt回收。由此，目的片段的回收率较高，且操作简单，方便快捷。tt

　　根据本发明的实施例，进一步包括对各步骤产物进行纯化。由此，可以提高各步骤产物tt的质量，利于后续步骤的进行。tt

　　根据本发明的实施例，进一步包括将所述目的片段连接至载体并转化至大肠杆菌中。由tt此，能够有效建立芋螺毒液管全长cDNA文库。tt

　　根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种芋螺毒液管cDNA文库。根据本发明的实tttttt施例，该芋螺毒液管cDNA文库是通过期前面所述的构建芋螺毒液管cDNA文库的方法构tt建获得的。由此，基于本发明的芋螺毒液管cDNA文库确定芋螺毒液管中芋螺毒素肽全长基tt因序列，能够有效提高获得芋螺毒素的机率。tt

　　确定芋螺毒液管中芋螺毒素肽全长基因序列的方法tt

　　进而，根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种确定芋螺毒液管中芋螺毒素肽全长tt基因序列的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：根据前面所述的构建芋螺毒tt液管cDNA文库的方法，构建所述芋螺毒液管的cDNA文库；对所述cDNA文库进行测序，tt以便获得测序结果；以及基于所述测序结果，确定所述芋螺毒液管中芋螺毒素肽全长基因序tt列。由此，利用本发明的方法能够大大提高获得芋螺毒素的机率，能一次性、大量地获取芋tt螺毒素多肽的cDNA序列，并且得到的芋螺毒素序列可信度高，可对转录组测序数据进行验tt证，弥补转录组数据组装错配问题。tt

　　根据本发明的实施例，对所述cDNA文库进行测序的方法不受特别限制，本领域技术人tt员可以根据具体情况灵活选择。根据本发明的一些具体示例，可以利用选自ABI3730xl、ttHiseq2000、SOLID、454和单分子测序装置的至少一种进行所述测序，优选ABI3730xl测序tt仪。tt

　　根据本发明的实施例，基于所述测序结果，确定所述芋螺毒液管中芋螺毒素肽全长基因tt序列进一步包括：将所述测序结果进行预处理，以便获得经过预处理的测序结果；将所述经tt过预处理的测序结果与芋螺毒素库进行比对，以便确定所述芋螺毒液管中芋螺毒素的芋螺毒tt素肽全长基因序列。由此，可以高效确定芋螺毒素肽全长基因序列，准确度较高。tt

　　下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例tt仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按tt照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子tt克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明tt生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。tt

　　实施例1构建芋螺毒液管cDNA文库tt

　　1.1桶形芋螺的获得tt

　　本实施例所采用的桶形芋螺个体于2012年5月26日至6月7日采自海南省三亚市陵水tt县附近海域，2012年6月8日鲜活空运至深圳华大基因研究院水族馆中人工饲养。tt

　　1.2桶形芋螺毒液管总RNA提取tt

　　在无菌实验室中解刨芋螺，取出毒液管，去除黏连的其他组织后直接放入装有液氮的研tttttt钵中，研磨至粉末状。然后采用改进的Trizol LS方法提取总RNA，具体步骤如下：tt

　　（1）将上述获得的桶形芋螺毒液管粉末转移至2.0mL Eppendorf管中，加入1.0mLttTrizol试剂，震荡混匀，静置5min；tt

　　（2）于4℃、12,000×g条件下离心5min，转移上清液至新的2.0mL Eppendorf管中，tt然后加入200μL氯仿，震荡混匀，再于4℃、12,000×g条件下离心10min；tt

　　（3）转移上清液至新的2.0mL Eppendorf管中，然后加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），tt充分混匀，于4℃、12,000×g条件下离心10min；tt

　　（4）重复一次氯仿/异戊醇（24:1）抽提过程；tt

　　（5）转移上清液至新的2.0mL Eppendorf管中，加入等体积异丙醇，于-20℃静置1h，tt然后于4℃、13,600rpm的条件下离心20min，弃上清；tt

　　（6）加入预冷的75%乙醇，于4℃静置3min，然后于4℃、13,600rpm条件下离心3min，tt去上清，重复漂洗一次；tt

　　（7）沉淀置于超净台空气干燥，然后加入40μL Nuclease-free H2O溶解RNA沉淀。得tt到的桶形芋螺毒液管总RNA经电泳和紫外分光光度计检测后，分装并置于-80℃保存。检测tt结果见表1和图1，提取得到的总RNA的OD260/OD280处于RNA正常比值范围1.8～2.2之间，ttRNA带型特殊。tt

　　表1紫外分光光度计检测结果tt

　　

　　1.3桶形芋螺毒液管cDNA文库的构建tt

　　（1）cDNA一链、二链的合成tt

　　采用Creator SMART cDNA Kit（Clonetech，Cat.No634903）合成一链和二链，试剂盒tt中的CDSIII/3primer引物用CDS-3M adapter代替，引物序列为：tt5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCGAGGCGGCCd(T)20VN-3’（SEQ ID NO：1），tt其中，N=A、C、G或T；V=A、G或C。二链cDNA合成后经电泳检测，结果见图2，其tt中，第1泳道为4uL DL2000plus marker，从上到下是5000，3000，2000，1000，750，500，tt250，100bp，第2泳道为5uL的二链cDNA PCR产物。由图2可以看到，二链cDNA PCRtt产物的长度从200bp-5000bp均匀分布，1-2k之间有明显高拷贝的基因。tt

　　（2）均一化处理tt

　　利用Trimmer-Director kit（Evrogen，Cat.No.NK002）对上述获得的cDNA进行均一化tt处理，按照表2加入组分进行DSN处理，经过均一化处理的cDNA电泳检测结果见图3，tt其中，第1泳道为4uL DL2000plus marker，从上到下是5000，3000，2000，1000，750，tttttt500，250，100bp，第2-4泳道为9个循环的Control，1/2酶处理，1倍酶处理。接着将经过tt均一化处理的cDNA进行两次PCR扩增，二次PCR扩增产物的电泳检测结果见图4，其中，tt第1泳道为4uL DL2000plus marker，从上到下是5000，3000，2000，1000，750，500，250，tt100bp；第2泳道是二次PCR产物。然后使用QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN ttCat.No.28104）将合成的双链cDNA的PCR体系纯化。将cDNA溶于15μL无菌水中，取1ttμL测定浓度，用无菌水调节浓度至100ng/μL。杂交前，将杂交液室温放置15-20min，确tt保杂交液中无沉淀。tt

　　从图3可以看出，高拷贝基因1倍酶处理过度，1/2酶处理合适，因此用1/2酶处理进tt行二次PCR。由图4可以看出，通过二次PCR使一次PCR更集中。tt

　　表2DSN处理梯度tt

　　

　　（3）目的片段回收tt

　　采用QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN Cat.No.28104）进行均一化后的双链cDNAtt纯化，终体积用80μL ddH2O溶解。切胶回收具体操作如下：tt

　　a.加入下列体系进行酶切：tt

　　

　　b.50℃温浴2h，酶切产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，60V电压电泳2h，进行检测；tt

　　c.将marker用EB染色，在紫外下标出400bp和1400bp区域；tt

　　d.将酶切产物的400-1400bp区域和大于1400bp区域切下，用QIAquick Gel Extraction ttKit(QIAGEN Cat.No.28704)回收，测定浓度。tt

　　（4）连接转化tt

　　a.将下列组分加入0.2mL PCR管中，混匀，16℃，连接过夜；tt

　　

　　b.70℃，变性10分钟后，冰上放置5min，短暂离心，将连接产物加到0.25um Milliporett纯化膜上脱盐纯化1h；tt

　　c.取2μL产物，电压2.1KV电击转化到大肠杆菌DH10B中后，放入37℃摇床，120rpmtt复苏1h，加入50%体积的80%甘油；tt

　　d.取2μL菌液涂于氯霉素平板上，37℃培养过夜。tt

　　（5）PCR菌落鉴定tt

　　a.取2μL菌液涂平板(直径15cm)，计算平板上的库容数，约为2000个，据此计算出tt菌液滴度为1.0×106cfu/mL，整个连接库容大于3×106。菌液滴度(cfu/mL)=平板菌落数/平tt板菌液体积；库容(cfu)=菌液滴度×菌液总体积；tt

　　b.从文库中随机挑取30个克隆进行菌落PCR鉴定，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCRtt产物的片段大小。电泳结果见附图5，其中，第1泳道为4μL DL2000plus marker，从上到tt下是5000，3000，2000，1000，750，500，250，100bp；第2-31泳道为400-1400bp及大tt于1400bp两个文库的30个随机克隆菌落PCR产物。由图5的结果可知，插入片段多大于tt750bp且分布在0.75-3k之间，符合建库标准。tt

　　实施例2确定芋螺毒液管中芋螺毒素肽全长基因序列tt

　　下面基于实施例1构建的芋螺毒液管cDNA文库进行以下实验：tt

　　2.1桶形芋螺毒液管cDNA文库的高通量测序tt

　　从构建的400-1400bp文库中随机挑选10000个单克隆，进行高通量测序。tt

　　a.取构建好的400-1400bp文库菌液，用LB液体培养基稀释700倍，每个平板涂布200ttμL稀释好的菌液；tt

　　b.将涂好的LB固体平板，闭盖倒放在37℃温室中过夜培养16-18h后，放入4℃冷库tttttt显色及保存；tt

　　c.96孔深孔板中加入900μL LB菌液，挑取饱满、大小相同、颜色为乳白的单个菌落，tt放到96孔板中，封口膜封口，220rpm、37℃条件下培养14h；tt

　　d.于室温，4000rpm条件下离心4min，弃上清，倒扣在吸水纸上吸干废液后，提取质tt粒。tt

　　e.按如下体系加入试剂，ddH2O补至5μL。tt

　　

　　f.样品放于PCR仪上，调程序首先96℃2min，然后30个循环进行以下程序：96℃10ttS，50℃10S，60℃3min；tt

　　g.PCR程序结束后，对反应产物进行纯化，纯化每孔加入5μL去离子甲酰胺，1000rpmtt离心1min后，采用ABI3730xl仪器进行高通量测序。tt

　　2.2序列处理与比对分析tt

　　a.使用phrep软件对下机数据进行basecalling操作后，用cross_match软件去除载体，tt获取raw data数据；tt

　　b.对已经去除载体的序列进行去polyA、过滤短的序列，获得Clean数据；tt

　　c.将Clean数据与本地构建的芋螺毒素库进行比对，注释鉴定毒素序列；tt

　　d.共得到194条完整毒素序列，去重复后得到完整毒素序列65条，序列分析结果见表tt3。tt

　　表3芋螺cDNA测序序列分析结果tt

　　由表3可以看出，发明人发现了完整的芋螺毒素肽序列65条，其中6条此前已被发现；tt超家族12种，其中2种为首次发现的新超家族；半胱氨酸模式12种，其中3种少于4个半tt胱氨酸，待确定。tt

　　在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、tt或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包tt含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指tt的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个tt或多个实施例或示例中以合适的方式结合。tt

　　尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本tt发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的tt范围由权利要求及其等同物限定。tt