过敏原检测

过敏原检测

　　相关申请的引用

　　本申请要求以下申请的优先权：2014年7月18日提交的美国临时申请序列号62/026,361；2014年6月10日提交的美国临时申请序列号62/009,958；2014年5月9日提交的美国临时申请序列号61/991,068；2014年2月11日提交的美国临时申请序列号61/938,528；和2013年10月28日提交的美国临时申请序列号61/896,399；以上申请中的每一个的内容全文以引用方式并入本文。

　　对序列表的引用

　　本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表作为文件提供，所述文件标题为20661000PCT7SEQLST.txt，创建于2014年10月28日，大小为49,487字节。电子格式的序列表中的信息全文以引用方式并入本文。

　　技术领域

　　发明领域

　　本发明涉及用于过敏原检测的方法、装置和分子。

　　背景技术

　　发明背景

　　过敏是影响世界范围内成百上千万人的严重医学病状，其中约1千5百万人在美国，包括许多儿童。在过敏反应期间，免疫系统错误地将过敏原作为威胁的目标，并且攻击它。过敏反应可以影响皮肤、消化系统、胃肠道、呼吸系统、循环系统和心血管系统；在一些过敏反应中，影响多个器官系统。过敏反应从轻微至严重或者危及生命。严重的症状可以包括呼吸困难、低血压、胸痛、意识丧失和过敏症。患有过敏的人目前通过避免可能含有特异性过敏原的食品来控制他们的过敏。这些限制对患者的生活品质具有重大影响，并且还没有用于评估食品的真实过敏原含量的方法。在美国，每三分钟就有某人因食品过敏症状被送至急救室。用于测定过敏原存在的快速方法将有巨大的益处。允许患者测试他们的食品并且精确且即时地测定过敏原含量的便携式装置将有益于提供是否要进食该食品的知情决定。

　　McKay的美国专利第5,824,554号示教一种用于检测食品过敏原的餐垫，所述餐垫由吸收材料和施加至所述垫上的隔离区的化学试剂的小斑点形成。如果食品产品含有过敏原物质，化学试剂将改变其外观以表明食品产品中存在过敏原物质。检测限和检测特异性由斑点中使用的化学试剂限制。缺点是：当分析固体食品产品时，因为固体食品产品与斑点试剂之间的长反应时间，很可能是假的阴性。

　　Jung等人的美国专利申请公开第2008/0182339号和美国专利8,617,903示教一种检测过敏原的方法，所述方法通过以下来进行：用被配置以用于分析一种或多种过敏原指示剂的微流控芯片处理样品，用一个或多个检测单元检测过敏原指示剂，和用一个或多个显示单元显示结果。检测系统包括微流控芯片、试剂递送单元、离心单元、分析单元、检测单元、显示单元和记录单元。装置并不充分紧凑，不便携带。

　　Scott等人的美国专利申请公开第2010/0210033号示教一种用于检测食品过敏原的便携式装置，所述便携式装置包括壳体、样品入口、用于表明样品中存在潜在过敏原的器件和包含针对潜在过敏原的抗体的过敏原检测芯片，其中所述抗体用可检测的标签标记。

　　Royds的美国专利第7,527,765号示教一种用于鉴定食品样品中有害污染物的存在的食品测试装置，所述食品测试装置包括一次性的样品容器、包括叶片部件的机械液化器、测试供应隔室，所述测试供应隔室具有对有害污染物有亲和性的试剂，并且所述测试供应隔室能够检测液化食品样品中的有害污染物并且一识别到有害污染物就产生视觉提示。

　　适体以及装置和在检测食品蛋白质中使用它们的方法公开于若干专利和专利申请(所述专利和专利申请中的每一个全文均以引用方式并入本文)中，包括：Kim等人的美国专利第8,633,140号，其示教一种官能化聚丁二炔分子传感器的微阵列；Brunner等人的美国专利第8,618,046号，其示教一种用于使用基于适体的抗CETP抗体诱导抗原治疗动脉粥样硬化的方法；和Rasooly等人的美国专利第8,614,466号，其示教一种使用称为“电渗流”(通过无规电阻网络的电流)的物理原理电学检测半导体中的生物分子结合的方法和系统。在一个实施方案中，用于结合靶分子的捕获分子可以是适体。Lowery,Jr.等人的美国专利第8,563,298号示教用于分析物的收集和检测的NMR系统和方法。Yokota等人的美国专利第8,507,458号示教一种用于递送核酸以通过使用内源性乳糜微粒抑制靶基因表达的系统，其中所述核酸可以是适体。Herzog等人的美国专利第8,236,933号示教具有降低的肽YY(PYY)表达水平的转基因动物和使用所述转基因动物用于筛选适体库并且鉴定PYY的激动剂和拮抗剂的方法。Lieber等人的美国专利第8,232,584号示教一种用于检测分析物的基于荧光的纳米尺度线生物传感器装置和方法，其中适体可以相对于所述纳米尺度线间接固定。Hornbeck等人的美国专利第7,977,462号示教用于检测并且定量恶性上皮肿瘤(carcinoma)和/或白血病中鉴定的新酪氨酸磷酸化位点的横向流(lateral flow)装置。Mata等人的美国专利第7,973,079号示教用于检测可以调节血清视黄醇、视黄醇结合蛋白(RBP)和/或运甲状腺素蛋白(TTR)的活性或可用性的大分子及其它分析物的生物传感器。Gordon等人的美国专利第7,855,057号示教用于检测样品中的少量蛋白质异形体(例如，由于替代剪接的蛋白质异形体，或者不同疾病蛋白质异形体或降解产物)的方法、试剂和设备，包括使用捕获剂的组合，其中所述捕获剂可以为适体。Vukicevic等人的美国专利第7,850,964号示教用于诊断并且治疗骨和软组织的缺陷和病症的骨形态发生蛋白(BMP)(例如BMP-1溶胶原c-蛋白酶)的核酸生物传感器。

　　Buchner等人的PCT公开WO2009/040113、WO2010/108657和WO2013/104540中描述了过敏毒素C5a-(互补因子5a)-结合适体。Buchner等人还在PCT公开WO2009/019007中描述了结合至CXC趋化因子基质细胞衍生因子-1(SDF-I)的适体。

　　分子信标(MB)是含有荧光团和淬灭剂部分二者的发夹形状寡核苷酸，且其作用就像开关。当处于闭合状态时，荧光团和淬灭剂聚到一起并且通过共振能量转移猝灭(“关闭”)荧光。当构象变化打开发夹结构并且荧光团和淬灭剂分离时，淬灭剂不能再猝灭并且荧光被恢复(“打开”)。MB在需要探针具有高灵敏性和优异的分子识别特异性的检测装置和诊断测定中特别有用；MB是极其靶特异性的，忽略相差小至单个核苷酸的核酸目标序列。MB的其它优点为：(1)敏感性可以允许实时监控；(2)低背景信号允许大于200倍的荧光增强；(3)MB允许“无需分离的检测”，其中将探针-靶杂交体从过量的未杂交探针隔离是不可能或不希望的。由MB环-茎结构提供的特异性已经被证明可适用于各种生物环境中。本文公开的组成物、方法和装置可适用于基于溶液(体外)的RNA–DNA相互作用的研究、蛋白质-DNA相互作用研究、生命系统内的测量和生物传感器设计。例如，本文描述的组成物可用于体外研究，诸如在PCR期间DNA/RNA扩增的实时监控；用于临床诊断的快速并且可靠的突变检测(Xiao等人，(2009)Fluorescence Detection of Single Nucleotide Polymorphisms viaa Single,Self-Complementary,Triple-stem DNA Probe.Angew Chem.Int.Ed.Engl.48(24):4354-4358)；光谱基因分型(Kostrikis等人，Science，1998，279:1228)；DNA粘端配对(SEP)分析；RNA的亚细胞定位和细胞运输途径的可视化(Tan等人，(2005)MolecularBeacons for Bioanalytical Applications.Analyst 130:1002-1005)。

　　示例性分子信标在Leung等人，2011(Nucleic Acids Research,2012,40(3):941–955)中述评，并且在以下专利中描述：Litman等人的美国专利第8,188,255号，其示教与癌症(cancer)有关的微RNA(miRNA)序列，和它们的使用适体和分子信标的检测；Meyers等人的美国专利第7,282,360号，其示教新蛋白激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶、脯氨酰寡肽酶、胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和泛素羧基末端水解酶家族成员，本文称作“53070、15985、26583、21953、m32404、14089和23436”并且使用适体或分子信标一般地公开了它们的检测；和Kapeller-Libermann等人的美国专利第6,730,491号，其示教三种据说新颖的蛋白激酶家族成员，本文称作“2504、15977和14760”并且使用适体或分子信标一般地公开了它们的检测。

　　仍需要用于快速并且精确地检测过敏原的便携并且可重复使用的装置。还存在用单个装置检测多个过敏原的需求。

　　发明内容

　　本发明提供用于各种类型样品中的过敏原检测的装置、方法和检测分子。

　　本发明的一个方面为检测样品中的一种或多种过敏原的方法，所述方法包括以下步骤：(a)获得怀疑含有过敏原的样品，(b)用一种或多种缓冲剂消解(a)的样品，(c)用检测分子接触消解的样品，(d)用激发器件(excitation means)处理接触的样品，和(e)使检测分子和过敏原的相互作用可视化。

　　本发明的另一方面为用于检测样品中的过敏原的装置。所述装置包括：主体，所述主体被配置以支撑以下组件：(a)用于收集和处理样品的筒夹；((b)用于提供荧光激发的器件；(c)用于过滤荧光发射的滤光器；(d)用于混合过敏原与检测分子的检测腔室；(e)用于检测荧光发射的检测器，所述检测器包括用于数字化检测信号的器件；和(f)用于接收检测信号并且显示过敏原的检测的显示窗口。

　　附图说明

　　上述及其它目的、特征和优点将由本发明的具体实施方案的以下说明变得明显，如附图中例示。示意性附图不必按比例。相反，重点在于例示某些操作原理。

　　图1是根据本发明的一个实施方案的检测装置10的示意图。

　　图2A是本发明的检测装置的另一实施方案中使用的筒夹1400的示意图，其示出将注射器柱塞1408下压到注射器1406的筒中时，筒夹内流体的流向。流体(消解缓冲剂D)通过单向阀1422注入到混合腔室1410中。

　　图2B是图2A的相同筒夹1400的示意图，其示出将注射器柱塞1408从注射器1406的筒收回时，筒夹内流体的流向。流体通过第二单向阀1424从检测腔室1426抽回至注射器1406的筒。

　　图3示出检测装置2000的另一实施方案，所述检测装置2000为沙漏的基本形状，所述沙漏具有设置在其前后突起部(分别为2015和2025)之间的抓握手柄2017。

　　图4示出由信号多核苷酸SPN-A*200表示的检测分子的次级序列，所述信号多核苷酸SPN-A*200包括核心序列202、荧光团204、淬灭剂206和接头序列208。

　　图5示出由发夹式信号多核苷酸SPN-E300表示的检测分子与其靶分子溶菌酶之间的反应。同样示出的是适体核心序列302、荧光团304和淬灭剂306。

　　图6示出由二聚信号多核苷酸SPN-E*400表示的检测分子(包括退火接头序列408)与其靶分子溶菌酶之间的反应。同样示出的是适体核心序列402、荧光团404和淬灭剂406。

　　图7A示出通用信号多核苷酸500与作为分子靶的溶菌酶之间的反应。信号多核苷酸500具有核心序列502，所述核心序列502具有连接的荧光团504。信号多核苷酸500还包括接头序列508，所述接头序列508具有连接的淬灭剂506。接头序列508退火到核心序列502，从而使淬灭剂506与荧光团504紧密接近。溶菌酶结合至核心序列502，生成具有发夹的次级结构，所述次级结构引起接头序列508释放，使得淬灭剂506不再猝灭荧光团504的荧光。

　　图7B是通用发夹式信号多核苷酸600与作为分子靶的溶菌酶之间的反应。信号多核苷酸600具有核心序列602，所述核心序列602在5'-端具有连接的荧光团，并且在3'-端具有连接的淬灭剂606。核心序列602具有发夹区段，所述发夹区段使淬灭剂606足够接近荧光团604以猝灭荧光团604的荧光。溶菌酶结合至核心序列602破坏发夹结构，并且导致淬灭剂606移动远离荧光团604，使得淬灭剂606不再猝灭荧光团604的荧光。

　　图8是利用SPN-E获得的溶菌酶荧光检测图(519nm处的光学密度比溶菌酶的浓度)。

　　图9A是示出由SPN-E*获得的三种具有改变的溶菌酶浓度的样品的溶菌酶荧光检测的程度(519nm处的光学密度)的条形图。

　　图9B是示出由SPN-E获得的三种含有改变的皮克量溶菌酶的样品以及含有蛋清(egg white)和BSA的样品的溶菌酶荧光检测的程度(519nm处的光学密度)的条形图。蛋清天然地含有溶菌酶。

　　图10是示出由SPN-E*获得的对于四种含有改变的溶菌酶浓度的样品(包括具有与牛奶或BSA混合的溶菌酶的两种样品)的溶菌酶荧光检测的程度(519nm处的光学密度)的条形图。

　　图11A是示出由SPN-E*获得的七种单独或在混合蛋白质溶液中的具有改变的蛋清稀释度的一系列样品的溶菌酶荧光检测的程度(519nm处的光学密度)的条形图。蛋清天然地含有溶菌酶。

　　图11B是示出由SPN-E获得的单独的稀释蛋清和混合蛋白质溶液(BSA)中的稀释蛋清的溶菌酶荧光检测的程度(519nm处的光学密度)的条形图。蛋清天然地含有溶菌酶。

　　图12是证明SPN-E与溶菌酶特异性结合的条形图。蛋清天然地含有溶菌酶。

　　图13A是由SPN-A*获得的花生过敏原ara h1的荧光检测图(519nm处的光学密度比花生酱的浓度)。

　　图13B是示出由SPN-A*获得的一系列的每种样品含有改变的SPN-A*浓度的样品的花生过敏原ara h1的荧光检测(519nm处的光学密度比花生酱的浓度)的条形图。

　　图14A是由SPN-A*获得的，混合SPN-A*与花生酱样品之后的时间作为函数，花生过敏原ara h1的荧光检测(519nm处的光学密度)图。BSA作为用于比较的对照图。

　　图14B是由SPN-E*获得的，混合SPN-E与溶菌酶样品之后的时间作为函数，溶菌酶的荧光检测(519nm处的光学密度)图。BSA作为用于比较的对照图。

　　图15是示出含有10％、20％和40％乙醇(EtOH)的基于PBS的缓冲剂中提取的总蛋白的直方图。GF是指不含谷蛋白。

　　图16是示出含有pH8.0的Tris碱、5mM EDTA和20％乙醇的基于Tris的缓冲剂(DOTS缓冲剂)和Neogen缓冲剂中谷蛋白回收率的直方图。

　　图17A示出修饰的基于Tris的缓冲剂A、C和D中的谷蛋白回收率(ppm)。

　　图17B示出修饰的基于Tris的缓冲剂B、E和F中的谷蛋白回收率(ppm)。

　　图18A和图18B示出基于Tris的缓冲剂A+和Neogen提取缓冲剂中的谷蛋白回收率。

　　图19示出基于Tris的缓冲剂A+和Neogen提取缓冲剂中的牛奶过敏原回收率。1:10稀释样品用于测试。示出在基于Tris的缓冲剂A+中，对于掺料预烘烤而言为10％牛奶过敏原回收率，对于掺料后烘烤为100％回收。

　　图20A示出基于Tris的缓冲剂A+和Neogen缓冲剂中的烘烤后过敏原的回收率。图20B示出基于Tris的缓冲剂A+和Neogen缓冲剂中的预烘烤过敏原的回收率。

　　图21A示出基于PBS的缓冲剂：P+缓冲剂和P-缓冲剂中的预烘烤过敏原的回收率。图21B示出基于PBS的缓冲剂：P+缓冲剂和P-缓冲剂中的烘烤后过敏原的回收率。

　　图22A和图22B示出基于PBS的K缓冲剂中与Elution ELISA试剂盒中的那些相比的过敏原的回收率。图22A示出K缓冲剂预烘烤回收率，并且图22B示出K缓冲剂烘烤后回收率。

　　图23示出基于Tris的T缓冲剂和基于PBS的K缓冲剂之间腰果过敏原回收率的比较。在此实验中，香草布丁用作食品基质。

　　图24示出基于PBS的P+缓冲剂中MB6与蛋清的结合亲合力，表明P+缓冲剂降低了SPN对蛋清的结合亲合力。

　　图25是P+缓冲剂和P-缓冲剂中SPN MB-5结合蛋清的荧光检测图，表明明胶对于MB-5的结合的作用是不显著的。

　　图26A和图26B示出K缓冲剂中MB6和MB4对蛋清的结合亲合力，表明K缓冲剂增加SPN的结合亲合力。

　　图27A示出基于PBS的K缓冲剂中MB5对纯蛋清蛋白质的结合亲合力。图27B示出基于Tris的T缓冲剂中MB5对纯蛋清蛋白质的结合亲合力。

　　图28A是示出掺入巧克力蛋糕中的溶菌酶的MB6检测的条形图。图28B是示出掺入巧克力蛋糕中的溶菌酶的MB4检测的条形图。

　　图29A是示出含有鸡蛋的食品中的溶菌酶的MB6检测的条形图。图29B是示出含有鸡蛋的食品中的溶菌酶的MB4检测的条形图。

　　图30A是结合至纯花生粉的MB7的荧光检测图。图30B示出：当掺入马克杯蛋糕(MC)基质中时，MB7以1ppm的较低水平特异性地结合花生(P)细粉而不是蛋清(EW)或卵类粘蛋白(ovo)。

　　图31A是结合至纯花生细粉的MB9的荧光检测图。图31B示出：当掺入马克杯蛋糕(MC)基质中时，MB9以1ppm的较低水平特异性地结合花生(P)细粉而不是蛋清(EW)或卵类粘蛋白(ovo)。

　　图32A示出以低ppm水平掺入预烘烤和烘烤后蛋糕中的花生的MB7检测。图32B是示出图32A中转换成ppm的MB7检测的条形图。

　　图33A示出以低ppm水平掺入预烘烤和烘烤后蛋糕中的花生的MB9检测。图33B是示出图33A中转换成ppm的MB9检测的条形图。

　　图34是示出与ELISA测定中的花生回收率相比的K缓冲剂中的MB7和MB9回收率的直方图。

　　图35A是示出诸如卷饼和冰淇淋的处理过的食品中稀释的花生过敏原的MB7检测的直方图。图35B是示出诸如卷饼和冰淇淋的处理过的食品中稀释的花生过敏原的MB9检测的直方图。

　　图36A示出基于PBS的K缓冲剂中MB9对纯花生蛋白质的结合亲合力。图36B示出基于Tris的T缓冲剂中MB9对纯花生蛋白质的结合亲合力。

　　图37A是时间0分钟和时间30分钟之间的MB7检测信号的比较。图37B是时间0分钟和时间30分钟之间的MB9检测信号的比较。

　　图38A是示出不同样品大小的Twinkies中牛奶过敏原回收率的直方图。图38B是示出不同样品大小的布丁中牛奶过敏原回收率的直方图。图38C是示出掺入不同样品大小的碎牛肉中的牛奶过敏原回收率的直方图。

　　图39示出不同大小Twinkies样品中MB5对溶菌酶的结合亲合力，表明增加的样本大小可以降低MB5结合。

　　图40A示出使用不同的分离器(GM：轻柔MAC；MM：迷你MAC；低：连续分离器低功率；高：连续分离器高功率)来自的鸡肉的牛奶过敏原回收率。图40B示出来自使用不同分离器的Twinkies的牛奶过敏原回收率。图40C示出来自使用不同分离器的糖霜(frosting)的牛奶过敏原回收率。

　　图41是示出使用不同分离器的MB5结合的条形图。

　　具体实施方式

　　发明详述

　　除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人士一般理解的相同意义。虽然类似或等同于本文描述的那些的方法和材料可用于本发明中展示的方法的实践或测试，合适的方法和材料在以下详述、实例和权利要求中进行了描述。其中使用参考标号以描述各种特征，类似的参考标号用于描述具有类似功能的特征。

　　为确保食品安全性而使用分析装置尚未先进到履行其承诺的点。特别地，尚未开发出用于大量已知过敏原的检测的基于简单又精确、灵敏并且快速的检测流程的便携式装置。在食品安全控制的情况下的基于适体的分析的最近述评中的一个表明：尽管已经开发用于过敏原检测的大量商业分析工具，它们中的大多数依靠免疫测定。还表明针对此组成分的适体选择正在兴起(Amaya-González等人，Sensors 201，13，16292-16311，全文以引用方式并入本文)。

　　本文描述的方法和装置考虑使用基于核酸的检测器分子用于过敏原的检测。在广泛概念中，除食品安全性之外，本文描述的方法和装置还可以用于各种应用中的样品中任何蛋白质含量的检测，诸如例如民用和战场环境中疾病的医疗诊断、环境监测/控制和用于生物武器检测的军事用途。在更广泛的应用中，本发明的方法和装置可用于检测基于核酸的检测器分子所结合的任何生物分子。作为一些非限制实例，检测方法和装置可以用于癌症标记物的现场检测、野外诊断(化学试剂暴露、外伤性头部创伤等等)、第三世界应用(TB、HIV测试等等)、急救护理(中风标记、头部创伤等等)和许多其它用途。

　　如以下描述，这类基于核酸的检测器分子的一个具体种类是适体。本发明人已经认识到适体特别适于为检测器分子提供核心序列，因为SELEX处理的迭代方法(下文描述)可用于产生基本上针对任何分子靶(或者其部分)的适体。这类适体具有针对它们的靶的高亲合力和结合特异性。本发明人还认识到使用适体作为核心序列生产信号多核苷酸(下文详细描述)允许便利地连接至各种报道分子。基于适体核心序列的信号多核苷酸的相对低的生产成本对于开发诸如本文描述的传感器装置的生物分子传感器的简单又有效的检测测定的目的也是有利的。最后，本发明人认识到各种食品产品基质中的过敏原检测可以使用基于适体的检测器序列(诸如信号多核苷酸)方便地执行，所述信号多核苷酸特别适于在可反复使用的简单并且便携的传感器中使用，所述传感器在环境温度下具有高的灵敏性和可重现性以确保食品安全性。

　　通过非限制实例的方式，已经报告用于体外选择特异于过敏、毒性过敏原β-羽扇豆球蛋白Lup an 1的单链DNA适体的过程(Nadal等人，(2012)DNA Aptamers against theLup an 1Food Allergen.PLoS ONE 7(4):e35253)。简要地说，纯化来自羽扇豆的β-羽扇豆球蛋白亚基并且化学交联至磁珠。肽质量指纹谱用于确保磁珠表面上存在β-羽扇豆球蛋白。具有1014的群体变异性的DNA库池使用硫代磷酸化正向引物和T7基因6外切核酸酶进行扩增以生成单链93-mer DNA序列。用蛋白质缀合磁珠孵育库池。使用PCR监控各轮SELEX，比较从蛋白质缀合珠释放的DNA的量与得自非缀合珠的DNA的量。使用酶联寡聚核苷酸吸附试验(ELONA)和表面等离激元共振(SPR)监控进化。在15轮SELEX之后，克隆富集的DNA、测序并且鉴定共有区基序，评估这些基序的亲和力和特异性，并且预测它们的次级结构。使用竞争性ELONA评估所得适体，以检测和定量β-羽扇豆球蛋白羽扇豆过敏原。因此，选择具有3.6x10-7KD的原始93-mer并且截短成具有1.7x10-9KD的11-mer(Nadal等人，(2013)Probinghigh-affinity11-mer DNA aptamer against Lup an 1(β-conglutin).Anal.Bioanal.Chem.405:9343–9349)。此截短的11-mer是富鸟嘌呤的，并且预测将折叠成由堆叠的鸟嘌呤四联体组成的G-四链体结构，其由鸟嘌呤之间的Hoogsteen-型氢键和位于四联体之间的阳离子的相互作用来稳定化。利用荧光共振能量转移(FRET)的灵敏方法近来也被报道用于使用截短的11-mer抗-β-羽扇豆球蛋白适体的高亲合力二聚体形式来快速并且灵敏的检测Lup an 1，各单体适体侧接有供体/受体部分。不存在靶的条件下的二聚体形式由于从激发荧光团至近端第二荧光团的FRET而产生荧光发射。然而，在添加β-羽扇豆球蛋白时，特异性相互作用诱导双适体结构的变化，从而导致荧光发射增加。方法是高度特异性并且灵敏的，具有150pM的检测限，提供用于在室温下仅1分钟内直接检测食材中毒性β-羽扇豆球蛋白亚基的有效工具(Mairal等人，FRET-based dimeric aptamer probe forselective and sensitive Lup an 1allergen detection.Biosensors andBioelectronics,(2014)54:207–210)。

　　可以使用本文描述的装置检测的过敏原家族包括来自诸如花生的豆类的过敏原、树坚果、蛋、奶、豆、香料、种子、鱼、贝类、谷蛋白、稻米、水果和蔬菜。过敏原可以存在于细粉(flour)或粗粉(meal)中。装置能够确认这些过敏原的存在或不存在以及定量这些过敏原的量。

　　在一些实施方案中，可以设计和测试靶向检测8种主要食品过敏原(即小麦、鸡蛋、牛奶、花生、树坚果、鱼、贝壳和大豆)的适体。八种主要食品过敏原组成食品过敏的90％。选择具有高选择性、特异性和稳定性的适体，并且进一步标记为检测分子。

　　本发明的装置和方法可以检测并且鉴定样品中的病原微生物。可以检测的病原体包括细菌、酵母菌、真菌、病毒和病毒样生物体。病原体可以引起动物和植物的疾病；污染食品、水、土壤或者其它来源；或者在军用领域用作生物制剂。装置能够检测并且鉴定这些病原体。

　　另一重要的应用包括本发明的方法和装置用于医疗护理的用途，例如诊断疾病、给疾病进展分级和监控某治疗的响应。

　　食品安全性领域外的扩展应用包括由军事组织现场使用、测试抗生素和生物药品、对诸如杀虫剂和肥料的产品进行环境试验、测试散装的诸如咖啡因和尼古丁的饮食补充剂和各种食品组分和添加剂、以及测试诸如唾液、皮肤和血液的临床样品以确定个体是否已经暴露于显著性水平的个别过敏原。

　　本发明的组成物

　　本文描述的是用于设计、制备、使用和生产用于过敏原检测的测定、装置和/或试剂盒的化合物、组成物和方法。

　　如本文使用，术语“过敏原”是指导致、引出或者触发受试者中免疫反应的化合物、物质或者组合物。因此，过敏原通常被称为抗原。

　　能够或者确实以允许样品中的这种过敏原检测的方式与一种或多种过敏原相互作用和/或结合的任何分子在本文称为“过敏原检测分子”或者“检测分子”。

　　检测装置和筒夹

　　本发明的一个方面是使用筒夹的检测装置。在一个实施方案中，本发明的检测装置是可以特异性地检测各种食品样品中的过敏原的微小(minute)浓度的手持产品。

　　在一些实施方案中，检测装置被设计成简单、快速(小于5min)的一步执行。

　　在一些实施方案中，设计检测装置以使得对特异性过敏原独特的一次性筒夹将被置于用于检测独特于该筒夹的过敏原的装置中。

　　参照图1，示出检测装置10的一个实施方案。装置具有主要支撑主体12，所述支撑主体12可以由塑料或者其它合适的支撑材料形成。支撑主体12提供有用于保持筒夹14在主体12的工作表面上的位置的器件。现在描述筒夹的一个一般实施方案，并且筒夹1400的另一实施方案的描述将在下文提供。筒夹14包括用于保持样品的收集腔室16，样品诸如待用于测试过敏原的存在的食品样品S。在某些实施方案中，筒夹14是一次性的。在某些实施方案中，收集腔室16提供有用于消解样品的缓冲剂容积。缓冲剂的容积可以在约100μL至约500μL范围内。装置10中还包括样品收集机构18，所述样品收集机构18可以包括微真空泵(未示出)、探针20和探针保持器(未示出)的组合。筒夹14还包括具有提取膜22的蛋白质提取腔室。真空泵可用于增加提取的蛋白质穿过提取膜22的流动速率。一次性筒夹中还包括两个检测腔室24a和24b。检测腔室24a容纳阴性对照，并且检测腔室24b容纳用于发送目标分子靶(诸如过敏原)的存在信号的信号多核苷酸。

　　发光二极管(LED)26a和26b由邻近于筒夹14的主体12支撑。LED26a和26b基本上相同，并且提供适合于激发信号多核苷酸的荧光团的激发波长的光。LED 26a和26b的光路被引入它们的对应检测腔室24a和24b中。

　　筒夹14外的主体12还支撑滤光器28和对应的荧光检测器30a和30b，所述滤光器28用于接收来自检测腔室24a和24b的发射的荧光并仅传输所关心的一个或多个波长，所述荧光检测器30a和30b包括用于将光电倍增管(PMT)信号转换成有用的读数(即测量荧光输出并且将它转换成数字信号)的处理器。然后在对应的显示窗口32a和32b中提供对应于数字信号的数据，所述显示窗口32a和32b充当用户界面屏幕。在图1中示出的本实例中，两个显示窗口都显示读数“阴性”，则表明对照正发挥其预期功能，并且样品的分析表明它不含达到任何有意义水平的所测试的过敏原。

　　在某些实施方案中，装置10的长度是大概10cm长。将得自探针20的样品运输至收集腔室16。探针20用于获得众多样品(大约5种样品至多200mg)。当装置非激活时，收集探针20将被遮挡在装置10内部，并且由电子命令或手动暴露。

　　其它可以提供的特征包括但不限于：例如用于获得食品产品的核心样品的钻机。样品收集探针可以任选地提供有盖子。

　　在一些实施方案中，收集腔室具有足够容纳100-500μL的消解缓冲剂的容积。使用研磨机(drill)使运输至收集腔室的食品样品均质化。消解缓冲剂可以选自PBS或者具有2％Tween的TRIS、盐浓度(0mmol/L、200mmol/L或1mol/L NaCl)和脱脂奶粉(0至25％)。为了加速消解，通过提供诸如胶原酶的蛋白酶来添加酶消解可能是所需的。

　　在一些实施方案中，可以使用一种或多种蛋白质提取膜，藉此消解的溶液将传递至蛋白质提取膜。溶液流动通过收集纯化的蛋白质的膜。膜含有0.5nM至0.5μM之间的孔，并且能够分离小于200KDa的蛋白质。因为时限是重要的，真空可用于增加流动速率。已知大量合适的蛋白质提取柱，并且可以经调试用于本装置的某些实施方案，而无需过度的实验。消解之后，食品标本从蛋白质提取膜流至两个检测腔室24a和24b。阴性对照腔室24a含有仅用淬灭剂分子标记的检测分子(例如适体)，并且另一个腔室24b含有信号多核苷酸(SPN)，所述信号多核苷酸(SPN)用荧光标记物和淬灭剂分子二者标记。一旦纯化的蛋白质进入各检测腔室，对应的LED 26a和26b将发光并且触发荧光团的激发。

　　在一些实施方案中，通用蛋白质提取缓冲剂回收足够过敏原蛋白质(例如最小值2mg/ml总蛋白)，用于任何食品样品分析。

　　在其它实施方案中，可以测试用于食品取样机构的各种选择，诸如阿基米德式螺旋抽水机、真空泵及多种食品基质中有效的其它机构。在各种食品构成上测试这些机构并且针对快速且简单的一步程序而优化。在一个实施方案中，如图及以下描述，阿基米德式螺旋抽水机构保持最大潜力。在样品收集期间，位于针内部的研磨机钻头将由发动机旋转，从而使其充当螺旋泵。研磨机钻头的“切屑清除”作用用来捕获靶样品的碎片并且将它们从收集针输送到混合腔室的中间。将成功定义为从25 20不同的食品基质成功地获得0.5g样品。食品基质的一些实例列于表7中。

　　由分子发射的光将传递穿过特定滤光器。传递穿过滤光器的光将被捕获并且转化成数字信号，所述数字信号将激活用户界面。控制腔室将含有应该产生负信号的试剂，并且此负信号将为背景。

　　在一些实施方案中，显示窗口32a和32b的每一个可以包括屏幕，所述屏幕将显示测试样品是否含有过敏原。在一些实施方案中，检测装置有效地直接或者无线连接至一个或多个数据库可能是有利的。基于用户偏好，可以与他人共享收集的数据。在一些情况下，可以与其它用户或者与医疗保健领域中的那些用户共享数据。

　　装置10被设计成要求最小维护量。预期的是LED 26a和26b以及滤光器28将需要定期(例如年度)更换。

　　如以上提及的，现在参照图2A和图2B描述本发明的检测装置中使用的筒夹1400的另一实施方案。为了简化起见，筒夹的此实施方案未示出如图1所示的一对检测腔室。然而，技术人士将能够修改图2A和图2B的筒夹实施方案以包括如图1所示的一对检测腔室，而不需要过度实验。同样地，图2A和图2B的筒夹1400可以经调适以包括图1中示出的其它筒夹特征，并且技术人士将认识到这类改变和调适在本发明的范围内。例如，可以设计装置的其它实施方案，其中一个或多个检测腔室位于筒夹外或在不同筒夹上。描述筒夹1400的功能的同时也引入了它的组成部分。

　　现在来看图2A和图2B，示出用于本发明的检测装置的某些实施方案的筒夹1400。筒夹1400的主要主体由载板1402提供，所述载板1402可以由塑料模制而成，选择塑料以与装置使用的缓冲剂及其它试剂相容。由下文将描述的载板1402支撑的组件由已知的附接或者连接器件附接到载板1402，如整体模制碰压式按钮(integrally-molded press-fitbutton)布置等。用于处理器和执行器之间通讯的电学组件之间的连接可以例如由常规方法进行。有利地，载板1402含有多个连接器1404，所述连接器1404被配置以与检测装置的主要支撑体上的对应部分(未示出)连接。这类连接器1404可以在生产载板1402的过程期间由诸如注入模制的过程形成。

　　还附接至载板1402的是柱塞式注射器1406。当从注射器1406的筒收回时，柱塞1408延伸超过载板1402的边缘。注射器1406的目的是提供用于注入消解缓冲剂D到混合腔室1410的器件，所述混合腔室1410在本实施方案中，在图2A和图2B中示出的方向上，基本上位于载板1402的上半部的中心。在某些实施方案中，注射器1406通过下压柱塞1408到注射器筒来物理启动。在其它实施方案中，注射器1406在处理器(未示出)控制下自动启动。在筒夹的某些替代实施方案中，用于控制阀和注射器的处理器-执行器系统的设计在技术人士的能力范围内。

　　阿基米德式混合器(又名螺旋泵)提供在混合腔室1410内。混合器包括具有螺杆1414的主轴1412，所述螺杆1414呈用于输送混合腔室1410的内容物的螺旋状混合运动的螺旋输送器的形式。主轴1412由发动机(未示出)转动，所述发动机经由发动机连接器1416连接。

　　在某些实施方案中，筒夹1400是一次性的，并且为混合腔室提供动力的发动机(未示出)是模块单元，所述模块单元在处理筒夹1400前从发动机连接器1416除去并且可附接至新筒夹以保存发动机。在某些实施方案中，检测装置可以提供有发动机支架、夹具或者保持器以保持发动机在检测装置的主体上，同时除去使用过的筒夹并且更换新筒夹。

　　连接至主轴1412末端的是空心研磨机钻头1418，所述空心研磨机钻头终止于针1420。针1420具有足够穿透样品S的规格。有利地，紧固针的卡盘1419是可调的，并且可以因此容纳各种规格的针以便从各种材料获得样品。同样地，卡盘1419还可以容纳各种不同大小的研磨机钻头。空心研磨机钻头1418的作用将样品S的部分从针1420穿过研磨机钻头1418的内部并且输送到混合腔室1410的内部。在样品S的部分已经被递送至混合腔室1410之后。

　　通过下压注射器1406的柱塞1408(如箭头所示)将消解缓冲剂D输送至混合腔室1410。第一单向阀1422提供于消解缓冲剂导管中，所述消解缓冲剂导管从注射器1406延伸至混合腔室1410的右手侧通口。此第一单向阀1422防止消解缓冲剂和混合腔室1410的其它内容物回流到注射器中。消解缓冲剂D分解样品以释放靶生物分子，已经为靶生物分子设计筒夹1400的检测测定。在可以由处理器(未示出)程序设计的混合阶段之后，混合腔室1410的左手侧通口由处理器程序设计打开以允许消解的样品通过第二导管被输送到检测腔室1426(在某些实施方案中，处理器是可以在处理筒夹1400前以类似于上述使用模块化发动机的实施方案的方式除去的模块单元)。在其它实施方案中，处理器也是一次性的并且与筒夹1400一起废弃。在其它实施方案中，不包括处理器，并且导管内的流体的移动仅由通过下压和延长与第一单向阀1422和第二单向阀1424相连的柱塞1408提供的正压力和负压力诱导。例如，如图2A中箭头所示，消解缓冲剂D从注射器移动至混合腔室1410是通过下压柱塞1408到注射器1406的筒来实现，并且单向阀1422如上所述防止回流。

　　现在参照图2B，箭头表示当注射器1406的柱塞1408从注射器筒收回时流体的移动。看到流体通过单向阀1424从检测腔室1426抽回并且到达注射器1406的筒。值得注意的，单向阀1422防止流体从混合腔室1410流到注射器1406。

　　从混合腔室1410引至检测腔室1426的导管中还提供的是用于除去消解样品中存在的污染物中的至少一些的纯化过滤器1428。这类污染物可包括例如核酸或者其消解片段。这类污染物可对测定的适当功能具有不利影响。在替代实施方案中，可以提供多个这类纯化过滤器，选择所述纯化过滤器中的每个以除去可以存在于各种不同类型样品中的特定种类的污染物。

　　从检测腔室1426引出的导管提供有疏水过滤器1430，所述疏水过滤器1430允许气体从检测腔室逸出但防止来自检测腔室1426的流体流动。

　　筒夹1400(其导管与策略性放置的过滤器1428和1430以及单向阀1422和1424形成循环回路)的独特配置允许注射器柱塞1408通过若干循环抽出并且下压以确保足够样品材料被递送至检测腔室1426。此外，仅仅要求单个精密步进器/控制发动机以提供样品运输。替代设计将要求一个发动机递送消解缓冲剂，并且另一电动机将样品抽入检测腔室中。图2A和图2B中例示的设计的益处是显著的，因为额外的发动机将增加检测装置的大小、重量、成本和功率要求。

　　在本发明的一个实施方案的检测装置中的筒夹1400的操作中，从将样品收集针1420插入靶样品S中开始分析。在样品收集期间，存在于针1420内部的研磨机钻头1418通过发动机旋转从而引起它转动主轴1412和螺杆1414。研磨机钻头1418的“切屑清除”作用用来捕获靶样品S的碎片并且将它们从收集针输送到混合腔室1410的中部。

　　一旦收集到靶样品S的碎片并且递送至混合腔室1410，下压注射器柱塞1408。这强制消解缓冲剂D通过单向阀1422并且进入混合腔室1410中。应注意到的是，第二单向阀1424的方向是为了防止流体倒流到检测腔室；第二单向阀1424的功能将如下重申。一旦消解缓冲剂D递送至混合腔室1410，混合发动机根据预设的时间和速度方案旋转主轴1412以适当地使样品S均质化，从而释放所关心的组成生物分子。混合发动机附接至发动机连接器1416，并且它与旋转研磨机钻头1418的发动机相同。

　　在样品S被消解并且均质化之后，样品S通过纯化过滤器1428并且进入检测腔室1426。这可以通过抽出注射器柱塞1408来实现。然而，在此动作期间，单向阀1422用来阻止材料向后离开混合腔室，单向阀1424打开以提供跨纯化过滤器1428的负压力，从而将样品S抽入检测腔室1426中。如以上提及的，疏水过滤器1430允许干扰气体逸出同时防止样品S逸出。当样品S在检测腔室1426中时，分析单元可以执行样品S的探询并且向用户报告测量结果。

　　图2A和图2B中示出的筒夹1400的替代实施方案包括如上所述的图1中示出的装置的实施方案的一对检测腔室。

　　替代实施方案可以包括抽吸机构，注射器1406将利用所述抽吸机构抽出以在混合腔室1410内创造真空，从而通过针“抽吸”样品。

　　替代实施方案还可以包括抽泵机构，样品S利用所述抽泵机构经由来自注射器式装置的气体(空气)或流体被推入腔室中。

　　替代实施方案还可以包括用于倒钩的通过收集针自动部署的弹簧加载钩或抓刮器式机构，随后为收集针收回到载有靶样品碎片的混合腔室。这种方法与被称为“活检枪”的现有医疗装置的功能类似。

　　现在参照图3描述检测装置的其它实施方案。检测装置2000的此实施方案提供有用于由用户单手操作的手柄的便利人体工程学设计，并且被配置成沙漏或者杠铃形状，前面的突起部一般以2015示出。前面突起部2015具有用于连接筒夹2140的器件。当附接时，筒夹2140形成前向突起部2015的大多数可见部分。前向突起部2015可以延伸以使样品收集器2020指向要求进行分析的样品S。沙漏形状的窄的部分提供作为抓握手柄2017的作用。当由用户反手抓握时，拇指仍自由操纵位于与手柄2017紧密前向接近的装置2000上的控制面板2019。一般以2025示出的后向突起部为检测腔室提供支撑，所述检测腔室在装置2000的内部被遮挡。后向突起部2025的外部表面包括显示监控器2032，所述显示监控器2032提供分析结果。

　　装置2000的此实施方案特别适于涉及以连续方式分析许多样品的分析任务。例如，将希望此实施方案用于质量控制测试，其中分析许多给定产品。人体工程学设计使当长时间使用时用户的不适最小化。装置2000延伸至样品S，样品S的部分由样品收集器2020收集，并且在筒夹2140的混合腔室中被处理。靶分子由样品基质释放，并且传递至检测腔室，并且分析结果显示在显示监控器2032上。在某些实施方案中，可以调整显示监控器2032的定向以方便用右手的用户或用左手的用户观看，以使得简单的屈肘移动将足够将装置2000从样品收集位置移动至适合观看分析结果的位置。

　　过敏原

　　根据本发明，过敏原包括来自食品、环境或者诸如家养宠物皮屑的非人类蛋白质的那些。

　　食品过敏原包括但不限于以下中的蛋白质：诸如花生、豌豆、扁豆和菜豆的豆类，以及豆类相关植物的羽扇豆；树坚果，诸如杏仁、腰果、胡桃、巴西坚果、榛子/榛实、山核桃、阿月浑子、山毛榉坚果、灰胡桃、栗子、锥栗、椰子、银杏果、荔枝、澳洲坚果、爪哇橄榄果(nangai nut)和松果；蛋；鱼；贝壳类动物，诸如蟹、小龙虾、龙虾、虾和对虾；软体动物，诸如蛤蜊、牡蛎、贻贝和扇贝；奶；豆；小麦；谷蛋白；玉米；肉，诸如牛肉、猪肉、羊肉和鸡肉；明胶；亚硫酸盐；种子，诸如芝麻、向日葵和罂粟籽；和香料，诸如芫荽、大蒜和芥末；水果；蔬菜，诸如芹菜；和稻米。例如，来自植物的种子(诸如羽扇豆、向日葵或者罂粟)可用于诸如有籽面包的食品或者可以被研磨以制作细粉用于制造面包或糕点。

　　近期的述评描述了开发的分析策略，其使用适体用于控制病原体、过敏原、掺杂物、毒素及其它禁止的污染物，以确保食品安全性(Amaya-Gonzalez等人，Aptamer-BasedAnalysis:A Promising Alternative for Food Safety Control,Sensors,2013,13:16292-16311；Amaya-Gonzalez等人，Aptamer binding to coelic disease-triggeringhydrophobic proteins:Towards a sensitive gluten detectionsystem.Anal.Chem.2013年提交)。Amaya-Gonzalez等人的PCT公开PCT/ES2013/000133，2013年6月28日还描述谷蛋白的一种检测方法。

　　海鲜过敏原通常属于一组肌肉蛋白质，包括鳕鱼中的小白蛋白和甲壳动物中的原肌球蛋白；其它过敏原(诸如精氨酸激酶和肌球蛋白轻链)还可以在变应原性中起重要作用。原肌球蛋白是对甲壳动物和软体动物之间的分子和临床交叉反应负责的主要过敏原，并且被认为是在其它吸入的无脊椎动物(诸如室内尘埃螨和昆虫)中负责的过敏原。

　　检测分子：适体

　　本发明的检测分子包括但不限于任何能够缔合或结合至一种或多种过敏原的一种分子或多种分子。

　　在一些实施方案中，本发明的检测分子包括一种或多种适体。

　　如本文使用，“适体”是已经通过重复多轮的活体外选择或者等同地SELEX(配体通过指数富集的系统进化)工程化，以结合至各种分子靶，诸如小分子、蛋白质、核酸，并且甚至细胞、组织和有机体的核酸种类。核酸适体具有通过除经典的Watson-Crick碱基配对外的相互作用的对分子的特异性结合亲合力。核酸适体(像通过噬菌体展示产生的肽或者单克隆抗体(mAb))能够特异性结合至所选择的靶，并且通过结合防止它们的靶发挥作用的能力。在一些情况下，适体还可以是肽适体。如本文使用，“适体”特别地指核酸适体。

　　适体(经常称为“化学抗体”)具有与抗体的那些特点类似的特点。典型的核酸适体大小大概是10-15kDa(20-45个核苷酸)，以至少纳摩尔级的亲合力结合其靶，并且排斥紧密相关的靶。

　　适体可以是单价或多价的。适体可以是单体、二聚、三聚、四聚或者更高的多聚体。单个适体单体可以连接以形成多聚适体融合分子。作为非限制性实例，连接寡核苷酸(即接头)可以被设计以含有与随机适体的5′-臂区和3′-臂区二者互补的序列以形成二聚适体。对于三聚或四聚适体，小的三聚或四聚(即霍利迪结状("Holiday junction-like"))DNA纳米结构将被工程化以包括与随机适体的3′-臂区互补的序列，因而通过杂交创造多聚适体融合。此外，3至5或5至10富dT核苷酸可以被工程化成接头多核苷酸，作为适体结合基序之间的单链区，其给予多个适体的灵活性和自由度，以配合和合作协调与细胞配体或受体的相互作用。

　　或者，多聚适体还可以通过混合生物素化的适体与链霉亲和素来形成。

　　如本文使用，术语“多聚适体”或“多价适体”是指包括多个单体单元的适体，其中单体单元中的每一个可以是它本身的适体。多价适体具有多价结合的特点。多聚适体可以是同源多聚体或异源多聚体。术语“同源多聚体”是指包括多个同类结合单元的多聚适体，即各单元结合至相同靶分子的相同结合位点。术语“异源多聚体”是指包括多个不同类的结合单元的多聚适体，即各结合单元结合至相同靶分子的不同结合位点，或者各结合单元结合至不同靶分子上的结合位点。因此，异源多聚体可以指结合至一个靶分子的不同结合位点的多聚适体或者结合至不同靶分子的多聚适体。结合至不同靶分子的异源多聚体还可以被称为多特异性多聚体。

　　核酸适体包括一系列连接的核苷或者核苷酸。术语“核酸”在其最广义上包括任何包含核苷酸聚合物的化合物和/或物质。这些聚合物常被称为多核苷酸。本发明的示例性核酸分子或多核苷酸包括但不限于：D-或L-核酸、核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对应异构体)、具有2′-氨基官能化的2′-氨基-LNA和具有2′-氨基官能化的2′-氨基-α-LNA)或它们的杂交体。

　　熟练的技术人员将认识到术语“RNA分子”或“核糖核酸分子”不仅涵盖自然界中表达或者发现的RNA分子，而且涵盖包含如本文描述或者如本领域已知的一种或多种核糖核苷酸/核糖核苷类似物或衍生物的RNA的类似物和衍生物。严格来说，“核糖核苷”包括核苷碱基和核糖，并且“核糖核苷酸"是具有一个、两个或三个磷酸酯部分的核糖核苷。然而，如本文使用的术语“核糖核苷”和“核糖核苷酸”可以被认为是等同的。可以修饰RNA的核碱基结构、呋喃核糖基环或核糖磷酸酯主链。

　　核酸适体可以是核糖核酸、脱氧核糖核酸或者混合的核糖核酸与脱氧核糖核酸。适体可以是单链的核糖核酸、脱氧核糖核酸或者混合的核糖核酸与脱氧核糖核酸。

　　在一些实施方案中，适体包括至少一种化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰选自核酸的糖位置的化学取代、磷酸酯位置的化学取代和碱基位置的化学取代。在其它实施方案中，化学修饰选自：掺入修饰的核苷酸；3′加帽；缀合至高分子量、非免疫原化合物；缀合至亲脂化合物；和将硫代磷酸酯并入磷酸酯主链。在优选实施方案中，高分子量、非免疫原化合物是聚亚烷基二醇，并且更优选地是聚乙二醇(PEG)。PEG共价缀合至另一分子，通常是药品或治疗蛋白质，的过程被称为聚乙二醇化。聚乙二醇化惯例地通过孵育PEG的反应性衍生物和靶分子实现。PEG共价附接至药品或治疗蛋白质可以自宿主免疫系统掩蔽该试剂，从而提供降低的免疫原性和抗原性，并且增加试剂的流体动力学大小(溶液中的大小)，所述试剂通过降低肾清除率延长其循环时间。聚乙二醇化还可以为疏水药品和蛋白质提供水溶性。

　　在另一优选实施方案中，3'帽是反向脱氧胸苷帽。

　　在一些实施方案中，提供核酸适体，其中P(O)O基团由P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、P(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“缩甲乙醛”)或3′-胺(—NH—CH2—CH2—)，其中各R或R′独立地为H或者取代或未经取代的烷基。连接基团可以通过—O—、—N—或—S—连接附接至邻近核苷酸。并非核酸适体中的所有连接都需要是相同的。

　　作为非限制性实例，核酸适体可以包括D-核糖或L-核糖核酸残基，并且还可以包括至少一个修饰的核糖核苷，所述修饰核糖核苷包括但不限于2'-O-甲基修饰核苷，包括5'硫代磷酸酯基团的核苷，连接至胆甾烯基衍生物或者十二酸二癸酰胺基团、锁核苷、无碱基核苷、反向脱氧核苷或反向核糖核苷、2'-脱氧-2'-氟代-修饰核苷、2'-氨基-修饰核苷、2'-烷基-修饰核苷、吗啉代核苷、氨基磷酸酯或包含核苷的非天然碱基或者它们的任何组合的末端核苷。或者，核酸适体可以包含至少两个修饰核糖核苷，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20或更多的修饰核糖核苷，至多分子的整个长度。核酸分子中的此多个修饰脱氧或核糖核苷中的每一个的修饰不必都是相同的。

　　基于核酸的检测分子可以包括核碱基(本领域常仅称作“碱基”)修饰或者取代。如本文使用，“未修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其它合成和天然核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基及其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基及其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞苷、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代，特别是5-溴代、5-三氟甲基及其它5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-偶氮鸟嘌呤和8-偶氮腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤和7-去氮腺嘌呤(7-daazaadenine)和3-去氮鸟嘌呤和3-去氮腺嘌呤。其它核碱基包括：美国专利第3,687,808号中公开的那些、Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn P.ed.Wiley-VCH,2008中公开的那些；TheConcise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,858-859页,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley&Sons,1990中公开的那些，Englisch等人Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613中公开的那些和Sanghvi,Y S.,Chapter 15,dsRNAResearch and Applications,289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993中公开的那些。

　　适体的合适核苷酸长度在约15至约100核苷酸(nt)范围内，并且在各种其它优选实施方案中长度为15-30nt、20-25nt、30-100nt、30-60nt、25-70nt、25-60nt、40-60nt、25-40nt、30-40nt，22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40nt中的任何一个或者40-70nt。然而，序列可以被设计具有足够的灵活性以使得它可以适应本文描述的距离处的适体与两个靶的相互作用。

　　在一些实施方案中，核酸适体包括双链特点的一个或多个区。这种双链区可以由内部自身互补性或与第二或其它适体或寡核苷酸分子的互补性而产生。在一些实施方案中，双链区域长度可以是4-12、4-10、4-8碱基对。在一些实施方案中，双链区域可以是5、6、7、8、9、10、11或者12个碱基对。在一些实施方案中，双链区域可以形成茎区。此类具有双链特点的延伸茎区可以用来使核酸适体稳定化。如本文使用，术语“双链特点”是指在超过两个核酸分子的任何长度上，它们的序列形成大于长度的50百分比的碱基配对(标准或者非标准)。

　　适体还可以被修饰以提供对核酸酶及其它酶活性的保护。适体序列可以通过本领域已知的任何合适方法修饰。例如，硫代磷酸酯可以并入主链中，并且5′-修饰嘧啶可以被包括在DNA适体的ssDNA的5′端。对于RNA适体，诸如例如用2′-脱氧-NTP或2′-氟代-NTP取代核糖主链的2′-OH基团的修饰核苷酸可以使用T7RNA聚合酶突变体并入RNA分子。这些修饰适体对核酸酶的耐受性可以通过用纯化的核酸酶或者来自小鼠血清的核酸酶培育它们来测试，并且适体的完整性可以通过凝胶电泳分析。

　　在一些实施方案中，此类修饰的核酸适体可以由修饰的核苷酸或者用修饰的核苷酸的子集整体合成。修饰可以是相同或者不同的。所有核苷酸可以被修饰并且都可含有相同的修饰。所有核苷酸可以被修饰，但含有不同的修饰，例如含有相同碱基的所有核苷酸可具有一个类型的修饰，而含有其它碱基的核苷酸可具有不同类型的修饰。例如，所有嘌呤核苷酸可具有一个类型的修饰(或者是未修饰的)，而所有嘧啶核苷酸具有另一不同类型的修饰(或者是未修饰的)。以这种方式，使用如本文公开的修饰的任何组合生成寡核苷酸或者寡核苷酸的库。

　　检测方法的一些非限制性实例包括使用对CCRF-CEM细胞(CCL-119T-细胞，人类急性淋巴母细胞性白血病)和Ramos细胞(CRL-1596，B细胞，人类Burkitt淋巴瘤)上的细胞表面分子有选择性的适体缀合金纳米颗粒(ACGNP)来直接检测癌细胞的测定(Medley等人，Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for the Direct Detection ofCancerous Cells.Anal.Chem.2008,80:1067-1072)；在结合靶分析物时经历快速分解成红色分散纳米颗粒的适体连接金纳米颗粒(AuNP)的使用(Lu等人Chapter14:Nanoparticles/Dip Stick,in Nucleic Acid and Peptide Aptamers:Methods and Protocols,GünterMayer(ed).535:223-239)；和使用如夹层式扩增元件的适体-AuNP缀合物超灵敏检测人类血清中的IgE(在1-10,000ng/mL的范围内，具有低至0.52ng/mL的LOD)的基于微分脉冲伏安法(DPV)的生物传感器(Wang等人，Aptamer-Au NPs conjugates-accumulated methyleneblue for the sensitive electrochemical immunoassay of protein,Talanta,2010年4月15,81(1–2):63–67)。

　　然而，许多电化学生物传感器共有的至少一个缺点是测量的脱机特性、需要用分析物溶液长时间培育而不是实时检测(Pilloli等人，Advances in biosensordevelopment based on integrating nanotechnology and applied to food-allergenmanagement.Trends in Analytical Chemistry，2013年6月，47:12-26)。

　　检测分子：抗体

　　在一些实施方案中，本发明的检测分子包括抗体。如本文使用，术语“抗体”以其最广义使用，并且特别地涵盖各种实施方案，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如由至少两个完整抗体形成的双特异性抗体)和诸如双特异性抗体的抗体片段，只要它们显示出所需的生物活性。抗体是主要基于氨基酸的分子，但还可以包含一种或多种修饰，诸如具有糖部分。

　　“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选地包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双特异性抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消解产生两个相同的称为“Fab”片段的抗原结合片段，各自具有单个抗原结合位点。还产生残余的“Fc”片段，“Fc”片段的名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的F(ab')2片段。检测分子可以包含一种或多种这些片段。为了本文目的，“抗体”可以包含重链可变域和轻链可变域以及Fc区。

　　“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。各轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数量在不同免疫球蛋白同型的重链之间改变。各重链和轻链还具有有规律间隔的链内二硫桥。各重链一端具有可变域(VH)，随后为许多恒定域。各轻链一端具有可变域(VL)并且其它另一端具有恒定域；轻链的恒定域对准重链的第一恒定域，并且轻链可变域对准重链的可变域。

　　如本文使用，术语“可变域”是指在抗体之间序列广泛不同并且用于各特定抗体的特定抗原的结合和特异性的特异抗体域。如本文使用，术语“Fv”是指含有完全的抗原识别和抗原结合位点的抗体片段。此区由以紧密的非共价缔合的一个重链可变域和一个轻链可变域组成。

　　来自任何脊椎动物物种的抗体“轻链”可以基于它们的恒定域的氨基酸序列被分配至称作κ和λ的两个明显不同类型中的一个。取决于它们的重链的恒定域的氨基酸序列，抗体可以被分配至不同种类。有五个主要种类的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且这些中的若干还可以被进一步分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。

　　如本文使用的“单链Fv”或“scFv”是指VH和VL抗体域的融合蛋白质，其中这些域连接在一起形成单个多肽链。在一些实施方案中，Fv多肽接头允许scFv形成抗原结合所需的结构。

　　术语“双特异性抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含连接至相同多肽链中的轻链可变域VL的重链可变域VH。通过使用太短因而不允许相同链上的两个域之间配对的接头，所述域强行与另一链的互补域配对，并且创造两个抗原结合位点。在例如EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中更完全地描述了双特异性抗体，其中每一个的内容全文以引用方式并入本文。

　　如本文使用的术语“单克隆抗体”是指得自一群基本同源细胞(或者克隆)的抗体，即包括个体抗体的群体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能在单克隆抗体的产生期间出现的可能的变异体，此类变异体一般以较小量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备相比，各单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。

　　修饰语“单克隆”表示抗体得自基本同源群体的抗体的特点，并且不被理解为要求通过任何具体方法产生抗体。本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的部分与来源于特定物种或属于特定抗体种类或子类的抗体的对应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体种类或子类的抗体以及这类抗体的片段中的对应序列相同或同源。

　　非人类(例如鼠的)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。对绝大部分来说，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体抗体的超可变区的残基由来自非人类物种抗体(供体抗体)的超可变区的残基替代，诸如具有所需特异性、亲合力和能力的小鼠、大鼠、兔子或非人类灵长类。

　　术语“超可变区”当在本文关于抗体使用时是指包括负责抗原结合的氨基酸残基的抗体的抗原结合域内的区。超可变区内存在的氨基酸决定互补性决定区域(CDR)结构。如本文使用，“CDR”是指包括与其靶抗原或表位互补的结构的抗体区。

　　在一些实施方案中，本发明的组成物可以是抗体模拟物。术语“抗体模拟物”是指模拟抗体的功能或作用并且特异性地且以高亲合力结合它们的分子靶的任何分子。因而，抗体模拟物包括纳米抗体等。

　　在一些实施方案中，抗体模拟物可以是本领域已知的那些，包括但不限于亲和体(affibody)分子、affilins、affitins、anticalins、avimers、DARPins、Fynomers和Kunitz和域肽。在其它实施方案中，抗体模拟物可以包括一个或多个非肽区。

　　如本文使用，术语“抗体变异体”是指在结构和/或功能上与抗体相似的生物分子，其与天然抗体相比，在它们的氨基酸序列、组成或结构上包含一些差异。

　　抗体(无论是单克隆或多克隆)的制备在本领域已知。用于产生抗体的技术在本领域中熟知，并且例如在Harlow和Lane"Antibodies,A Laboratory Manual"，Cold SpringHarbor Laboratory Press,1988和Harlow和Lane“Using Antibodies:A LaboratoryManual”Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999中描述。

　　在一个实施方案中，如上所述的包括抗体、抗体片段、它们的变异体或者衍生物的检测分子与过敏原特异性免疫反应。包括抗体或者抗体片段的检测分子还可以结合至过敏原上的靶位点。

　　本发明抗体的特征可以是它们的靶分子、用于生成它们的抗原、它们的功能(无论作为激动剂或拮抗剂)和/或它们在其中发挥功能的细胞生态位。

　　抗体功能的测量可以相对于正常生理条件下的标准在体外或者体内进行。测量还可以相对于抗体的存在或不存在进行。此类测量方法包括组织或者诸如血清或血液的液体中的标准测量，诸如Western印迹、酶联免疫吸附试验(ELISA)、活性试验、报道试验、荧光素酶试验、聚合酶链反应(PCR)阵列、基因阵列、实时逆转录酶(RT)PCR等。

　　检测分子抗体可以与过敏原蛋白质上或沿着的任意位置结合或相互作用。考虑的过敏原抗体靶位点包括用于检测所述过敏原的任何和所有可能位点。

　　本发明的检测分子化合物经由(可逆或不可逆)结合至一个或多个过敏原靶位点来发挥它们的作用。尽管不希望受理论限制，代表抗体的结合位点的靶位点最常由蛋白质或者蛋白质域或者蛋白质区形成。然而，靶位点还可以包括诸如糖、脂类、核酸分子或者结合表位的任何其它形式的生物分子。

　　本发明的检测分子抗体以及用于生成它们的抗原主要是基于氨基酸的分子。这些分子可以是“肽”、“多肽”或“蛋白质”。

　　如本文使用，术语“肽”是指具有2至50个或更多氨基酸的基于氨基酸的分子。特别的代号适用于更小的肽，“二肽”指两个氨基酸的分子，并且“三肽”指三个氨基酸的分子。具有多于50个连续氨基酸的基于氨基酸的分子被认为是多肽或蛋白质。

　　术语“氨基酸”和“多种氨基酸”是指所有天然存在的L-α-氨基酸以及非天然存在的氨基酸。氨基酸由如下的一个字母或三个字母的命名鉴定：天冬氨酸(Asp:D)、异亮氨酸(Ile:I)、苏氨酸(Thr:T)、亮氨酸(Leu:L)、丝氨酸(Ser:S)、酪氨酸(Tyr:Y)、谷氨酸(Glu:E)、苯丙氨酸(Phe:F)、脯氨酸(Pro:P)、组氨酸(His:H)、甘氨酸(Gly:G)、赖氨酸(Lys:K)、丙氨酸(Ala:A)、精氨酸(Arg:R)、半胱氨酸(Cys:C)、色氨酸(Trp:W)、缬氨酸(Val:V)、谷氨酰胺(Gln:Q)、甲硫氨酸(Met:M)和天冬酰胺(Asn:N)，其中氨基酸首先列出，随后附带地分别地为三个字母和一个字母的代码。

　　抗体：生产

　　本发明的抗体可以是通过本领域已知或者如本申请描述的方法产生的多克隆或者单克隆抗体或重组体。

　　在一些实施方案中，本发明的抗体可以为检测目的而用本领域技术人员已知的可检测标记来标记。标记可以是放射性同位素、荧光化合物、化学发光化合物、酶、或者酶辅因子或者本领域已知的任何其它标记。在一些方面，结合至所需抗原的抗体未被标记，但可以通过特异性结合至初级抗体的标记的次级抗体的结合来检测。

　　本发明的抗体包括但不限于：多克隆、单克隆、多特异性、人类、人源化或嵌合抗体，单链抗体，Fab片段，F(ab')片段，用Fab表达库产生的片段，抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明的抗体的抗Id抗体)，细胞内制造的抗体(即胞内抗体)和以上中的任何一个的表位结合片段。本发明的抗体可以来自包括鸟和哺乳动物的任何动物来源。优选地，这些抗体来源于人类、鼠(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔子、山羊、豚鼠、骆驼、马或者鸡。本发明的抗体可以是单特异性或多特异性的(例如双特异性、三特异性或者具有更大的多特异性)。多特异性抗体可以对本发明的肽的不同表位有特异性，或者可以对本发明的肽和异源表位(诸如异源肽或固体支撑材料)二者都有特异性。(参见例如WO 93/17715；WO92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt,A.等人Trispecific F(ab')3derivatives that usecooperative signaling via the TCR/CD3complex and CD2to activate and redirectresting cytotoxic T cells.J Immunol.1991年7月1日；147(1):60-9；美国专利No.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；和Kostelny,S.A.等人Formationof a bispecific antibody by the use of leucine zippers.J Immunol.1992Mar 1；148(5):1547-53)。例如，抗体可以针对含有本发明的肽序列的的重复单元的肽而产生，或者它们可以针对含有本发明的两种或两种以上肽序列的肽或者它们的组合而产生。

　　作为非限制性实例，已经设计了竞争地抑制过敏原结合至肥大细胞结合的IgE抗体从而抑制肥大细胞脱颗粒的异源二价配体(HBL)系统(Handlogten等人，Design of aHeterobivalent Ligand to Inhibit IgE Clustering on Mast Cells,Chemistry&Biology,2011年9月23,18(9):1179-1188)。

　　在一些实施方案中，抗体可以由过敏原的任何区制备。在本发明中，用于生成抗体的肽优选地含有以下的序列：长度至少4、至少5、至少6、至少7，更优选地至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15和优选地长度在约5至约50个氨基酸之间，更优选地长度在约10至约30个氨基酸之间，甚至更优选地在约10至约20个氨基酸之间。

　　在本发明的某些实施方案，其中较大的多肽或者蛋白质用于生成抗体，这些的长度优选地为至少50、至少55、至少60、至少70、至少80、至少90个或者更多的氨基酸。

　　本发明的单克隆抗体可以使用本领域技术人员已知的完善方法来制备。在一个实施方案中，使用杂交瘤技术制备单克隆抗体(Kohler,G.等人，Continuous cultures offused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature.1975年8月7：256(5517):495-7)。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物通常用免疫剂(例如本发明的肽)免疫以引发产生或者能够产生将特异性结合至免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以体外免疫。然后，淋巴细胞使用诸如聚乙二醇的合适融合剂与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding,J.W.,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice.Academic Press.1986；59-1031)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、兔子、牛和人类来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在优选地含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞的生长或者生存的物质的合适培养基中培养。例如，如果亲代细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)，以上所述物质防止HGPRT缺陷的细胞的生长。

　　优选的永生化细胞系是有效地融合、由选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平表达和对诸如HAT培养基的培养基敏感的那些。更优选的永生化细胞系是鼠骨髓瘤系，所述鼠骨髓瘤系可以例如从Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.和American Type Culture Collection,Manassas Va获得。人类骨髓瘤和小鼠人类异种骨髓瘤细胞系还被描述用于人类单克隆抗体的产生(Kozbor,D.等人，A human hybridmyeloma for production of human monoclonal antibodies.J Immunol.1984Dec；133(6):3001-5；Brodeur,B.等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications.Marcel Dekker,Inc.,New York.1987；33:51-63)。

　　培养基(杂交瘤细胞在其中培养)可以随后被测定单克隆抗体的存在。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性(即特异性免疫反应性)由免疫沉淀法或由体外结合测定测定，诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。这些技术和测定是本领域技术人员已知的。单克隆抗体的结合特异性可以例如由Scatchard分析测定(Munson，P.J.等人，Ligand:a versatile computerized approach forcharacterization of ligand-binding systems.Anal Biochem.1980年9月1；107(1):220-39)。

　　在鉴定所需杂交瘤细胞之后，克隆可以通过有限稀释程序被亚克隆并且通过标准方法生长。用于此目的的合适培养基包括例如Dulbecco氏改良Eagle氏培养基或RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可以在体内生长作为哺乳动物中的腹水。

　　由亚克隆分泌的单克隆抗体可以从培养基或腹水液体通过常规免疫球蛋白纯化程序分离或者纯化，诸如例如蛋白质A-Sepharose、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或者亲和色谱法。

　　在另一实施方案中，本发明的单克隆抗体还可以通过重组DNA方法制造，诸如美国专利第4,816,567号(据此全文以引用方式并入)中描述的那些。编码本发明的单克隆抗体的DNA可以使用常规程序容易地分离并且测序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。本发明的杂交瘤细胞充当DNA的优选来源。一旦分离，DNA可以被放到表达载体中，所述表达载体然后转染到宿主细胞，诸如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者不另外产生免疫球蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞，以获得重组宿主细胞中的单克隆抗体的合成。DNA还可以例如通过用人类重链和轻链恒定域的编码序列取代同源鼠序列(美国专利第4,816,567号)或者通过共价连接编码非免疫球蛋白多肽的序列的全部或部分和免疫球蛋白编码序列而修饰。这种非免疫球蛋白多肽可以用本发明的抗体的恒定域取代或者可以用本发明的抗体的一个抗原结合位点的可变域取代以创造嵌合二价抗体。

　　在另一实施方案中，本发明的抗体还可以通过本领域技术人员已知的各种程序来产生。对于体内多克隆抗体的产生，诸如兔子、大鼠、小鼠、绵羊或者山羊的宿主动物用游离或载体耦合肽，例如通过腹膜内和/或皮内注射来免疫。注射材料通常是含有约100μg肽或载体蛋白的乳液。各种佐剂还可以取决于宿主物种用于增加免疫学反应。佐剂包括但不限于：弗氏佐剂(Freund)(完全和不完全的)，诸如氢氧化铝的矿物胶，诸如溶血卵磷脂、复合(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂的表面活性物质；匙孔血蓝蛋白、二硝基酚及其它有用的人类佐剂，诸如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌菌苗。这些佐剂在本领域众所周知。可能需要例如约两周间隔的若干加强注射以提供抗体的有用滴度，所述滴度可以例如通过使用吸附至固体表面的游离肽的ELISA测定检测到。来自免疫的动物的血清中的抗体滴度可以通过选择抗体来增加，例如通过吸附肽到固体支撑体和根据本领域众所周知方法洗脱选择的抗体。

　　可以使用发现的高通量方法选择和产生包括抗体、变体和其片段的检测分子。在一个实施方案中，通过使用展示库产生包括合成抗体、变体和其片段的检测分子。如本文使用的术语“展示”是指表达或者“展示”蛋白质或者肽到给定宿主的表面。如本文使用的术语“库”是指独特cDNA序列的集合。库可以含有少至两个独特cDNA至成千上万亿独特cDNA。在优选实施方案中，使用抗体展示库或者抗体片段展示库产生包括合成抗体的检测分子。如本文使用的术语“抗体片段展示库”是指展示库，其中各成员编码含有抗体的至少一个可变区的抗体片段。这些抗体片段优选地是Fab片段，但也考虑诸如单链可变片段(scFv)的其它抗体片段。在Fab抗体片段库中，编码的各Fab可以是相同的，除了Fab片段的互补性决定区(CDR)的可变环内含有的氨基酸序列外。在替代或额外实施方案中，个体VH和/或VL区内的氨基酸序列也可以不同。

　　展示库可以在许多可能的宿主中表达，包括但不限于酵母菌、噬菌体、细菌和逆转录病毒。可以使用的其它展示技术包括核糖体展示、微珠展示和蛋白质-DNA连接技术。在优选实施方案中，Fab展示库在酵母菌或者噬菌体(本文还称作“噬菌体”或“噬菌体颗粒”)中表达。当表达时，Fab装饰噬菌体或酵母菌的表面，其中它们可以与给定抗原相互作用。包含过敏原的抗原或来自所需靶位点的抗原可用于选择表达具有对该抗原的最高亲合力的抗体片段的噬菌体颗粒或酵母细胞。编码结合的抗体片段的CDR的DNA序列可以随后通过使用结合的颗粒或者细胞测序来测定。在一个实施方案中，阳性选择用于抗体的研制。如本文使用，术语“阳性选择”是指过程，通过所述过程，基于对含有靶位点的抗原的亲合力从展示库选择抗体和/或其片段。在一些实施方案中，在抗体的研制中使用阴性选择。如本文使用，术语“阴性选择”是指过程，通过所述过程，缺乏用于抗体产生的靶位点的抗原用于在抗体研制期间从给定展示库排除抗体和/或其片段。在一些实施方案中，阳性选择过程和阴性选择过程二者在使用展示库的抗体的研制中的多轮选择期间使用。

　　在酵母菌展示中，编码不同抗体片段的cDNA被引入酵母细胞中，其中它们被表达并且抗体片段“展示”在细胞表面，如Chao等人描述(Chao,G.等人，Isolating andengineering human antibodies using yeast surface display.Nat Protoc.2006；1(2):755-68)。在酵母菌表面展示中，表达的抗体片段含有额外的包含酵母菌凝集素蛋白质Aga2p的域。此域允许抗体片段融合蛋白通过具有表面表达的Aga1p的二硫键形成附接至酵母细胞的外部表面。结果是包被在特定的抗体片段中的酵母细胞。最初使用编码这些抗体片段的cDNA的展示库，其中抗体片段各自具有独特序列。这些融合蛋白质在数百万酵母细胞的细胞表面上表达，其中它们可以与与细胞孵育的所需抗原靶肽相互作用。靶肽可以用化学或磁性基团共价地或其它地修饰，以允许在与合适的抗体片段的成功结合之后有效的细胞分类发生。回收可以利用磁性激活细胞分类(MACS)、荧光激活细胞分类术(FACS)或本领域已知的其它细胞分类方法的方式。一旦选择酵母细胞的亚群，可以分析对应质粒以测定CDR序列。

　　噬菌体展示方法通常使用丝状噬菌体，包括fd、F1和M13病毒体。这些株是非渐退的(non-lytic)，允许宿主的继续繁殖和增加的病毒滴度。可用于制造本发明的抗体的噬菌体展示方法的实例包括以下中公开的那些：Miersch等人(Miersch,S.等人，Syntheticantibodies:Concepts,potential and practical considerations.Methods.2012年8月；57(4):486-98)、Bradbury等人(Bradbury,A.R.等人，Beyond natural antibodies：thepower of in vitro display technologies.Nat Biotechnol.2011年3月；29(3):245-54)、Brinkman等人(Brinkmann,U.等人,Phage display of disulfide-stabilized Fvfragments.J Immunol Methods.1995年5月11；182(1):41-50)；Ames等人(Ames,R.S.等人，Conversion of murine Fabs isolated from a combinatorial phage display libraryto full length immunoglobulins.J Immunol Methods.1995年8月18；184(2):177-86)；Kettleborough等人(Kettleborough,C.A.等人,Isolation of tumor cell-specificsingle-chain Fv from immunized mice using phage-antibody libraries and there-construction of whole antibodies from these antibody fragments.Eur JImmunol.1994年4月；24(4):952-8)；Persic等人(Persic,L.等人,An integrated vectorsystem for the eukaryotic expression of antibodies or their fragments afterselection from phage display libraries.Gene.1997年3月10；187(1):9-18)；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利第5,698,426号；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108，以上专利中的每个全文以引用方式并入本文。

　　噬菌体上的抗体片段表达可以通过将编码片段的cDNA插入到表达病毒外壳蛋白的基因来进行。丝状噬菌体的病毒外壳由五个由单链基因组编码的外壳蛋白组成。外壳蛋白pIII是用于抗体片段表达的优选蛋白质，通常在N-末端。如果抗体片段表达折衷pIII的功能，病毒功能可以通过野生型pIII的共表达恢复，虽然这种表达将减少病毒外壳上表达的抗体片段的数量，但可以由靶抗原提高抗体片段的可及性。病毒以及抗体片段蛋白质的表达可以替代地在多个质粒上编码。这种方法可用于减小感染性质粒的总大小并且提高转化效率。

　　如上所述，在选择表达高亲合力抗体或抗体片段的宿主之后，来自抗体或抗体片段的编码区可以被分离并且用于生成整个抗体，包括人类抗体或者任何其它所需抗原结合片段，并且在任何所需宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌和例如以下详细描述的细菌。

　　编码高亲合力抗体的DNA序列可以在被称为亲合力成熟的过程中的额外轮的选择下突变。如本文使用的术语“亲和力成熟”是指一种方法，藉此方法通过连续轮的突变和抗体或抗体片段编码cDNA序列的选择来产生具有增加的对给定抗原的亲合力的抗体。在优选实施方案中，此过程在体外进行。为完成此过程，CDR编码序列的扩增可以使用易错PCR进行，以产生成百上千万含有突变的副本，突变包括但不限于点突变、区域性突变、插入突变和缺失突变。如本文使用，术语“点突变”是指其中核苷酸序列内的一个核苷酸变成不同的核苷酸的核酸突变。如本文使用，术语“区域性突变”是指其中两个或两个以上连续的核苷酸变成不同的核苷酸的核酸突变。如本文使用，术语“插入突变”是指其中一个或多个核苷酸被插入核苷酸序列中的核酸突变。如本文使用，术语“缺失突变”是指其中一个或多个核苷酸从核苷酸序列中除去的核酸突变。插入突变或缺失突变可以包括整个密码子的完全更换或通过修改初始密码子(starting codon)的一个或两个核苷酸来改变一个密码子。

　　诱变可以在CDR-编码cDNA序列上进行，以创造成百上千万在CDR重链区和轻链区具有异常(singular)突变的突变体。在另一方法中，随机突变仅仅在最可能改善亲合力的CDR残基处引入。这些新生成的诱变库可用于重复所述过程，以筛选编码具有甚至更高的对靶肽的亲合力的抗体片段的克隆。持续轮次的突变和选择促进具有越来越大亲合力的克隆的合成(Chao,G.等人,Isolating and engineering human antibodies using yeastsurface display.Nat.Protoc.2006；1(2):755-68)。

　　可用于产生抗体和抗体片段(诸如Fab和scFv)的技术的实例包括以下中描述的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；Miersch等人(Miersch,S.等人Syntheticantibodies:Concepts,potential and practical considerations.Methods.2012年8月；57(4):486-98)、Chao等人(Chao G.等人,Isolating and engineering human antibodiesusing yeast surface display.Nat Protoc.2006；1(2):755-68)、Huston等人(Huston,J.S.等人,Protein engineering of single-chain Fv analogs and fusionproteins.Methods Enzymol.1991；203:46-88)；Shu等人(Shu,L.等人,Secretion of asingle-gene-encoded immunoglobulin from myelomacells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1993年9月1；90(17):7995 9)；和Skerra等人(Skerra,A.等人,Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichiacoli.Science.1988年5月20；240(4855):1038-41)，以上中的每个全文以引用方式并入本文。

　　对于一些用途，包括抗体的人类体内用途和体外检测测定，可能优选的是使用嵌合、人源化或者人类抗体。嵌合抗体是其中抗体的不同部分衍生自不同的动物物种的分子，诸如具有来源于鼠单克隆免疫球蛋白可变区和人类免疫球蛋白恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法在本领域已知(Morrison,S.L.,Transfectomas provide novel chimericantibodies.Science.1985年9月20；229(4719):1202-7；Gillies,S.D.等人,High-levelexpression of chimeric antibodies using adapted cDNA variable regioncassettes.J Immunol Methods.1989年12月20；125(1-2):191-202.；和美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397，以上的全文以引用方式并入本文)。

　　人源化抗体是结合至所需抗原并且具有来自非人类物种一个或多个互补性决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区域的来自非人类物种的抗体分子。经常，人类框架区中的框架残基用来自供体抗体的CDR和框架区的对应残基取代以改变(优选地，改善)抗原结合。这些框架取代由本领域众所周知的方法鉴定，例如通过模拟CDR与框架残基的相互作用以鉴定对于抗原结合重要的框架残基，和通过序列比较以鉴定特定位置上的异常框架残基(美国专利号5,693,762和5,585,089；Riechmann,L.等人,Reshaping humanantibodies for therapy.Nature.1988年3月24；332(6162):323-7，以上的全文以引用方式并入本文)。

　　抗体可以使用本领域已知的各种技术人源化，包括例如CDR-植入(EP239,400；PCT公开WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)；镶饰(veneering)或重塑(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,E.A.,A possible procedure for reducing theimmunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties.Mol Immunol.1991年4月-5月；28(4-5):489-98；Studnicka,G.M.等人,Human-engineered monoclonal antibodies retain full specific bindingactivity by preserving non-CDR complementarity-modulating residues.ProteinEng.1994年6月；7(6):805-14；Roguska,M.A.等人,Humanization of murine monoclonalantibodies through variable domain resurfacing.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1994年2月1；91(3):969-73)；和链改组(美国专利号5,565,332)；以上中的每个全文以引用方式并入本文。

　　完全人类抗体对于治疗人类患者是特别需要的，以便避免或者缓解对外源蛋白的免疫反应。人类抗体可以通过本领域已知的各种方法使用来源于人类免疫球蛋白序列的抗体库制造，所述方法包括如上所述的抗体展示方法。还参见美国专利号4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO96/33735和WO 91/10741；以上专利中的每个全文以引用方式并入本文。

　　人类抗体还可以使用转基因小鼠来产生，所述转基因小鼠不能表达功能性内源性免疫球蛋白，但可以表达人类免疫球蛋白多核苷酸。例如，人类重链和轻链免疫球蛋白多核苷酸复合物可以随机或通过同源重组引入到小鼠胚胎干细胞中。或者，除人类重链和轻链多核苷酸外，人类可变区、恒定区和多样性区也可以被引入小鼠胚胎干细胞中。可以通过同源重组分别地或同时地引入人类免疫球蛋白基因座使小鼠重链和轻链免疫球蛋白多核苷酸不起作用。特别地，JH区的纯合缺失防止内源性抗体产生。扩增修饰的胚胎干细胞并且微注入到胚泡以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达人类抗体的纯合后代。以正常方式用选择的抗原免疫转基因小鼠，选择的抗原例如本发明的多肽的全部或部分。

　　因此，通过使用这种技术，有可能产生有用的人类IgG、IgA、IgM、IgD和IgE抗体。关于用于产生人类抗体的技术的概述，参见Lonberg和Huszar(Lonberg,N.等人，Humanantibodies from transgenic mice.Int.Rev.Immunol.1995；13(1):65-93)。关于用于产生人类抗体和人类单克隆抗体的技术以及用于产生这类抗体的方案的详细讨论，参见例如PCT公开WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；5,939,598；6,075,181；和6,114,598，以上专利中的每个全文以引用方式并入本文。此外，诸如Abgenix,Inc.(Fremont,Calif.)、Protein Design Labs,Inc.(Mountain View,Calif.)和Genpharm(San Jose,Calif.)的公司可以使用类似于以上描述技术的技术来提供针对选择的抗原的人类抗体。

　　一旦本发明的抗体分子已经由动物、细胞系产生，化学合成或重组表达，所述抗体分子可以通过用于纯化免疫球蛋白或多肽分子的本领域已知任何方法来纯化(即分离)，例如通过色谱法(例如离子交换、亲合力，特别是通过针对特定抗原的亲合力、蛋白A和分级柱层析)、离心、差别溶解度或通过用于蛋白质纯化的任何其它标准技术。此外，本发明的抗体或其片段可以融合至本文描述或本领域已知的异源多肽序列，以促进纯化。

　　检测分子的变体

　　基于氨基酸的检测分子可以以整个多肽、多个多肽或者多肽的片段存在，所述检测分子可以由前面提及的任何一个的一个或多个核酸、多个核酸、核酸的片段或变体编码。如本文使用，“多肽”是指最常由肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然的)的聚合物。如本文使用的术语是指蛋白质、多肽和任何大小、结构或功能的肽。在一些情况下，编码的多肽小于约50个氨基酸，并且多肽相应被称为肽。如果多肽是肽，则它长至少约2、3、4或至少5个氨基酸残基。因此，多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同系物、直系同源物、旁系同源物、片段及上述的其它等同物、变体和类似物。多肽可以是单个分子或者可以是多分子复合物，诸如二聚物、三聚物或四聚物。它们还可以包括单链或多链多肽，并且可以联合或连接。术语多肽还可以应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在氨基酸的人工化学类似物。

　　根据本发明的某些实施方案，提供检测分子的变体。

　　术语“多肽变体”是指它们的氨基酸序列与天然或者参考序列不同的分子。氨基酸序列变体与天然或参考序列相比，可以在氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或插入。通常，变体将对天然或参考序列具有至少约50％的同一性(同源性)，并且优选地，所述变体将与天然或参考序列至少约80％，更优选地至少约90％同一(同源)。

　　术语“多核苷酸变体”是指它们的核序列与天然或参考序列不同的分子。核酸序列变体与天然或参考序列相比，可以在氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或插入。通常，变体将对天然或参考序列具有至少约50％的同一性(同源性)，并且优选地，所述变体将与天然或参考序列至少约80％，更优选地至少约90％同一(同源)。

　　在一些实施方案中，提供“变体模拟物”。如本文使用，术语“变体模拟物”是含有一个或多个将模拟激活的序列的氨基酸(或核酸)的一个。例如，谷氨酸酯可以充当磷酰苏氨酸和/或磷酰丝氨酸的模拟物。或者，变体模拟物可以导致灭活或者含有模拟物的灭活产品，例如，苯丙氨酸可以充当酪氨酸的灭活取代物；或者丙氨酸可以充当丝氨酸的灭活取代物。本发明的检测分子的氨基酸序列(或核酸序列)可以包括天然存在的氨基酸(或核酸)。或者，检测分子可以包括天然和非天然存在的氨基酸或非天然存在的核酸。

　　术语“氨基酸序列变体”是指与天然或者起始序列相比，它们的氨基酸序列具有一些差异的分子。术语“核酸序列变体”是指与天然或者起始序列相比，它们的核酸序列具有一些差异的分子。序列变体可以在氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或插入。“天然”或“起始”序列不应与野生型序列混淆。如本文使用，天然或者起始序列是参照原始分子的相对术语，针对所述原始分子可以进行比较。“天然”或“起始”序列或分子可以表示野生型(天然发现的序列)，但不必是野生型序列。

　　通常，变体将具有对天然序列的至少约70％的同源性，并且优选地，所述变体将与天然序列至少约80％，更优选地至少约90％同源。

　　“同源性”当应用于氨基酸或者核酸序列时，定义为在比对序列并且引入缺口(如有必要)以获得最大百分比同源性之后，与第二序列的序列中的残基相同的候选序列中的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域众所周知。应理解的是，同源性取决于百分比同一性的计算，但值可能由于计算中引入的缺口和罚分而不同。

　　当应用于氨基酸或核酸序列时，“同系物”是指具有与第二物种的第二序列的基本同一性的其它物种的对应序列。

　　术语“类似物”意在包括分别相差一个或多个氨基酸或核酸变化的多肽或多核苷酸变体，例如取代、添加或缺失多个残基而仍维持亲代多肽或者多核苷酸的性质的。

　　术语“衍生物”与术语“变体”同义地使用，并且指已经以任何方式相对于参考分子或起始分子修饰或者改变的分子。

　　本发明考虑检测分子的若干类型，所述检测分子是基于氨基酸或核酸的，包括变体和衍生物。这些包括取代、插入、缺失和共价变体及衍生物。因而，包括在本发明范围内的是含有取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的检测分子。

　　例如对于蛋白质，序列标签或氨基酸(诸如一个或多个赖氨酸)可以被添加至本发明的肽序列(例如，在N-末端或C-末端)。序列标签可用于肽纯化或者定位。赖氨酸可用于增加肽溶解度或者允许生物素化。或者，定位在肽或者蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区的氨基酸残基可以任选地缺失，以提供截短序列。某些氨基酸(例如C-末端或者N-末端残基)可以取决于序列的用途而替代地缺失，作为实例，表达序列作为可溶解的或连接至固体支撑的较大序列的部分。

　　“取代变体”是在天然或者起始序列中的至少一个氨基酸残基或者至少一个核苷(或者核苷酸)被移去并且在相同位置插入不同的氨基酸或核苷(或核苷酸)以代替的那些。取代可以是单个，其中分子中仅一个氨基酸或者核苷(或核苷酸)被取代，或者取代可以是多个，其中同一分子中两个或更多个氨基酸或者核苷(或核苷酸)被取代。

　　如本文使用，多肽背景下的术语“保守氨基酸取代”是指正常存在于序列中的具有类似大小、电荷或极性的不同氨基酸的氨基酸的取代。

　　肽或蛋白质中的保守取代的实例包括将诸如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸的非极性(疏水)残基取代为另一非极性残基。同样地，保守取代的实例包括将一个极性(亲水)残基取代为另一残基，诸如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间和甘氨酸与丝氨酸之间。另外，诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸的碱性残基取代为另一残基，或者诸如天冬氨酸或谷氨酸的一个酸性残基取代为另一酸性残基，是保守取代的额外实例。非保守取代的实例包括将诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸的非极性(疏水)氨基酸残基取代为诸如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸的极性(亲水)残基，和/或将极性残基取代为非极性残基。

　　“插入变体”是具有在天然或者起始序列中特定位置直接邻近于氨基酸或者核苷(或核苷酸)插入的一个或多个氨基酸或者核苷(或核苷酸)的那些变体。“直接邻近”氨基酸或者核苷酸意为连接至氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团；并且意为直接连接至多核苷酸的所述核苷或者核苷酸的5’或3’。

　　“缺失变体”是天然或者起始序列中具有除去的一个或多个氨基酸或者核苷(或核苷酸)的那些。通常，缺失变体将在分子的特定区缺失一个或多个氨基酸或者核苷(或核苷酸)。

　　如本文所指的术语“衍生物”包括具有有机蛋白质或者非蛋白质衍生试剂的天然或起始蛋白质或者多核苷酸的修饰。蛋白质衍生物还可以包括翻译后修饰。共价修饰传统上通过使分子的靶氨基酸或者核苷(或核苷酸)残基与能够与选择的原子或残基反应的有机衍生试剂反应来引入，或者在蛋白质的情况下，通过利用在选择的重组寄主细胞中发挥作用的翻译后修饰的机制引入。这类修饰在本领域技术人员的能力范围内，并且在不需要过度实验的条件下执行。

　　共价衍生物特别地包括融合分子，其中蛋白质共价键合至非蛋白质聚合物。非蛋白质聚合物通常是亲水的合成聚合物，即并非天然发现的聚合物。然而，天然存在和通过重组或体外方法产生的聚合物是有用的，从天然分离的聚合物也是有用的。亲水聚乙烯聚合物落入本发明的范围，例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。特别有用的是聚乙烯亚烷基醚，诸如聚乙二醇、聚丙二醇。蛋白质可以按下面专利中阐述的方式连接至各种非蛋白质聚合物，诸如聚乙二醇、聚丙二醇或者聚氧化烯：美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337，所述专利中的每个全文以引用方式并入本文。

　　“特征”定义为分子的基于不同氨基酸或者核苷(或核苷酸)序列的组分。本发明的某些实施方案的检测分子的特征包括表面表现、局部构象形状、折叠、环、半环、域、半域、位点、末端或者它们的任何组合。

　　如本文使用，术语“表面表现”是指最外层表面出现的蛋白质或者多核苷酸的组分。

　　如本文使用，术语“局部构象形状”意为定位在蛋白质或者多核苷酸的可定义空间内的结构性表现。

　　如本文使用，术语“折叠”意为氨基酸或者核苷(或核苷酸)序列在能量最低化时所得的构象。折叠可以在折叠过程的次级或者三级水平发生。蛋白质中的次级水平折叠的实例包括β折叠和α螺旋。蛋白质中的三级折叠的实例包括由于能量力的聚集或者分离形成的域和区。以此方式形成的区包括疏水和亲水袋等。

　　如本文关于多肽和多核苷酸使用，术语“折”意为改变多肽或者多核苷酸的主链方向的弯曲，并且可以包括一个、两个、三个或者更多的氨基酸或者核苷(或核苷酸)残基。

　　如本文使用，术语“环”是指反转多肽或者多核苷酸序列的主链方向并且包括四个或者更多的氨基酸或者核苷(或核苷酸)残基的结构特征。Oliva等人已经鉴定至少5类蛋白质环(J.Mol.Biol.266(4):814-830；1997)。

　　如本文参照蛋白质时使用，术语“半环”是指具有其衍生自的环的至少半数氨基酸残基的已鉴定环的部分。应理解的是环可以不总是含有偶数的氨基酸残基。因此，在那些其中环含有或者鉴定为包括奇数氨基酸的情况下，奇数环的半环将包括环(环的氨基酸数量/2+/-0.5氨基酸)的整数部分或者下一个整数部分。例如，鉴定为7氨基酸环的环可以产生3氨基酸或者4氨基酸的半环(7/2＝3.5+/-0.5，为3或4)。

　　如本文使用的术语“域”是指具有一个或多个可识别的结构性或功能特点或者性质(例如结合容量)的多肽或者多核苷酸的基序，充当分子相互作用位点。

　　如本文使用，术语“位点”当它涉及基于氨基酸或者核苷(或核苷酸)的实施方案时，与“氨基酸残基”和“核酸残基”同义使用。位点表示可以在本发明的基于多肽或者多核苷酸的分子内被修饰、操纵、改变、衍生或者变化的多肽或者多核苷酸内的位置。

　　如本文使用，术语“多个末端”或“末端”是指多肽或者多核苷酸的极端。这种极端不仅受多肽或者多核苷酸的第一或者最终位点限制，还可以在末端区中包括额外的氨基酸或者核苷(或者核苷酸)。本发明的基于多肽的分子特点可以为兼具N-末端(由具有游离氨基(-NH2)的氨基酸封端)和C-末端(由具有游离羧基(-COOH)的氨基酸封端)。本发明的蛋白质在一些情况下由通过二硫键或者通过非共价力(多聚体、寡聚物)聚集的多个多肽链组成。这些类的蛋白质将具有多个N-和C-末端。替代地，可以修饰多肽的末端，以使得它们用诸如有机缀合的基于非多肽的部分视情况开始或者结束。本发明的基于多核苷酸的分子特点可以为兼具5’末端和3’末端。

　　一旦特征中的任何一个已经鉴定或者定义为本发明分子的组成，这些特征的若干操纵和/或修饰中的任何一个可以通过移动、交换、反转、缺失、随机化或者复制来执行。此外，应理解的是特征的操纵可以导致与本发明的分子的修饰相同的结果。例如，包括缺失域的操纵将导致分子长度的改变，正如编码小于全长的分子的核酸的修饰。

　　修饰和操纵可以由本领域已知的方法完成，诸如定点诱变。所得的修饰分子然后可以使用体外或者体内测定测试，诸如本文描述的那些或者本领域已知的任何其它合适的筛选试验。

　　同位素变化

　　本发明的检测分子可以含有一个或多个同位素原子。如本文使用，术语“同位素”是指具有一个或多个额外中子的化学元素。在一个实施方案中，本发明的化合物可以氘化。如本文使用，术语“氘化”是指一个或多个氢原子由氘同位素替代的物质。氘同位素是氢的同位素。氢的原子核含有一个质子而氘原子核含有质子和中子。检测分子可以氘化以便改变化合物的物理性质(诸如稳定性)或者允许化合物用于诊断和实验应用。

　　缀合和组合

　　本发明考虑到，本发明的某些实施方案的检测分子、抗原和/或抗体可以与一个或多个同源或者异源的分子络合、缀合或者组合。如本文使用，“同源分子”意为相对于起始分子结构或功能中的至少一个类似的分子，而“异源分子”是相对于起始分子结构或功能中的至少一个不同的分子。因此，结构性同系物是在结构上基本类似的分子。它们可以是相同的。功能性同系物是在功能上基本类似的分子。它们可以是相同的。

　　本发明的检测分子可以包括缀合物。本发明的这类缀合物可以包括天然存在物质或者配体，诸如蛋白质(例如人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或者球蛋白)；碳水化合物(例如葡聚糖、支链淀粉、甲壳质、壳聚糖、菊粉、环糊精或者透明质酸)；或者脂类。配体还可以是重组或者合成分子，诸如合成聚合物，例如合成聚氨基酸、寡核苷酸(例如适体)。包括聚氨基酸的聚氨基酸的实例是聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酸酐共聚物、聚(L-交酯-共-乙交脂)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或者聚膦嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、伪肽-聚胺、拟肽聚胺、树状物聚胺、精氨酸、脒、精蛋白、阳离子脂、阳离子卟啉、聚胺季盐或者α螺旋肽。

　　本发明的某些实施方案的检测分子可以被设计与以下缀合：其它多核苷酸、染料、插入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、得克萨卟啉、Sapphyrin)、多环芳香烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工内切酶(例如EDTA)、烷化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、运输/吸收促进剂(例如阿斯匹林、维生素E、叶酸)、合成的核糖核酸酶、蛋白质(例如糖蛋白)或者肽(例如对共配体具有特异性亲合力的分子)或者抗体(例如结合至指定细胞类型的抗体，细胞类型诸如癌细胞、内皮细胞或者骨细胞)、激素和激素受体、非肽种类(诸如脂类、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子或者药品)。

　　缀合部分可以被添加至检测分子抗体，以使得它们允许标记或者标志过敏原。这类标签/标志分子包括但不限于泛素、荧光分子、生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、辣根过氧化酶(HRP)和地高辛。

　　在一些实施方案中，检测分子可以与其它检测分子组合。

　　在一些实施方案中，检测分子可以包括可检测试剂，诸如各种有机小分子、无机化合物、纳米颗粒、酶或者酶底物、荧光材料、发光材料(例如鲁米诺)、生物发光材料(例如荧光素酶、荧光素和水母蛋白)、化学发光材料、放射性物质(例如18F、67Ga、81mKr、82Rb、111In、123I、133Xe、201Tl、125I、35S、14C、3H、或者99mTc(例如，如高锝酸盐(VII)、TcO4))和造影剂(例如金(例如金纳米颗粒)、钆(例如螯合Gd)、氧化铁(例如超顺磁性氧化铁(SPIO)、单晶氧化铁纳米颗粒(MION)、和超小超顺磁性氧化铁(USPIO))、锰螯合物(例如Mn-DPDP)、硫酸钡、碘化造影剂(碘海醇)、微泡或者全氟化碳)。这类光学可检测的标记包括例如而不限于：4-乙酰氨基-4′-异硫代氰酰均二苯乙烯-2,2′-二磺酸；吖啶和衍生物(例如吖啶和异硫氰酸吖啶)；5-(2′-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸酯；N-(4-苯胺基-l-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；BODIPY；亮黄；香豆素和衍生物(例如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、和7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151))；花青染料；焰红；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5′5"-二溴邻苯三酚-磺基萘酚肽(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4′-异硫代氰酰苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸盐；4,4′-二异硫代氰酰二氢-均二苯乙烯-2,2′-二磺酸；4,4′-二异硫代氰酰均二苯乙烯-2,2′-二磺酸；5-[二甲氨基]-萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-二甲氨基苯基偶氮-4′-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红和衍生物(例如曙红和异硫氰酸曙红)；藻红和衍生物(例如藻红B和异硫氰酸藻红)；乙锭；荧光素和衍生物(例如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2′,7’-二甲氧基-4′,5′-二氯-6-羧基荧光素、荧光素、异硫氰酸荧光素、X-罗丹明-5-(和-6-异硫氰酸酯(QFITC或XRITC)、和荧光胺)；2-[2-[3-[[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(3-磺丙基)-2H-苯基[e]吲哚-2-叉]亚乙基]-2-[4-(乙氧羰基)-1-哌嗪基]-1-环戊烯-1-基]乙烯基]-1,1-二甲基-3-(3-磺丙基)-1H-苯基[e]吲哚鎓氢氧化物、内盐、具有N,N-二乙基乙胺(1:1)(IR144)的化合物；5-氯-2-[2-[3-[(5-氯-3-乙基-2(3H)-苯并噻唑-叉)亚乙基]-2-(二苯胺)-1-环戊烯-1-基]乙烯基]-3-乙基苯并噻唑高氯酸盐(IR140)；异硫氰酸孔雀绿；4-甲基伞形酮邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副蔷薇苯胺；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘和衍生物(例如芘、丁酸芘和琥珀酰亚胺1-芘)；丁酸盐量子点；活性红4(辛巴亮红3B-A)；罗丹明和衍生物(例如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、异硫氰酸罗丹明X、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101、磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(得克萨斯红)、N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)四甲基罗丹明和异硫氰酸四甲罗丹明(TRITC))；核黄素；玫红酸；铽螯合衍生物；花青-3(Cy3)；花青-5(Cy5)；花青5.5(Cy5.5)、花青-7(Cy7)；IRD 700；IRD 800；Alexa 647；拉霍亚蓝(La Jolla Blue)；酞花青；和萘酞花青。

　　在一些实施方案中，可检测试剂可以是在激活后变得可检测的非可检测前体(例如荧光四嗪-荧光团构造(例如四嗪-BODIPY FL、四嗪-俄勒冈绿488或者四嗪-BODIPY TMR-X)或者酶可激活荧光试剂(例如(VisEn Medical)))。在一些实施方案中，非可检测前体包含荧光团和淬灭剂的组合，例如诸如荧光素和DABCYL的组合。选择荧光团和淬灭剂对的指南描述在S.A.E.Marras Selection of Fluorophore and QuencherPairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes in Didenko,VladimirV.,ed.Fluorescent energy transfer nucleic acid probes:designs and protocols.卷335.Springer,2006中，其全文以引用方式并入本文。其中可使用酶标记的组合物的体外试验包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀测定、免疫荧光、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)和Western印记分析。

　　信号多核苷酸

　　根据某些实施方案，当以高亲合力和特异性结合至分子靶时，提供有可检测的多核苷酸序列。这类多核苷酸序列可以使用如上文描述的SELEX过程产生。

　　在某些类型的示例性信号多核苷酸中，序列的5’端结合至荧光分子，并且3’端载有结合至5’-端的5-20个核苷酸长的反向互补序列。这导致序列的折叠和茎-环结构的形成。淬灭剂分子结合至3’-端。技术人士将认识到交替布置是可能的，其中淬灭剂结合至5’-端，并且荧光团结合至3’-端。这种替代信号多核苷酸可以由技术人士在本说明书的背景下制备而不过度实验。

　　下文将描述设计有茎-环结构以用于结合至溶菌酶的作为分子靶的示例性信号多核苷酸。

　　在某些实施方案中，5’-端的荧光团分子结合至T核苷酸残基以防止由G核苷酸残基所引起的猝灭。

　　认识到要避免更高的解链温度(Tm)，两个链的Tm或者ΔG将需要比分子靶的结合亲合力低，以便于信号多核苷酸具有结合至分子靶的热力学优先。为了保留优选的分子靶结合，可以添加Mg+2或者K+以移动平衡。多至约37mM KCl的添加将移动给定信号多核苷酸的平衡以促进分子靶的结合，而添加多至约5mM MgCl2将移动平衡以保持双链结构，从而降低信号多核苷酸对于其分子靶的亲合力。

　　两个反向互补链不必在对侧以创造茎-环结构。反向互补链可以附接/退火至5’-端。序列必须足够长以物理干涉所述结构。双链结合需要防止次级结构折叠的形成，需要所述次级结构折叠以结合分子靶。

　　在某些实施方案中，信号多核苷酸是二聚实体，其具有连接至荧光团的核心序列和连接至淬灭剂的较短退火的接头序列，或者反之亦然。

　　在某些实施方案中，信号多核苷酸序列用2’-O-甲基修饰来化学修饰。这类修饰预期不显著地影响关于分子靶的结合的结合亲合力和敏感性，同时提高稳定性。

　　本发明的靶：过敏原

　　本发明提供结合过敏原的检测分子(它们本身单体或者多聚体)。如上所述，检测分子可以基于核酸或者基于氨基酸。

　　在一些实施方案中，检测分子的靶是过敏原蛋白质或者其变体。在一些实施方案中，检测分子可以被设计以与蛋白质或者本身与过敏原缔合的其它生物分子结合或者缔合。

　　根据本发明，并且虽然不希望受理论限制，检测分子可以完全或者部分地结合过敏原。

　　在一些实施方案中，过敏原是食品过敏原。与食品有关的过敏原蛋白质的实例包括但不限于：咸水虾(Art fr 5)、蟹(Cha f 1)、北海虾(Cra c 1、Cra c 2、Cra c 4、Cra c5、Cra c 6、Cra c 8)、美洲龙虾(Hom a 1、Hom a 3、Hom a 6)、白虾(Lit v 1、Lit v 2、Litv 3、Lit v4)、罗氏沼虾(Mac r 1)、对虾(Met e 1、Pen a 1、Pen i 1)、北方对虾(Pan b1)、龙虾(Pan s 1)、黑虎虾(Pen m 1、Pen m 2、Pen m 3、Pen m 4、Pen m 6)、窄爪小龙虾(Pon i 4、Pon i 7)、蓝蟹(Por p 1)、家牛(Bos d 4、Bos d 5、Bos d 6、Bos d 7、Bos d8、Bos d 9、Bos d 10、Bos d 11、Bos d 12)、大西洋鲱(Clu h 1)、鲤鱼(Cyp c 1)、波罗的海鳕鱼(Gad c 1)、大西洋鳕鱼(Gad m 1、Gad m 2、Gad m 3)、鳕鱼(Gad c 1)、鸡(Gal d 1、Gal d 2、Gal d 3、Gal d 4、Gal d 5)、澳洲肺鱼(Lat c 1)、帆鳞鲆(Lep w 1)、鲑鱼(Onc k5)、大西洋鲑(Sal s 1、Sal s 2、Sal s 3)、虹鳟(Onc m 1)、莫桑比克罗非鱼(Ore m 4)、食用蛙(Ran e 1、Ran e 2)、太平洋沙瑙鱼(Sar sa 1)、大洋鲈(Seb m 1)、黄鳍金枪鱼(Thu a1,、Thu a 2、Thu a 3)、剑鱼(Xip g 1)、鲍鱼(Hal m 1)、庭园大蜗牛(Hel as 1)、鱿鱼(Todp 1)、菠萝(Ana c 1、Ana c 2)、芦笋(Aspa o 1)、大麦(Hor v 12、Hor v 15、Hor v 16、Horv 17、Hor v 20、Hor v 21)、香蕉(Mus a 1、Mus a2、Mus a 3、Mus a 4、Mus a 5)、香蕉(Musxp1)、稻子(Ory s 12)、黑麦(Sec c 20)、小麦(Tri a 12、Tri a 14、Tri a 18、Tri a19、Tri a 25、Tri a 26、Tri a36、Tri a 37)、玉蜀黍(玉米)(Zea m 14、Zea m 25)、猕猴桃(Act c1、Act c2、Act c 5、Act c 8、Act c 10、Act d 1、Act d 2、Act d 3、Act d 4、Actd5、Act d 6、Act d 7、Act d 8、Act d 9、Act d 10、Act d 11)、腰果(Ana o 1、Ana o 2、Ana o 3)、芹菜(Api g 1、Api g 2、Api g 3、Api g 4、Api g 5、Api g 6)、花生(Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 4、Ara h 5、Ara h 6、Ara h 7、Ara h 8、Ara h 9、Ara h 10、Arah 11、Ara h 12、Ara h 13)、巴西坚果(Ber e 1、Ber e 2)、东方芥末(Bra j 1)、菜籽(Bran 1)、卷心菜(Bra o 3)、芜菁(Bra r 1、Bra r 2)、灯笼椒(Cap a 1w、Cap a 2)、山核桃(Car i 1、Car i 4)、栗子(Cas s 1、Cas s 5、Cas s 8、Cas s 9)、柠檬(Cit I 3)、柑橘(Cit r 3)、甜橙(Cit s 1、Cit s 2、Cit s 3)、榛子(Cor a 1、Cor a 2、Cor a 8、Cor a 9、Cor a 11、Cor a 12、Cor a 13、Cor a 14)、甜瓜(Cuc m 1、Cuc m 2、Cuc m3)、胡萝卜(Dau c1、Dau c 4、Dau c 5)、荞麦(Fag e 2、Fag e 3)、苦荞(Fag t 2)、草莓(Fra a 1、Fra a 3、Fra a 4)、大豆(Gly m 1、Gly m 2、Gly m 3、Gly m 4、Gly m 5、Gly m 6、Gly m 7、Gly m8)、向日葵(Hel a1、Hel a 2、Hel a 3)、黑胡桃(Jug n 1、Jug n 2)、胡桃(Jug r 1、Jug r2、Jug r 3、Jug r 4)、栽培莴苣(Lac s 1)、扁豆(Len c 1、Len c 2、Len c 3)、荔枝(Lit c1)、狭叶蓝羽扇豆(Lup an 1)、苹果(Mal d 1、Mal d 2、Mal d 3、Mal d 4)、木薯(Man e5)、桑葚(Mor n 3)、牛油果(Pers a 1)、青豆(Pha v 3)、阿月浑子(Pis v 1、Pis v 2、Pisv 3、Pis v 4、Pis v 5)、豌豆(Pis s 1、Pis s 2)、杏(Pru ar 1、Pru ar 3)、甜樱桃(Pruav 1、Pru av 2、Pru av 3、Pru av 4)、欧洲李(Pru d 3)、杏仁(Pru du 3、Pru du 4、Prudu 5、Pru du 6)、桃(Pru p 1、Pru p 2、Pru p3、Pru p 4、Pru p 7)、石榴(Pun g 1)、梨(Pyr c 1、Pyr c 3、Pyr c 4、Pyr c5)、蓖麻(Ric c 1)、红树莓(Rub i 1、Rub i 3)、芝麻(Ses i 1、Ses i 2、Ses i3、Ses i 4、Ses i 5、Ses i 6、Ses i 7)、黄芥末(Sin a 1、Sin a2、Sin a 3、Sin a 4)、西红柿(Sola I 1、Sola I 2、Sola I 3、Sola I 4)、马铃薯(Sola t1、Sola t 2、Sola t 3、Sola t 4)、绿豆(Vig r 1、Vig r 2、Vig r 3、Vig r 4、Vig r5、Vigr 6)、葡萄(Vit v 1)、红枣(Ziz m 1)、腰果树(Anacardium occidentale)(Ana o 1.0101、Ana o 1.0102)、芹菜(Apium graveolens)(Api g 1.0101、Api g 1.0201)、野胡萝卜(Daucus carota)(Dau c1.0101、Dau c1.0102、Dau c1.0103、Dau c1.0104、Dau c1.0105、Dau c1.0201)、甜橙(Cit s3.0101、Cit s3.0102)、大豆(Gly m1.0101、Gly m1.0102、Glym3.0101、Gly m3.0102)、兵豆(Lens culinaris)(Len c1.0101、Len c1.0102、Lenc1.0103)、豌豆(Pis s1.0101、Pis s1.0102)、番茄(Lyc e2.0101、Lyc e2.0102)、草莓(Fraa3.0101、Fra a3.0102、Fra a3.0201、Fra a3.0202、Fra a3.0203、Fra a3.0204、Fraa3.0301)、苹果(Mal d1.0101、Mal d1.0102,Mal d1.0103、Mal d1.0104、Mal d1.0105、Mald1.0106、Mal d1.0107、Mal d1.0108、Mal d1.0109、Mal d1.0201、Mal d1.0202、Mald1.0203、Mal d1.0204、Mal d1.0205、Mal d1.0206、Mal d1.0207、Mal d1.0208、Mald1.0301、Mal d1.0302、Mal d1.0303、Mal d1.0304、Mal d1.0401、Mal d1.0402、Mald1.0403、Mal d3.0101w、Mal d3.0102w、Mal d3.0201w、Mal d3.0202w、Mal d3.0203w、Mald4.0101、Mal d4.0102、Mal d4.0201、Mal d4.0202、Mal d4.0301、Mal d4.0302)、甜樱桃(Prunus avium)(Pru av1.0101、Pru av1.0201、Pru av1.0202、Pru av1.0203)和桃(Prunus persica)(Pru p4.0101、Pru p4.0201)；以及它们的任何变体。与食品有关的过敏原的名称系统地命名，并且根据IUIS过敏原命名法小组委员会(IUIS AllergenNomenclature Sub-Committee)(参见国际免疫学会联合会过敏原命名法小组委员会(International Union of Immunological Societies Allergen Nomenclature Sub-Committee)，异过敏原和变体的名单。)

　　除食品过敏原之外，检测分子可以检测空气播散微粒/过敏原及其它环境过敏原。含有过敏原的样品可以得自植物(例如野草、草、树、花粉)、动物(例如，在诸如猫、狗、牛、猪、绵羊、马、兔、大鼠、豚鼠、小鼠和沙鼠的哺乳动物的皮屑、尿、唾液、血液或者其它体液中发现的过敏原)、真菌/霉菌、昆虫(例如针昆虫，诸如蜂、黄蜂和大黄蜂及摇蚊科(chirnomidae)(非吸血蠓)以及其它昆虫，诸如家蝇、果蝇、绵羊丽蝇、螺旋蝇、谷象、蚕、蜜蜂、非吸血蠓幼虫、蜡螟幼虫、粉虫、蟑螂和黄粉虫(Tenibrio molitor)甲虫幼虫；蜘蛛和诸如屋尘螨的螨)、橡胶(例如乳胶)、金属、化学品(例如药品、蛋白质清洁添加剂)和自体过敏原及人类自体过敏原(例如Hom s 1、Hom s 2、Hom s 3、Hom s 4、Hom s 5)(参见过敏原命名法：国际免疫学会联合会过敏原命名法小组委员会，过敏原名单以及过敏原命名法：国际免疫学会联合会命名法小组委员会，异过敏原和变体的名单)。

　　可以使用本发明的检测分子和装置检测的来自植物的过敏原蛋白质的实例包括但不限于：白蜡树(Fra e 1)、日本扁柏(Cha o1、Cha o 2)、sugi(Cry j1、Cry j 2)、柏树(Cup a 1)、线柏(Cup s 1、Cup s 3)、雪松(Jun a 1、Jun a 2、Jun a 3、Jun s 1)、阿伯刺桧(Jun o 4)、铅笔柏(Jun v 1、Jun v 3)、黄花草(Ant o 1)、藏红花(Cro s 1、Cro s 2)、百慕大草(Cyn d 1、Cyn d 7、Cyn d 12、Cyn d 15、Cyn d 22w、Cyn d 23、Cyn d 24)、鸭茅(Dac g 1、Dac g 2、Dac g 3、Dac g 4、Dac g 5)、草甸狐茅(Fes p 4)、绒毛草(Hol I 1、Hol I 5)、大麦(Hor v 1、Hor v 5)、黑麦草(Lol p 1、Lol p 2、Lol p 3、Lol p 4、Lol p11)、巴哈雀稗(Pas n 1)、金丝雀草(Pha a 1、Pha a 5)、梯牧草(Phl p 1、Phl p 2、Phl p4、Phl p 5、Phl p 6、Phl p 7、Phl p 11、Phl p 12、Phl p13)、枣椰子(Pho d 2)、肯塔基蓝草(Poa p 1、Poa p 5)、黑麦(Sec c 1、Sec c 5、Sec c 38)、约翰逊草(Sor h 1)、小麦(Tria 15、Tri a 21、Tri a 27、Tri a28、Tri a 29、Tri a 30、Tri a 31、Tri a 32、Tri a 33、Tri a 34、Tri a 35、Tri a 39)、玉蜀黍(Zea m 1、Zea m 12)、桤木(Aln g 1、Aln g 4)、反枝苋(Ama r 2)、矮豚草(Amb a 1、Amb a 2、Amb a 3、Amb a 4、Amb a 5、Amb a 6、Amb a 7、Amb a 8、Amb a 9、Amb a 10、Amb a 11)、西部豚草(Amb p 5)、巨豚草(Amb t 5)、艾蒿(Artv 1、Art v 2、Art v 3、Art v 4、Art v 5、Art v6)、甜菜(Beta v 1、beta v 2)、欧洲白桦(Bet v 1、Bet v 2、Bet v 3、Bet v4、Bet v 6、Bet v 7)、芜菁(Bra r 5)、角树(Car b 1)、栗子(Cas s 1)、紫长春花(Cat r 1)、藜、苋(Che a 1、Che a 2、Che a 3)、阿拉伯咖啡(Cofa 1、Cof a 2、Cof a 3)、榛子(Cor a 6、Cor a 10)、榛仁(Cora1.04、Cora2、Cora8)、欧洲山毛榉(Fag s 1)、白蜡树(Fra e 1)、向日葵(Hel a 1、Hel a 2)、巴拉橡胶树(Hev b 1、Hevb 2、Hev b 3、Hev b 4、Hev b 5、Hev b 6、Hev b 7、Hev b 8、Hev b 9、Hev b 10、Hev b11、Hev b 12、Hev b 13、Hev b 14)、日本葎草(Hum j 1)、女贞(Lig v 1)、一年生山靛(Mercurialis annua)(Mer a 1)、橄榄(Ole e 1、Ole e 2、Ole e 3、Ole e 4、Ole e 5、Olee 6、Ole e 7、Ole e8、Ole e 9、Ole e 10、Ole e 11)、欧洲铁木(European hophornbeam)(Ost c1)、欧墙草(Parietaria judaica)(Par j 1、Par j 2、Par j 3、Par j 4)、药用墙草(Parietaria officinalis)(Par o 1)、长叶车前(Plantago lanceolata)(Pal I 1)、英国梧桐树(Pla a 1、Pla a 2、Pla a 3)、法国梧桐(Platanus orientalis)(Pla or1、Pla or2、Pla or 3)、白橡(Que a 1)、俄国蓟(Sal k 1、Sal k 2、Sal k 3、Sal k 4、Sal k 5)、西红柿(Sola I 5)、紫丁香(Syr v 1、Syr v 5)、俄国蓟(Sal k 1)、英国车前草(Pla l1)、豚草(Ambrosia artemisiifolia)(Amb a8.0101、Amb a8.0102、Amb a9.0101、Amb a9.0102)、长叶车前(Plantago lanceolata)(Pla l1.0101、Pla l1.0102、Pla l1.0103)、欧墙草(Parietaria judaica)(Par j 3.0102)、狗牙根(Cynodon dactylon)(Cyn d1.0101、Cynd1.0102、Cyn d1.0103、Cyn d1.0104、Cyn d1.0105、Cyn d1.0106、Cyn d1.0107、Cynd1.0201、Cyn d1.0202、Cyn d1.0203、Cyn d1.0204)、绒毛草(Holcus lanatus)(HolI1.0101、Hol I1.0102)、黑麦草(Lolium perenne)(Phl p1.0101、Phl p1.0102、Phlp4.0101、Phl p4.0201、Phl p5.0101、Phl p5.0102、Phl p5.0103、Phl p5.0104、Phlp5.0105、Phl p5.0106、Phl p5.0107、Phl p5.0108、Phl p5.0201、Phl p5.0202)、黑麦(Secale cereale)(Sec c20.0101、Sec c20.0201)、疣皮桦(Betula Verrucosa)(Betv1.0101、Bet v1.0102、Bet v1.0103、Bet v1.0201、Bet v1.0301、Bet v1.0401、Betv1.0402、Bet v1.0501、Bet v1.0601、Bet v1.0602、Bet v1.0701、Bet v1.0801、Betv1.0901、Bet v1.1001、Bet v1.1101、Bet v1.1201、Bet v1.1301、Bet v1.1401、Betv1.1402、Bet v1.1501、Bet v1.1502、Bet v1.1601、Bet v1.1701、Bet v1.1801、Betv1.1901、Bet v1.2001、Bet v1.2101、Bet v1.2201、Bet v1.2301、Bet v1.2401、Betv1.2501、Bet v1.2601、Bet v1.2701、Bet v1.2801、Bet v1.2901、Bet v1.3001、Betv1.3101、Bet v6.0101、Bet v6.0102)、欧洲鹅耳枥(Carpinus betulus)(Car b1.0101、Carb1.0102、Car b1.0103、Car b1.0104、Car b1.0105、Car b1.0106、Car b1.0106、Carb1.0106、Car b1.0106、Car b1.0107、Car b1.0107、Car b1.0108、Car b1.0201、Carb1.0301、Car b1.0302)、欧洲榛(Corylus avellana)(Cor a1.0101、Cor a1.0102、Cora1.0103、Cor a1.0104、Cor a1.0201、Cor a1.0301、Cor a1.0401、Cor a1.0402、Cora1.0403、Cor a1.0404)、普通女贞(Ligustrum vulgare)(Syr v1.0101、Syr v1.0102、Syrv1.0103)、柳杉(Cryptomeria japonica)(Cry j2.0101、Cry j2.0102)和丝柏(Cupressussempervirens)(Cup s1.0101、Cup s1.0102、Cup s1.0103、Cup s1.0104、Cup s1.0105)；以及它们的任何变体。

　　羽扇豆是属于羽扇豆属的豆科草本植物。在欧洲，羽扇豆细粉及种子被广泛的用于面包、饼干、糕点、意大利面、酱，以及在饮料中作为牛奶或大豆的替代，并且用于无谷蛋白食品。国际免疫学会联合会(IUIS)过敏原命名法小组委员会近来指定β-羽扇豆球蛋白作为Lup an 1过敏原(Nadal等人，(2012)DNA Aptamers against the Lup an 1FoodAllergen.PLoS ONE 7(4):e35253)，并且新近报道了针对Lup an 1(β-羽扇豆球蛋白)的高亲合力11-mer DNA适体(Nadal等人，(2013)Probing high-affinity11-mer DNA aptameragainst Lup an 1(β-conglutin).Anal.Bioanal.Chem.405:9343–9349)。

　　可以使用本发明的检测分子和装置检测的来自螨的过敏原蛋白质的实例包括但不限于：螨(Blo t 1、Blo t 3、Blo t 4、Blo t 5、Blo t 6、Blo t 10、Blo t 11、Blo t 12、Blo t 13、Blo t 19、Blo t 21)；美洲屋尘螨(Der f 1、Der f 2、Der f 3、Der f 7、Der f10、Der f 11、Der f 13、De rf 14、Der f 15、Der f 16、Der f 17、Der f 18、Der f 22、Der f 24)；微角尘螨(Dermatophagoides microceras)(屋尘螨)(Der m 1)；欧洲屋尘螨(Der p 1、Der p 2、Der p 3、Der p 4、Der p 5、Der p 6、Der p 7、Der p 8、Der p 9、Derp 10、Der p 11、Der p 14、Der p 15、Der p 20、Der p 21、Der p 23)；埋内宇尘螨(屋尘螨)(Eur m 2、Eur m 2、Eur m 3、Eur m 4、Eur m 14)；贮藏螨(Aca s 13、Gly d 2、Lep d2、Lep d 5、Lep d 7、Lep d 10、Lep d 13、Tyr p 2、Tyr p 3、Tyr p 10、Tyr p 13、Tyr p24)、粉尘螨(Dermatophagoides farinae)(Der f1.0101、Der f1.0102、Der f1.0103、Derf1.0104、Der f1.0105、Der f2.0101、Der f2.0102、Der f2.0103、Der f2.0104、Derf2.0105、Der f2.0106、Der f2.0107、Der f2.0108、Der f2.0109、Der f2.0110、Derf2.0111、Der f2.0112、Der f2.0113、Der f2.0114、Der f2.0115、Der f2.0116、Derf2.0117)、屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)(Der p1.0101、Der p1.0102、Derp1.0103、Der p1.0104、Der p1.0105、Der p1.0106、Der p1.010、Der p1.0108、Derp1.0109、Der p1.0110、Der p1.0111、Der p1.0112、Der p1.0113、Der p1.0114、Derp1.0115、Der p1.0116、Der p1.0117、Der p1.0118、Der p1.0119、Der p1.0120、Derp1.0121、Der p1.0122、Der p1.0123、Der p2.0101、Der p2.0102、Der p2.0103、Derp2.0104、Der p2.0105、Der p2.0106、Der p2.0107、Der p2.0108、Der p2.0109、Derp2.0110、Der p2.0111、Der p2.0112、Der p2.0113)、埋内宇尘螨(Euroglyphus maynei)(Eur m2.0101、Eur m2.0102)、害鳞嗜螨(Lepidoglyphus destructor)(Lep d2.0101、Lepd2.0101、Lep d2.0101、Lep d2.0102、Lep d2.0201、Lep d2.020)和家食甜螨(Glycyphagusdomesticus)(Gly d2.0101、Gly d2.0201)；以及它们的任何变体。

　　可以使用本发明的检测分子和装置检测的来自动物的过敏原蛋白质的实例包括但不限于：家牛(Bos d 2、Bos d 3、Bos d 4、Bos d 5、Bos d 6、Bos d 7、Bos d 8)、狗(Canf 1、Can f 2、Can f 3、Can f 4、Can f 5、Can f6)、家马(Equ c 1、Equ c 2、Equ c 3、Equc 4、Equ c 5)、猫(Fel d 1、Fel d2、Fel d 3、Fel d 4、Fel d 5w、Fel d 6w、Fel d 7、Feld 8)、小鼠(Mus m 1)、豚鼠(Cav p 1、Cav p 2、Cav p 3、Cav p 4、Cav p 6)、兔(Ory c 1、Ory c 3、Ory c 4)、大鼠(Rat n 1)、家牛(Bos domesticus)(Bos d 2.0101、Bos d2.0102、Bos d 2.0103)和家马(Equus caballus)(Equ c2.0101、Equ c 2.0102)；以及它们的任何变体。

　　可以使用本发明的检测分子和装置检测的来自昆虫的过敏原蛋白质的实例包括但不限于黄热病蚊(Aed a 1、Aed a 2、Aed a 3)、东方蜜蜂(Api c 1)、大蜜蜂(Api d 1)、蜜蜂(Api m 1、Api m 2、Api m 3、Api m 4、Api m5、Api m 6、Api m 7、Api m 8、Api m 9、Api m 10、Api m 11、Api m 12)、鸽锐缘蜱(Arg r 1)、德国小蠊(Bla g 1、Bla g 2、Bla g3、Bla g 4、Bla g 5、Bla g 6、Bla g 7、Bla g 8、Bla g 11)、熊蜂(Bom p 1、Bom p 4、Bomt 1、Bom t 4)、蚕蛾(Bomb m 1)、蠓(Chi k 10、Chi t 1、Chi t 1.01、Chi t 2、Chi t2.0101、Chi t 2.0102、Chi t 3、Chi t 4、Chi t 5、Chi t 6、Chi t 6.01、Chi t 7、Chi t8、Chi t 9)、猫蚤(Cte f 1、Cte f 2、Cte f 3)、黄蜂(Dol a 5)、白脸大黄蜂(Dol m 1、Dolm 2、Dol m 5)、吸血蠓(For t 1、For t 2)、萨凡纳采采蝇(Glo m 5)、亚洲瓢虫(Har a 1、Har a 2)、蠹虫(Lep s 1)、书虱(Lip b 1)、澳大利亚跳蚁(Myr p 1、Myr p 2、Myr p 3)、美洲蟑螂(Per a1、Per a 3、Per a 6、Per a 7、Per a 9、Per a 10)、印度谷螟(Plo i 1、Ploi 2)、黄蜂(Pol a 1、Pol a 2、Pol a 5、Pol e 1、Pol e 4、Pol e 5、Pol f 5、Pol g 1、Polg 5、Pol m 5、Poly p 1、Poly s 5、Ves vi 5)、地中海胡蜂(Pol d 1、Pol d 4、Pol d 5)、热带火蚁(Sol g 2、Sol g 3、Sol g 4)、红火蚁(外引红火蚁)(Sol I 1、Sol I 2、Sol I 3、Sol I 4)、黑火蚁(Sol r 2、Sol r 3)、巴西火蚁(Sol s 2、Sol s 3)、马蝇(Tab y 1、Tab y2、Tab y 5)、松毛虫队列蛾(Tha p 1、Tha p 2)、加利福尼亚猎蝽(Tria p 1)、欧洲大黄蜂(Vesp c 1、Vesp c 5)、大胡蜂(Vespa magnifica)(大黄蜂)(Vesp ma 2、Vesp ma 5)、金环胡蜂(Vespa mandarinia)(巨亚洲大黄蜂)(Vesp m1、Vesp m 5)、小黄蜂(Ves f 5、Ves g5、Ves m 1、Ves m 2、Ves m 5)、德国黄胡蜂(Vespula germanica)(小黄蜂)(Ves p 5)、大黄蜂(Vespula squamosa)(小黄蜂)(Ves s 1、Ve s s5)、黄胡蜂(Vespula vulgaris)(小黄蜂)(Ves v 1、Ves v 2、Ves v 3、Ves v 4、Ves v 5、Ves v 6)、德国小蠊(Blattellagermanica)(Bla g 1.0101、Bla g 1.0102、Bla g 1.0103、Bla g 1.02、Bla g 6.0101、Blag 6.0201、Bla g6.0301)、美洲大蠊(Periplaneta Americana)(Per a1.0101、Pera1.0102、Per a1.0103、Per a1.0104、Per a1.02、Per a3.01、Per a3.0201、Per a3.0202、Per a3.0203、Per a7.0101、Per a7.0102)、黄边胡蜂(Vespa crabo)(Ves pc5.0101、Vespc 5.0101)、金环胡蜂(Vespa mandarina)(Vesp m 1.01、Vesp m 1.02)；以及它们的任何变体。

　　可以使用本发明的检测分子和装置检测的来自真菌/霉菌的过敏原蛋白质的实例包括但不限于：链格孢菌(Alternaria alternata)(链格孢腐菌)(Alt a 1、Alt a 3、Alt a4、Alt a 5、Alt a 6、Alt a 7、Alt a 8、Alt a 10、Alt a 12、Alt a 13)、黄曲霉(Aspergillus flavus)(真菌)(Asp fl 13)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(真菌)(Aspf 1、Asp f 2、Asp f 3、Asp f 4、Asp f5、Asp f 6、Asp f 7、Asp f 8、Asp f 9、Asp f 10、Asp f 11、Asp f 12、Asp f 13、Asp f 15、Asp f 16、Asp f 17、Asp f 18、Asp f 22、Asp f23、Asp f 27、Asp f 28、Asp f 29、Asp f 34)、黑曲霉(Aspergillus niger)(Asp n 14、Asp n18、Asp n 25)、米曲霉(Aspergillus oryzae)(Asp o 13、Asp o 21)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)(Asp v 13)、白色念珠菌(Candida albicans)(酵母菌)(Canda 1、Cand a 3)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)(酵母菌)(Cand b 2)、芽枝状枝孢(Cladosporium cladosporioides)(Cla c 9、Cla c 14)、多主枝孢(Cladosporiumherbarum)(Cla h 2、Cla h 5、Cla h 6、Cla h 7、Cla h8、Cla h 9、Cla h 10、Cla h 12)、弯孢叶斑病菌(Curvularia lunata)(异名：旋孢腔菌)(Cur l 1、Cur I 2、Cur I 3、Cur I4)、黑附球菌(Epicoccum purpurascens)(土壤真菌)(Epi p 1)、黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)(N.A.)(Fus c 1、Fus c 2)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)(Fus p 4)、短密青霉(Penicillium brevicompactum)(Pen b 13、Pen b 26)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)(Pen ch 13、Pen ch 18、Pen ch 20、Pen ch 31、Pen ch 33、Pen ch 35)、桔青霉(Penicillium citrinum)(Pen c 3、Pen c 13、Pen c 19、Pen c 22、Pen c 24、Pen c30、Pen c 32)、皮壳青霉(Penicillium crustosum)(Pen cr 26)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)(Pen o 18)、葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)(Sta c 3)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)(Tri r 2、Tri r 4)、断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)(Trit 1、Tri t 4)、古巴光盖伞(Psilocybe cubensis)(Psi c 1、Psi c 2)、毛头鬼伞(Cop c1、Cop c 2、Cop c 3、Cop c 5、Cop c 7)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(Rho m1、Rho m 2)、糠秕马拉色氏霉菌(Malassezia furfur)(Malaf2、Malaf3、Malaf4)、合轴马拉色菌(Malassezia sympodialis)(Malas1、Malas5、Malas6、Malas7、Malas8、Malas9、Malas10、Malas11、Malas12、Malas13)和链格孢霉(Alternaria alternate)(Alt a1.0101、Alt a1.0102)；以及它们的任何变体。

　　其它过敏原的实例包括但不限于：线虫(Ani s 1、Ani s 2、Ani s 3、Ani s 4)、蠕虫(Asc s 1)、软珊瑚(Den n 1)、橡胶(乳胶)(Hev b 1、Hev b 2、Hev b 3、Hev b 5、Hev b6、Hev b 7、Hev b 8、Hev b 9、Hev b 10、Hev b11、Hev b 12、Hev b 13)、非洲白木(Trip s1)和巴西橡胶树(Hev b6.01、Hev b6.0201、Hev b6.0202、Hev b6.03、Hev b8.0101、Hevb8.0102、Hev b8.0201、Hev b8.0202、Hev b8.0203、Hev b8.0204、Hev b10.0101、Hevb10.0102、Hev b10.0103、Hev b11.0101、Hev b11.0102)；以及它们的任何变体。

　　在一些实施方案中，本方法和装置可以用于医院中临床食品过敏或过敏测试和鉴定患者对其过敏的食品/过敏原。此外，本发明的便携式装置可以用作患有食品/环境过敏的人的随身测试器，例如在家测试商业食品或者在饭店检查它们所点的菜。食品样品可以是含有来源于动物的肉和/或蔬菜的新鲜食品、冷冻食品、冷却食品或者处理过的食品。

　　本发明的靶：病原体

　　在一些实施方案中，本发明提供结合至样品中的致病微生物的检测分子。如上讨论的检测分子是被设计结合一个或多个特异于病原微生物的靶蛋白质的核酸分子(优选地是适体)。靶蛋白质可以是由病原体分泌的分子、表面蛋白质、病原体攻击的宿主中诱导的蛋白质或者靶蛋白质的部分。本发明允许许多不同类型的致病微生物的检测和鉴定，诸如细菌、酵母菌、真菌、孢子、病毒或者朊病毒。

　　如本文使用，术语“病原体”意为任何致病物(尤其是病毒或细菌或者其它微生物)。

　　在一些方面，本方法和装置提供样品中致病微生物的高特异性和敏感性的极快速检测和鉴定。本发明可以用于医疗、公共安全、军事目的或者政府使用。

　　根据本发明，病原微生物是病原菌。在某些实施方案中，病原菌是人类病原菌，诸如例如炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布氏杆菌(Brucellacanis)、马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏杆菌(Brucella suis)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、衣原体(Chlamydophila)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风杆菌(Clostridiumtetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli)、肠致病性大肠杆菌(EnteropathogenicE.Coli)、大肠杆菌O 175:H7、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、单核细胞增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、汉森氏杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎支原体(Mycolasma pneumonia)、淋病奈瑟菌(Neissaria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)。

　　在一些方面，病原体可以是病原病毒，诸如例如以下中的一员：乳头瘤病毒、细小病毒、腺病毒、疱疹病毒、疫苗病毒、沙粒病毒、冠状病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、微小核糖核酸病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、逆转录病毒、棒状病毒或者人类免疫缺陷性病毒(HIV)、多瘤病毒、痘病毒、肝病毒、星型病毒、杯状病毒、黄病毒、披膜病毒、疱疹病毒、正粘病毒、布亚病毒或丝状病毒。

　　病原体可以是以下病状的致病物的真菌，诸如例如癣、组织胞浆菌病、芽生菌病、曲霉病、隐球菌病、孢子丝菌病、球孢子菌病、副球孢子菌病、毛霉菌病、念珠菌病、脚气、原藻病、糠疹、足分枝菌病、副球孢子菌病、暗色丝状菌病(Phaeohphomycosis)、假性阿利什利菌病、毛孢子菌病或肺孢子虫。

　　在一些实施方案中，病原体可以是引起植物疾病的植物病原体。引起植物疾病的病原体包括真菌、细菌、原生生物、病毒、卵菌、病毒样有机体、类病毒、植原体、原生动物和线虫。引起植物疾病的真菌中的大部分包括子囊菌和担子菌。重要的细菌植物病原体包括伯克氏菌、变形菌、丁香假单胞菌pv和植原体。作为非限制实例，植物病原体包括地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)(引起柑桔溃疡病)、大豆锈病菌(P.pachyrhizi)(引起大豆锈病)、未培养细菌(引起黄死病)、纤细病毒属(引起玉米斑纹病毒)、猝死病菌(Phytophthora ramorum)(水霉)(引起橡树猝死病)、柑橘黄龙病菌亚洲种(CandidatusLiberibacter asiaticus)(引起青果病)和木质难养菌(Xyllella fastidiosa)(引起皮尔斯病)。

　　在一些实施方案中，病原体可以是能够感染动物的动物病原体。动物病原体包括但限于流产衣原体(Chlamydophila abortus)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、猪蛔虫(Ascaris suum)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、其它曲霉物种(Aspergillus species)、多杀巴斯德菌(asteurella multocida)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、驽巴贝斯虫(Babesia caballi)、陶氏巴贝虫(Babesia trautmanni)、莫氏巴贝斯虫(Babesia motasi)、多杀巴斯德菌(asteurellamultocida)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、犬新孢子虫(Neospora caninum)、艾美虫物种(Eimeria species)、反刍埃里希氏体(Ehrlichia ruminantium)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus)(BVDV或BVD)；蓝舌病毒(Bluetongue Virus)(BTV)；口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus)(FMDV)；恶性卡他热(MalignantCatarrhal Fever)(MCF)；绵羊疱疹病毒-2(ovine herpesvirus-2)(OvHV-2)；狷羚疱疹病毒-1(alcelaphine herpesvirus-1)(AHV1)；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcineRespiratory Reproductive Syndrome Virus)(PRRSV或PRRS)；牛瘟病毒(RinderpestVirus)(RPV)；猪水泡病病毒(Swine Vesicular Disease Virus)(SVDV或SVD)；猪水疱疹病毒(Vesicular Exanthema of Swine Virus)(VESV)；水疱性口炎病毒(VesicularStomatitis Virus)(VSV)；牛疱疹病毒-1(Bovine Herpesvirus-1)(BHV-1或BHV)；副痘(Parapox)(PPDX或PPox)；和牛丘疹性口内炎病毒(Bovine Papular Stomatitis Virus)(BPSV)。

　　在一些实施方案中，检测分子对于致病微生物的特定的属、物种或者菌株具有特异性。

　　在一些实施方案中，本发明可用于检测和鉴定样品中的病原体。在一些实施方案中，样品是食品样品、饮料样品、水样品、土壤样品、植物样品、农业样品、动物样品、生物样品、手术活检、药物样品或者个人护理样品。

　　在一些实施方案中，本发明可以在食品工业使用以用于检测食品污染和食品安全控制。根据本发明，检测分子可以检测和鉴定食品样品中的微生物(例如腐败微生物和致病微生物)。

　　在一些实施方案中，食品样品可以是食品或者食品产品。样品可以是原料、成品食品产品或者可以从生产或者贮藏的环境取得。作为非限制实例，食品样品可以是生肉或肉产品；乳制产品(diary product)(例如乳酪酸奶)；蔬菜或者基于蔬菜的产品(例如沙拉)；婴儿配方奶粉；或者罐装食品。

　　在一些实施方案中，样品可以是饮料样品，诸如啤酒或者在啤酒的酿造期间取得的样品。换言之，本发明可用于检测诸如啤酒腐败细菌的微生物的存在。在某些方面，饮料包括饮用水。因此，本发明可用于检测饮用水中的病原污染。

　　在一些实施方案中，致病微生物的存在可以在动物样品中检测到。动物样品可以来自任何有机体，哺乳动物样品包括人类、家畜(例如绵羊、奶牛、马、猪、山羊、羊驼、鸸鹋、鸵鸟或者驴)、家禽(例如鸡、火鸡、鹅、鸭或者猎鸟)、鱼(例如鲑鱼或者鲟鱼)、实验动物(例如兔、豚鼠、大鼠或者小鼠)、伴侣动物(例如狗或者猫)或者野生动物。

　　在一个实施方案中，样品可以是个人护理产品，诸如眼睛护理产品，例如隐形眼镜液或者抗组胺眼药水。

　　在一些实施方案中，样品可以是药物制剂(例如药品)。

　　在一些实施方案中，致病微生物的存在可以在植物样品中检测到。根据本发明，植物样品可以是叶子、根、花、种子、果实、茎或者植物的任何部分。植物样品是指包括但不限于农作物或者温室生长植物的任何植物。本发明还涵盖得自野生植物(即不是由人种植的植物)的植物样品。

　　在一些实施方案中，致病微生物的存在可以在环境样品中检测到，包括但不限于空气样品、农业样品(包括植物样品和作物样品)、水样品和土壤样品。水样品可以例如但不限于从饮用水、污水贮水池、海水、湖泊、地下水、河流及其它水源得到。本发明公开的方法可以应用于家用、市政使用或政府使用。

　　在一些实施方案中，根据本发明的检测分子可以在制造厂使用以检测制造厂中使用的设备上或中的致病微生物的存在。

　　在一些实施方案中，本发明可以用作研究实验室中的工具。例如，检测分子可以检测体外细胞培养中的病原污染。

　　设想本发明可以在公共卫生应用上得到使用。例如，检测分子可用于检测国家/世界性的传染性疾病中致病微生物的存在。

　　还设想本发明提供轻质、低成本和人可便携的装置以检测、收集并且鉴定战场上的生物病原体和毒素。在一个实施方案中，本发明的装置和方法可以检测生物制剂的存在并且鉴定靶物种。

　　本发明的靶：疾病蛋白质

　　除过敏原和病原蛋白质之外，本发明提供结合其它靶分子(诸如疾病相关蛋白质)的检测分子以诊断、分级疾病和病症。疾病相关蛋白质可以是分泌的多肽和肽(例如循环分子)；细胞表面蛋白质(例如受体)；在特定疾病病状中表达或者过表达的生物标记物；仅存在于疾病病状中的特定蛋白质的异形体、衍生物和/或变体；引起病症的突变蛋白质；和来源于引起宿主中临床病状(诸如病毒感染)的另一有机体的蛋白质。检测分子可以是被设计成特异性结合靶蛋白质或者待测试蛋白质的寡聚肽片段上的表位的核酸分子(优选地是适体)。基于核酸的检测分子结合诊断蛋白质或者诊断蛋白质的部分，从而在体外诊断领域并且尤其是护理点(POC)诊断领域(例如战场和难民营现场上)提供快速和低成本的测定和装置。

　　作为非限制实例，根据本发明的分泌的循环蛋白质包括指示增殖的肿瘤细胞的生物标记物、炎症相关的标记物、激素、细胞因子、代谢产物和来源于病毒、细菌或者真菌感染的可溶解分子。例如，已经开发了细胞因子感测微孔；基于荧光共振能量转移(FRET)的适体信标用于检测IFN-γ(Tuleuova等人，Micropatterning of Aptamer Beacons to CreateCytokine-Sensing Surfaces.Cellular and Molecular Bioengineering,2010,3(4):337-344)。

　　还作为非限制实例，根据本发明的细胞表面蛋白是受体、细胞表面标记物、微生物抗原或者受体配体。

　　在一些实施方案中，用于诊断的靶蛋白质得自来自受试者(包括人类和动物)的生物样品。生物样品可以是体液、组织、组织活检(例如手术活检)、皮肤拭子、分离细胞群或者细胞制剂。体液样品可以是选自以下中的至少一个：血液、血清、血浆、脊髓液、脑脊髓液、关节液、羊水、泪液、支气管肺泡液、痰、阴道液、精液、咽洗液、鼻洗液、唾液、尿液和来自组织、器官和细胞或者其它来源的裂解液。在一些方面，细胞群体和细胞制剂中的细胞包括原代细胞和体外培养的细胞收集物。在其它方面，群体细胞含有患病的细胞(例如癌细胞)。在某些实施方案中，细胞群体和细胞制剂中的细胞选自动物细胞、植物细胞、病毒细胞、细菌细胞和真菌细胞。

　　根据本发明，检测方法和装置可以用于测定靶分子的存在、缺少或者量，其中所述靶分子是与临床病状有关的靶分子，并且其中所述可检测部分的量指示受试者中临床病状的存在。作为非限制实例，本发明的方法可以在病毒感染的检测中使用，例如乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、巨细胞病毒(CMV)、人类免疫缺陷性病毒(HIV)、埃-巴二氏病毒(EBV)、疱疹(HERPES)病毒、脊髓灰质炎病毒和流感病毒(人类和禽类)。本发明的方法还可以在细菌感染的检测中使用，诸如李斯特菌(Listeria)、金黄色葡萄球菌(StaphylococcusAureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistance StaphylococcusAureus)(MRSA)、白喉杆菌(Corynebacterium Diphtheriae)(引起白喉)、大肠杆菌(E.coli,)、B组链球菌(Group B streptococcus)(GBS)、A组链球菌(Group Astreptococcus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis)(引起肺结核(TB))、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio Cholerae)、弯曲杆菌(Campylobacter)、布鲁氏杆菌(Brucellosis)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria Meningitidis)(引起脑膜炎)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)和假丝酵母(Candida)。

　　本文描述的组合物和方法用于治疗或者预防与缺陷型NF-[κ]B激活有关的不希望或者有害的免疫反应，包括例如过敏、器官特异性疾病、寄生疾病和炎症及自身免疫疾病。过敏的实例包括季节性呼吸过敏、对空气过敏原的过敏(诸如枯草热)、通过降低血清IgE及嗜曙红细胞增多可治疗的过敏、哮喘、湿疹、动物过敏、食品过敏、慢性荨麻疹、乳胶过敏、过敏性鼻炎、特应性皮炎或者通过过敏脱敏可治疗的过敏。可以使用本发明的检测分子诊断的其它临床病状包括但不限于：癌症(例如实体肿瘤、上皮癌(carcinoma)、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞瘤、母细胞瘤或者转移瘤)、炎症疾病(克罗恩氏病、慢性炎症性眼病、慢性炎症性肺病及慢性炎症性肝病、自身免疫性溶血性贫血、特发性白细胞减少、溃疡性结肠炎、皮肌炎、硬皮病、混合结缔组织病、肠易激综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化、重症肌无力、格林巴利综合征(抗磷脂综合征)、原发性黏液水肿、甲状腺毒症、恶性贫血、自身免疫萎缩性胃炎、全秃、阿狄森氏病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、古德帕斯彻氏综合征、白塞氏综合征、干燥综合征、类风湿性关节炎、交感性眼炎、桥本氏病/甲状腺功能减退、乳糜泻/疱疹样皮炎、成人特发性甲状旁腺机能减退(AOIH)、肌萎缩性侧索硬化及脱髓鞘病、原发性胆汁性肝硬化、混合结缔组织病、慢性活动型肝炎、多内分泌衰竭、白癜风、乳糜泻、慢性活动型肝炎、CREST综合征、皮肌炎、扩张型心肌病、嗜曙红细胞增多-肌痛综合征、获得性表皮分解性水疱症(EBA)、巨细胞性动脉炎、格雷夫斯氏病/甲状腺机能亢进、硬皮病、慢性特发性血小板减少性紫癜、周围神经病变、糖尿病性神经病变、血色沉着病、亨-舍二氏紫癜、特发性IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、兰伯特-伊顿综合征、线性IgA皮肤病、心肌炎、发作性睡病、坏死性血管炎、新生儿狼疮综合征(NLE)、肾病综合征、类天疱疮、天疱疮、多发性肌炎、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、快速进行性肾小球性肾炎(RPGN)、莱特尔氏综合征及败血性休克)、遗传病、自身免疫疾病(例如多发性硬化、关节炎自身免疫性肝炎、克罗恩氏病、1型糖尿病、炎症性肠病、多发性硬化、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、僵人综合征、甲状腺炎、西登哈姆舞蹈病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、自身免疫再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、丘-施二氏病(Churg Strauss disease)、硬皮病、韦格纳氏肉芽肿病和维斯科特-奥尔德里奇综合征)、代谢紊乱、脑部疾病和心律失常。还可以通过本发明治疗或者预防的其它不希望有的免疫反应包括针对重组治疗剂的抗体，诸如血友病中的抗因子VIII抗体或者糖尿病中的抗胰岛素抗体。

　　短单链DNA抗凝血酶适体是已知的并且已经被表征(Hamaguchi等人，AptamerBeacons for the Direct Detection of Proteins.Analytical Biochemistry 2001,294:126-131；Wang等人，Ultrasensitive colorimetric detection of protein byaptamer–Au nanoparticles conjugates based on a dot-blot assay.Chem.Commun.,2008,2520–2522)。一个这样的抗凝血酶适体的核苷酸序列是5′GGTTGGTGTGGTTGG 3′(SEQID NO:10)。杂交热力学与激活速度之间的强负相关已经被证明，并且通过预组织适体内的凝血酶结合四链体，极大地增加了响应速率。因此，适体信标可以被设计以在添加凝血酶1分钟内激活三倍(Hall等人，Kinetic Optimization of a Protein-Responsive AptamerBeacon.Biotechnology and Bioengineering,2009,103(6):1049-1059；全文以引用方式并入本文)。

　　在一些方面，用于检测生物样品中的靶蛋白质的方法可以用作伴随诊断。患者中与特定疾病有关的生物标记物的存在和/或不存在将为特异性治疗提供有价值的信息。医师可以预测患者治疗的结果并且为患者连身定制最有效的方案。

　　在其它实施方案中，本发明可以用于监控受试者的疾病分期和进展以及治疗方案的功效，即监控受试者对治疗的响应。

　　因此，本发明可以用于军事环境(诸如在战场上)以及民用环境。便携式装置和一次性筒夹使得它易于使用，并且本发明的迅速检测有利于满足诸如创伤感染和传染性疾病的疾病的现场诊断的大量需求。

　　本发明的靶：其它分子

　　在一些实施方案中，本发明提供结合非蛋白质靶分子的检测分子，例如神经节苷脂、脂类、磷脂、碳水化合物、小分子(例如霉菌毒素和抗生素)、半抗原和核酸(DNA或RNA)。

　　在一些方面，本发明的检测分子可以是结合小分子的适体。在一些方面，结合小分子的适体可以应用于检测残留在环境中的杀虫剂和肥料的存在。结合小分子的适体可以识别杀虫剂、肥料及其它有机氯污染物。此检测将有助于除去使用杀虫剂和肥料后的残留。

　　杀虫剂的实例包括但不限于：有机磷杀虫剂(例如甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧乐果)；氨基甲酸酯杀虫剂；有机氯杀虫剂(例如DDT和氯丹)；拟除虫菊酯杀虫剂；和磺酰脲除草剂(例如烟嘧磺隆、氟胺磺隆)。

　　在其它方面，结合小分子的适体可用于检测样品中毒素的存在，例如污染诸如谷物和酒的各种食品商品的小分子霉菌毒素。结合小分子的检测分子(优选地是适体)的应用可以用于其它领域，诸如代谢组学和药物发现。

　　在其它方面，结合小分子的适体可用于检测非食品毒素，诸如发现于毒常春藤、东部毒橡树或毒漆树中的漆酚；诸如引起漆酚诱导的接触性皮炎的毒素。漆酚本身不是蛋白质，充当半抗原并且化学地反应、结合并且改变暴露的皮肤细胞上的完整膜蛋白质的形状。因为感染的细胞不被识别为身体的正常部分，所以引起T-细胞介导的免疫反应。

　　通用靶提取缓冲剂

　　在一些实施方案中，通用蛋白质提取缓冲剂可用于收回足够靶蛋白质(例如过敏原)(最小值2mg/ml总蛋白)用于任何食品基质的分析。在一些实施方案中，通用蛋白质提取缓冲剂的制剂可以在室温下并且以最小时间(小于1分钟)提取蛋白质。缓冲剂可能需要与将包括食品取样、均质化和过滤的提取方案合并。可以以随时间并且在不同食品基质中有效并且可重复的方式实施提取方案。此通用制剂将是临床相关的，以尽量最低限度地影响测试的食品，并且仅仅取样大概0.5g的食品，从而允许检测痕量过敏原，它们的浓度将在样品中最小。此优化的蛋白质提取过程将提供允许检测任何食品基质中的过敏原的快速、精确并且通用的方案。

　　试剂盒和包装

　　试剂盒。本发明的检测分子、化合物和组合物可以与其它成分或试剂组合或者制备为试剂盒或用于商业销售或分销的其它零售产品的成分。

　　试剂盒将含有化合物或组合物，以及关于试剂盒的施用和/或使用的说明书。试剂盒还可以含有以下中的一个或多个：注射器、包或瓶。

　　包装。由于制剂与含有PVC和无PVC的容器和容器封装相容，本发明的检测分子的制剂和/或组合物可以使用任何可接受的容器封装来包装用于各种药学或诊断可接受的容器。可接受的容器的实例包括但不限于安瓿和预填充注射器、筒夹等。

　　或者，制剂可以含有在混合包的一个隔室中和在混合包的分隔隔室中的可接受溶剂中的冻干适体，以使得两个隔室可以在施用至患者前混合在一起。可接受的容器在本领域众所周知并且是市售的。优选地，制剂存储在具有丁基橡胶塞的1型玻璃小瓶中。液体形式的制剂可以存储在冷藏环境中。或者，冻干制剂可以存储在室温下或者冷藏或冷冻。

　　优选地，制剂是无菌的。如本文使用的“无菌”制剂意为已经成为无菌状态并且尚未随后暴露于微生物学污染的制剂，即保持无菌组合物的容器未受损害。无菌组合物一般由药品生产商根据美国食品和药物管理局的现行药品优良制造规范(“cGMP”)条例来制备。

　　在一些实施方案中，无菌药物制剂可以使用无菌处理技术制备。通过使用无菌材料和受控制的工作环境来维持无菌。所有容器和设备在填充前优选地通过加热杀菌来灭菌。然后，在无菌条件下填充容器，诸如通过使组合物通过过滤器并且填充单元。因此，可以将制剂无菌填充到容器中以避免最终灭菌的热应力。

　　在一些实施方案中，使用湿热来最终灭菌所述制剂。最终灭菌可用于消灭含有药物制剂的最终密封容器中的所有活微生物。高压灭菌器通常用于完成处于最终包装中的药物产品的最终加热灭菌。制药工业中为实现最终产品的最终灭菌的典型高压灭菌器循环是121℃下至少10分钟。

　　等同物和范围

　　本领域技术人员将认识到或者能够仅仅使用常规实验确定根据本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。本发明的范围无意于受以上说明书限制，而是如随附的权利要求所限定。

　　在权利要求中，诸如“一个(a)”、“一个(an)”和“所述”的冠词可以意为一个或大于一个，除非相反地指明或从背景来看是明显的。在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或说明书被认为满足，如果一个、大于一个或者所有组成员存在于、使用于或相关于给定产品或过程，除非相反地指明或相从背景看来是明显的。本发明包括实施方案，其中组的恰好一个成员存在于、使用于或相关于给定产品或过程。本发明包括实施方案，其中大于一个或者所有组的成员存在于、使用于或相关于给定产品或过程。

　　还应注意，术语“包括”意欲为开放的，并且允许但不要求包括额外元素或步骤。当本文使用术语“包括”时，因此还涵盖并且公开术语“由...组成”。

　　当给定范围时，则包括端点。此外，应理解，除非另外指明或从背景和本领域技术人士的理解来看是明显的，表示为范围的值可以假定本发明的不同实施方案中的所述范围内的任何特定值或子范围至所述范围的下限的十分之一的单位，除非背景明显地另外指示。

　　使用术语“约”时，应理解为反映列举值的+/-10％。此外，应理解落入先前技术的本发明的任何特定实施方案可以明确地从权利要求的任何一个或多个中排除。因为这些实施方案被认为对于本领域技术人士已知，即使本文未明确地阐述所述排除时也可以排除它们。出于无论是否与先前技术的存在有关的任何原因，本发明的组合物的任何特定实施方案(例如任何核酸；任何产生方法；任何使用方法；等等)都可以从权利要求的任何一个或多个排除。

　　所有引用的来源，例如本文引用的文献、公开、数据库、数据库入口和技术以引用方式并入本申请，即使在引用中未明确地陈述。假如引用来源和本申请的陈述冲突，则以本申请中的陈述为准。分节和表格标题无意于受限制。

　　实施例

　　实施例1：检测系统

　　本发明的检测系统的一个实施方案示出在图1中。

　　数字检测装置包括食品收集机构、研磨机或浸离膜(macerating member)、有利于流动通过的任选的泵或真空、一个或多个激发器件(例如LED)、接收来自激发器件的发射光的一个或多个滤光器、读数机构和用户界面屏幕。

　　筒夹或者装置的一次性的或可互换部分可以包括具有任选的盖子的一个或多个收集探针、过敏原特异性筒夹、一个或多个激发器件(例如LED光)和一个或多个滤光器。

　　实施例2：适体作为信号多核苷酸的设计

　　在此概念验证实施例中，两个先前已知的适体序列用于设计三个不同的信号多核苷酸。针对Ara h 1蛋白质过敏原的适体由Tran等人在Selection of aptamers againstAra h 1protein for FO-SPR biosensing of peanut allergens in foodmatrices.Biosensors and Bioelectronics,2013,43,245-251(全文以引用方式并入本文)中描述。此适体的序列示出如下。

　　5′CGCACATTCCGCTTCTACCGGGGGGGTCGAGCTGAGTGGATGCGAATCTGTGGGTGGGCCGTAAGTCCGTGTGTGCGAA3′(SEQ ID NO:1)

　　修饰SEQ ID NO:的原始适体以添加5’-T残基来改善荧光团-淬灭剂对的功能。荧光素然后连接至如以下所示的5’-T残基。

　　5′荧光素TCGCACATTCCGCTTCTACCGGGGGGGTCGAGCTGAGTGGATGCGAATCTGTGGGTGGGCCGTAAGTCCGTGTGTGCGAA3′(SEQ ID NO:2)

　　具有3’-DABCYL淬灭剂的9-核苷酸接头如以下所示设计以与SEQ ID NO:2的T-修饰适体的5’-端的前十个残基互补。

　　3′DABCYLAGCGTGTAA5’(SEQ ID NO:3)

　　9-核苷酸接头(SEQ ID NO:3)然后退火到主要修饰的抗花生过敏原适体序列(SEQID NO:2)的5’-端，以使荧光素荧光团与DABCYL淬灭剂部分接近。用于检测花生过敏原Arah 1的组装的信号多核苷酸的结构示出如下。

　　

　　由退火SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3制备的信号多核苷酸是称为SPN-A*的二聚实体。SPN-A*的次级结构示出在图4中。信号多核苷酸200的组分的布置是核心序列202、荧光团204、淬灭剂206和接头序列208。

　　以类似的方式，信号多核苷酸基于由Tran等人在Selection andCharacterization of DNA Aptamers for Egg White Lysozyme.Molecules2010，15(3)，1127-1140(全文以引用方式并入本文)中描述的针对蛋清溶菌酶的适体设计。此适体的序列示出如下。

　　5′GCAGCTAAGCAGGCGGCTCACAAAACCATTCGCATGCGGC3′(SEQ ID NO：4)

　　修饰SEQ ID NO：4的原始适体以添加5’-T残基来改善荧光团-淬灭剂对的功能。荧光素然后连接至如以下所示的5’-T残基。

　　5′荧光素TGCAGCTAAGCAGGCGGCTCACAAAACCATTCGCATGCGGC3′(SEQ ID NO：5)

　　具有3’-DABCYL淬灭剂的10-核苷酸接头如以下所示设计，以与SEQ ID NO：5的T-修饰适体的5’-端的前十个残基互补。

　　3’DABCYLACGTCGATTC5’(SEQ ID NO：6)

　　10-核苷酸接头(SEQ ID NO：6)然后退火成主要修饰抗溶菌酶适体序列(SEQ IDNO：5)的5’-端以使荧光素荧光团与DABCYL淬灭剂部分接近。用于检测溶菌酶的组装信号多核苷酸的结构示出如下。

　　

　　由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6制备的二聚信号多核苷酸本文被称为SPN-E*。SPN-E*与溶菌酶之间的反应示意性地示出在图6中。信号多核苷酸SPN-E*400的组分的布置是核心序列402、荧光团404、淬灭剂406和接头序列408。可以看到，溶菌酶的结合扰乱发夹结构并且引起荧光团404远离淬灭剂406移动，从而允许荧光团404在激发时发荧光。

　　第三个信号多核苷酸基于如上所述的SEQ ID NO：4的适体序列设计。5’-T残基被附加至SEQ ID NO：4，并且3’-端通过添加与SEQ ID NO：4的原始适体序列的5’-端的最后五个核碱基互补的五个核碱基片段来修饰。然后，5’-荧光素与3’-DABCYL部分被连接以产生示出如下的序列(SEQ ID NO：7)，其中额外的五个核碱基片段连同原始适体序列5’-端的前五个核碱基加了下划线(不包括添加的5’-T残基)。

　　5′荧光素TGCAGCTAAGCAGGCGGCTCACAAAACCATTCGCATGCGGCGCTGCDABCYL3′(SEQ IDNO:7)

　　此信号多核苷酸是本文称为SPN-E的发夹实体。应认识到5’-端和3’-端的下划线残基是互补的，为了形成如图5的最左边结构所示的发夹次级结构(核心序列302)。此结构使荧光团304和淬灭剂306彼此紧密接近以允许淬灭剂306猝灭荧光团304。信号多核苷酸结合至溶菌酶可以扰乱如核心序列302的最右边结构所示的信号多核苷酸300的两个末端的杂交，进而导致荧光团304与淬灭剂306分离，从而激活荧光团304。

　　实施例3：在靶分子的检测中用于获得发夹类型信号多核苷酸荧光读数的程序

　　此实施例描述在鉴定和定量诸如蛋白质的分子靶的存在中，用于获得荧光读数并且从而测定信号多核苷酸的有效性的一个程序。例如，此程序用于检测发夹类型信号多核苷酸(诸如SPN-E)以及二聚信号多核苷酸(诸如SPN-E*和SPN-A*)。

　　所关心的蛋白质在双蒸水中被稀释至合适的浓度。信号多核苷酸在pH 7.5的10mMTRIS-HCl中被稀释至200μM。将此溶液加热至99℃3分钟，并且然后冷却至室温。作为TRIS-HCl的替代，可以使用pH 8.3的PBS或者tris(羟氨基)甲烷-甘氨酸-钾缓冲剂(TGK缓冲剂)。使用多道移液器尽快将蛋白质溶液添加至96-孔板的孔，并且然后将信号多核苷酸添加至各孔。然后以2分钟间隔取得40分钟时期的荧光读数。

　　实施例4：用于获得二聚信号多核苷酸的荧光读数的程序

　　此实施例描述在鉴定和定量诸如蛋白质的分子靶的存在中用于获得荧光读数并且从而测定信号多核苷酸的有效性的程序。例如，此程序用于检测诸如SPN-A*和SPN-E*的部分双链的信号多核苷酸。

　　信号多核苷酸SPN-A*和SPN-E*(分别是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5)的核心序列重悬浮在pH 7.5的10mM TRIS-HCl中，各自达到200μM的浓度。然后将这些溶液在约95℃至约100℃的温度范围内加热5分钟。然后添加对应的10-核碱基DABCYL-连接的链(对于SPN-A*和SPN-E*分别是SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6)，并且所述混合物允许在暗处冷却至室温30分钟以促进退火。在30分钟之后，将信号多核苷酸混合物稀释至100μM。

　　如表1中描述，制备一系列溶菌酶的连续稀释液。

　　表1：用于信号多核苷酸检测实验的溶菌酶稀释液的制备

　　

　　如表2中描述，制备一系列花生酱在PBS中的稀释液。

　　表2：用于信号多核苷酸检测实验的花生酱稀释液的制备

　　

　　还从1:1稀释在PBS中的整个生蛋清(样品E1)开始制备蛋清的稀释液。此原始制剂然后1:10稀释以生成样品E2，1:100稀释以生成样品E3，并且1:1000稀释以生成样品E4。

　　在一个实验中，将60μL的蛋白质溶液添加至96-孔板，并且然后添加浓度50μM的60μL信号多核苷酸。对照包括单独的信号多核苷酸(孔8和孔9)、缓冲剂(孔10)和信号多核苷酸与牛血清白蛋白组合(BSA-孔11和孔12)。96-孔板中的样品的布置在下表3中示出。

　　表3：用于初步实验的96-孔板中的样品放置

　　

　　此实验的结果表明可以降低蛋白质和信号多核苷酸浓度。信号多核苷酸的起始浓度从200μM减少至100μM。还研究了包含脱脂乳(稀释在PBS中的0.1mg/mL和0.01mg/mL)的混合蛋白质溶液。还添加包含用和蛋清相同的方法(如上所述)稀释的蛋黄的额外对照。制备蛋清和蛋黄的额外混合物(1:2、1:20和1:20,000)。有利的是在混合信号多核苷酸与蛋白质溶液2分钟内获得荧光读数。信号多核苷酸+BSA对照样品重复3次，以确保呈现稳定对照。如果各种浓度的信号多核苷酸正被研究，可以同时评估对应浓度的信号多核苷酸+BSA对照样品。有利的是读出整板的样品以确保荧光信号的稳定性。

　　实施例5：信号多核苷酸概念验证实验

　　基于实施例4中描述的初步实验开发的通用方案描述如下。

　　通用方案

　　将蛋白质样品在PBS中稀释至指定浓度。将信号多核苷酸溶液在pH7.5的10mMTRIS-HCl中制备成200μM，加热至99℃3分钟并且然后冷却至室温20分钟。将60μL体积的蛋白质溶液添加至96-孔板的孔。在添加蛋白质样品之后尽快将信号多核苷酸添加至孔。荧光读数立即取得，所有读数25℃下用495nm激发波长获得并且在519nm的荧光峰处监控发射。由TriLink Biotechnologies(San Diego CA)合成信号多核苷酸，纯溶菌酶得自Pierce(Thermoscientific)并且BSA得自Sigma Aldrich。

　　由信号多核苷酸SPN-E*和SPN-E检测溶菌酶

　　执行测定以获得剂量曲线(每样品检测12μM的信号多核苷酸SPN-E)。结果示出在图8中，并且表明SPN-E检测0.6ng/mL至1200ng/mL的溶菌酶浓度范围(转换成每样品小于50pg溶菌酶)。

　　绘在图9A中的数据表明，100μM浓度的SPN-E*检测5ng/mL浓度的溶菌酶，并且增加检测水平至3pg/样品。绘在图9B中的数据表明，SPN-E可用于检测1:20稀释(样品大小为30μL)的未加工蛋清中的溶菌酶。BSA作为阴性对照蛋白质时，SPN-E给出最小信号。

　　绘在图10中的数据表明，当此蛋白质与牛奶或者BSA混合时，由100μM的SPN-E*检测混合蛋白质溶液中的溶菌酶不显著改变。

　　绘在图11A中的数据表明，SPN-E*可用于检测蛋清的微小水平，不管与蛋清混合的蛋白质。100μM的SPN-E*可以检测1:20000稀释的蛋清(样品大小30μL)。蛋清与蛋黄或者牛奶混合没有显著地降低SPN-E*检测蛋清存在的能力。绘在图11B中的数据表明SPN-E也检测蛋清，不管与蛋清混合的蛋白质。降低浓度的SPN-E仍可以检测1:20稀释的蛋清(未示出-样品大小30μL)。当蛋清与对照蛋白质BSA混合时，检测并未显著地降低。

　　在设计来评估特异性结合的另一实验中，用包含SPN-E的短反义链的对照信号多核苷酸处理溶菌酶和蛋清。如图12中表明，当用蛋白质样品处理对照信号多核苷酸时，未检测到信号。

　　由信号多核苷酸SPN-A*检测花生过敏原Ara h1

　　在此实验中，测试SPN-A*检测花生酱(减脂SkippyTM)中的花生过敏原Ara h1的能力。花生酱含有烘干花生以及其它成分。在牙签上获得大概1mg的花生酱，并且稀释在1mLPBS中。不涉及加热或离心步骤。图13A和图13B中示出的数据表明，SPN-A*检测0.1μg/mL至1mg/mL浓度范围的花生酱中的Ara h1过敏原。

　　SPN-A和SPN-E的荧光信号的稳定性

　　测定SPN-A和SPN-E的荧光信号的稳定性。如图14A所示，SPN-A的荧光信号在与蛋白质样品混合后约20分钟的时期之后减少约30％。信号保持相对稳定至少三个小时。图14B中示出的是SPN-E的类似的图，其中观察到在与蛋白质样品混合之后，SPN-E的荧光信号减少约12％。信号保持稳定至少2小时。

　　信号多核苷酸与ELISA相比的优点

　　信号多核苷酸可用于宽范围的浓度，并且已经示出在低至6μM和高达100μM的浓度下有效地结合。检测时间是瞬时的，并且检测信号至少2小时是稳定的。溶菌酶信号多核苷酸中的一种示出在低至0.6ng/mL浓度下检测溶菌酶。

　　信号多核苷酸能够检测在10mM Tris-HCl缓冲剂中以及在PBS中的溶菌酶。

　　两个类型的信号多核苷酸(茎-环结构以及具有退火的接头序列的单链结构)能够检测食品基质中的蛋白质。被设计来检测溶菌酶的信号多核苷酸(SPN-E和SPN-E*)能够检测蛋清、混合蛋清与蛋黄、与脱脂乳混合的蛋清和与BSA混合的蛋清。

　　被设计来检测Ara h1的信号多核苷酸被证明能够检测花生酱中的此过敏原。

　　所有实验在室温下执行，从而表明信号多核苷酸在室温下是稳定的。

　　表4表明来源于如上所述实验的一系列参数，其表明使用信号多核苷酸用于检测分子靶与目前更广泛使用的ELISA技术相比的优点。这些参数表明基于信号多核苷酸的检测测定具有明确的优点，并且可以替代ELISA技术。

　　表4：基于信号多核苷酸的检测方法与ELISA的比较

　　实施例6：用于过敏原检测和诊断装置的其它适体

　　其它适体序列用于目前公开的装置和方法。例如，已经描述针对免疫球蛋白E(IgE)以及羽扇豆和醇溶蛋白蛋白质过敏原的适体；示例性序列示出如下。

　　针对Lup an 1(β-羽扇豆球蛋白)的11-mer SGQ适体具有核苷酸序列：5′GGTGGGGGTGG3′(SEQ ID NO:8)。(参见Nadal等人2013,Anal.Bioanal.Chem.405:9343–9349，全文以引用方式并入本文)。

　　能够识别并且特异性结合至醇溶蛋白的单链DNA适体具有核苷酸序列：

　　5′AAACTACTAACTAGGTAAGATCACGCAGCACTAAACGACGTAGTTGCCA 3′(SEQ ID NO:9)(Pinto等人，2014，Label-free detection of gliadin food allergen mediated byreal-time apta-PCR.Anal.Bioanal.Chem.406(2):515-24；全文以引用方式并入本文)。

　　适体还被设计来靶向免疫球蛋白E(IgE)(与特应性过敏疾病有关的已知生物标记物)。在用于检测人类血清中的免疫球蛋白E(IgE)的基于适体与基于抗体的石英晶体微量天平(QCM)生物传感器的性能的比较中，并且可以在基于适体的生物传感器中观察到更低的检测限。抗IgE适体(D17.4)的碱基序列鉴定为5′GGGGCACGTTTAT-CCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC 3′(SEQ ID NO:11)(Yao等人，Development of a QuartzCrystal Microbalance Biosensor with Aptamers as Bio-recognitionElement.Sensors 2010,10:5859-5871；全文以引用方式并入本文)。另一针对IgE的DNA适体被设计以具有以下序列：5′GCGCGGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCCGCGC 3′(SEQID NO:12)(Wang等人，Fluorescence protection assay:a novel homogeneous assayplatform toward development of aptamer sensors for protein detection.2011,Nucleic Acids Research,39(18)e122)。

　　实施例7：消解缓冲剂的最佳化

　　创造SPN过敏原检测平台的第一步是优化和统一蛋白质提取过程，其具有允许检测任何食品基质中的过敏原的快速、精确并且通用的方案。各种提取缓冲剂方案将包括还原和封闭剂、去污剂和表面活性剂。

　　测试并且优化适用于通用取样的化学品(列在表5中)，并且可以用于此目的的缓冲剂列在表6中。

　　表5：用于蛋白质提取缓冲剂的化学品和说明

　　

　　

　　表6：蛋白质提取缓冲剂

　　

　　通过每一个过敏原蛋白质测试至少三种不同ELISA测定，执行了这些测试的缓冲剂与目前食品过敏原领域中使用的主要用于ELISA测试的已知提取缓冲剂的比较。最佳提取缓冲剂可以通过已建立的过程选择，所述已建立的过程将测试和比较已知在ELISA测定的优化中待测试的至多20种不同食品基质(烘烤商品、香肠、汤、冰淇淋等等。表7)以及更挑战性的食品基质(沙拉调料、豆酱和巧克力)。基质的均匀性将通过使用轻柔MAC分离器上的蛋白质提取程序来建立。

　　作为选择过程的实例，约0.5mg食品样品与已知量过敏原在加工(烘烤、煮、油炸等)之前和之后掺合。测试并且记录总蛋白提取以及特异性过敏原回收，以比较不同提取缓冲剂的效率。读数将为总蛋白提取和特异性过敏原的相对回收率(掺合量的％)。交付物将为比较在3种不同缓冲剂中处理之前和之后与3种来自商业ELISA测定的不同提取缓冲剂比较的蛋白质、特异性过敏原回收率(诸如鸡蛋、小麦、花生、鱼、甲壳动物、牛奶、腰果、大豆)的表格。

　　一旦已经选择最佳缓冲剂，通过加速均质化过程来减少提取时间。这可以通过改变叶片位置和大小、增加掺混的RPM和减少缓冲剂与样品的比例来实现。另外，通过过滤均质化的溶液穿过低蛋白结合过滤器(诸如市售PES聚醚砜、PCTE(聚碳酸酯)或聚偏氟乙烯(PVDF))来消除碎片颗粒以及较大蛋白质络合物。

　　表7：食品基质的实例

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　来自列出的食品基质的总蛋白将使用不同的提取缓冲剂提取，并且总蛋白回收率将使用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific Pierce)测试，并且不同提取缓冲剂中的特异性过敏原回收率将由ELISA测定试剂盒(Elution Technologies Neogen andBioCheck)测试并且与SPN结合(GloMax Detection System)比较。

　　实施例8：建立和优化装置取样机构

　　建立测试和优化过程以实现此目的：成为来自高脂肪和高度处理的食品的蛋白质提取，并且将蛋白质提取时间减少至低于一分钟。

　　一些含有高脂肪、酸或食品色素的食品基质对于蛋白质提取将是挑战性的；然而，引入一些化学品以使得减少与提取缓冲剂的非特异性结合(明胶、BSA或脱脂乳)，减小过滤器的孔径以除去大分子，增加去污剂浓度以克服脂肪含量，增加样品与缓冲剂比例，等等。处理时间的减少可以触发更多碎片和蛋白质复合物，所述碎片和蛋白质复合物可以阻塞过滤器并且干扰检测机构。消解过程然后通过增加搅拌器的rpm、增加/减少缓冲剂的pH以及增加过滤器的孔径来优化。这些改变将在时间考虑的背景下完成。

　　制作了一个表格，其比较在3种不同缓冲剂中处理之前和之后与来自商业ELISA测定的3种不同提取缓冲剂相比的总蛋白质、特异性过敏原回收率(所有8种过敏原)。表展示来自至少20种不同食品基质的平均回收率(参见表7)。基于比较，表测定具有最高总收率和特异性回收率用于进一步分析和优化的提取缓冲剂。

　　实施例9：检测8种食品过敏原的适体的选择和优化

　　为组合MB的信号传导能力和适体的蛋白质结合特异性，以产生将结合食品过敏原并且发送它们存在的信号的信号多聚核苷酸(SPN)，将使用如本申请中所述的SELEX来完成食品过敏原适体的体外筛选和选择。测试适体中的每一个的5种不同序列的解离常数。这5种序列将被特异性过敏原蛋白质的正选择和对其它7种过敏原蛋白质的负选择二者来挑选。我们将用于选择的蛋白质将包括折叠的和变性的蛋白质。将进一步分析10轮选择后留下的序列，以测定Kd亲和力、信号背景比、LOD、靶向和EC50/IC50。具有低纳摩尔范围(<300nM)内的Kd的前5种序列将被挑选用于进一步分析。将优选地通过ForteBio评估Kd，但如果合适的话，其它方式包括Dot Blot、凝胶迁移测定或流式细胞术也可被测试。Kd越低，结合亲和力越高，这将增加灵敏度。

　　SELEX选择过程在购自ELISA测定厂商并且由AOAC批准以充当特异性抗原的标准的粗蛋白样品上完成。蛋白质是纯过敏原蛋白质、处理过的过敏原蛋白质和变性过敏原蛋白质的混合物。这将能够选择将结合呈其所有不同形式的蛋白质的适体。适体将经历任何其它7种过敏原的负选择以增加选择性。

　　一旦选择主要的8种食品过敏原中的每一个的特异性抗体序列，适体的序列将整合入MB结构中。适体序列被设计为MB的环序列，并且结果将为SPN分子。在存在蛋白质的情况下，SPN中将有取决于蛋白质浓度的荧光信号变化。

　　为评估和优化不同SPN的结合灵敏度和特异性，将在不同食品基质(参见表7)上测试它们的结合亲和力，并且与ELISA试剂盒测试比较。改变缓冲剂中的MgCl2:KCl比并且优化选择的适体的结合亲和力和选择性。存在MgCl2的情况下的Tm更高，推动茎-环结构，而添加NaCl或KCl推动活性SPN蛋白质结合。还测试非操纵适体并且与选择后的操纵的适体比较。如果结合亲和力减小，两侧的序列长度被改变，增加双螺旋的化学修饰或错配以增加/降低非结合结构。如果这些修饰是不成功的，从选择的序列挑选不同的序列来操纵。

　　通过这种方法，选择所有8种过敏原的所有序列(例如，小麦、鸡蛋、牛奶、花生、树坚果、鱼、贝类和大豆)，并且前5种序列将基于它们的Kd值来分级，所述5种序列作为8种过敏原中的每一种的SPN而操纵。这些序列将具有未显著高于非操纵的序列的结合亲和力。

　　实施例10：建立和优化装置取样机构

　　进一步优化取样机构以确保可靠和可重现的食品取样，不同食品基质之间具有高准确性。

　　取样过程

　　食品样品的分析由将样品收集探针插入目标样品开始。在样品收集期间，留在针中的研磨机钻头由发动机旋转，从而造成其充当螺旋泵(也称为阿基米德式螺旋抽水泵)。研磨机钻头的“切屑清除”作用起到捕获靶样品的碎片并且将它们从收集针输送至混合腔室的中间的作用。优化所述机构以每轮取样特定量的食品。通过大范围的食品质地测试去核能力并且优化。

　　消解和蛋白质提取

　　一旦收集靶样品的碎片并且递送至混合腔室，下压注射泵柱塞。这强迫消解缓冲剂进入混合腔室中。这强迫消解缓冲剂通过单向阀1422并且进入混合腔室。定向单向阀1424以防止倒流到检测腔室中；所述检测腔室的功能将在步骤3中描述。一旦消解缓冲剂递送至混合腔室，发动机按照预定时间和速度规程旋转混合主轴，以适当地使样品均质化，使所关心的组成蛋白质释放。驱动发动机附接在发动机附接点，并且所述发动机与第一步骤期间旋转研磨机钻头螺旋泵的发动机相同。

　　优化掺合单元的RPM、扭矩以及叶片放置以确保不同食品质地的完全均质化。将改变提取缓冲剂和食品样品之间的比值，从而在不稀释食品样品的条件下提取高水平的蛋白质。

　　过滤

　　在样品消解并且均匀质后，通过拉先前下压的注射泵柱塞来使样品通过纯化过滤器进入检测腔室。然而，这次单向阀1424起到阻止材料向后离开混合腔室的作用，并且单向阀1422打开以提供跨纯化过滤器的负压力，从而将样品吸入检测腔室中。疏水过滤器被放置在检测腔室的出口以允许任何干扰气体通过同时防止感兴趣的样品逸出。一旦样品处于检测腔室中，分析单元能够执行样品的探询，并且报告测量结果给用户。

　　过滤单元能够不仅消除碎片，而且浓缩过敏原蛋白质。大多数食品过敏原小于70KDa。使用100KDa阈值的膜，我们将显著地浓缩样品中的过敏原蛋白质，可是将需要巨大压力(100psi)。将测试具有不同孔径(0.2、0.1、0.03和0.01um)的过滤器并且与反渗透膜比较。

　　具有策略地放置的过滤器和单向阀的循环回路的独特构造意味着注射泵柱塞可以通过若干循环拉出或下压以确保足够的样品材料被递送至检测腔室。还意味着除混合发动机外，样品运输仅需要1个额外的精密步进器/控制电机。否则将需要一个发动机以递送消解缓冲剂并且需要另一个发动机以将样品吸入检测腔室。这样的好处是显著的，因为各额外发动机将增加总装置的大小、重量、成本和功率消耗。

　　一旦在第一步骤中收集了样品，所有随后的步骤被设计以在分析单元的控制下自动操作，以使得不需要进一步用户交互。

　　通过这些优化，建立了食品取样机构，所述食品取样机构为单步骤、测量的并且可再生的机构。蛋白质提取不超过1分钟。

　　实施例11：信号多聚核苷酸的设计

　　使用以下方法用于工程化信号多核苷酸。

　　首先选择多核苷酸用于设计。然后使用mFOLD软件(Michael Zuker&NickMarkham,Rensselaer Polytechnic Institute,由The RNA Institute、College ofArts and Sciences、State University of New York at Albany主持，并且由SUNYAlbany Research IT Group支持)执行选择的多核苷酸的3维折叠。

　　然后将4与18之间或4-12之间的核苷酸序列添加至经历过初始折叠分析的多核苷酸的3’。此添加的核苷酸序列代表与初始多聚核苷酸的5’端的序列反向互补的序列的部分或整体。

　　然后通过m-FOLD分析包含第一多聚核苷酸和添加的多聚核苷酸的所得信号多聚核苷酸的3维结构。基于mFOLD分析(可以包括热动力学参数和结构参数的选择)，挑选所选择的候选对象。在一些实施方案中，挑选用于进一步测试的完整多聚核苷酸序列为将5’-端和3’端彼此附接以形成闭合茎-环结构并且具有最低ΔG的多聚核苷酸序列。

　　实施例12：使用不同提取缓冲剂的蛋白质提取和过敏原回收的测试

　　如实施例7中所提议，测试具有不同化学组分的不同消解/提取缓冲剂并且比较，以发现用于过敏原检测的专有提取缓冲剂。此通用提取缓冲剂能够使蛋白质提取和过敏原回收最大化。通用提取缓冲剂将适用于任何过敏原和任何食品(例如预处理的或后处理的)。另外，通用提取缓冲剂可以改善信号多核苷酸(SPN)结合亲和力，最小化非特异性结合并且增加信噪比。

　　设计系列实验以比较不同提取缓冲剂的总蛋白提取和特异性过敏原回收率。测试基于Tris的缓冲剂、基于PBS的缓冲剂和Neogen ELISA提取缓冲剂并且彼此比较。实验中使用的缓冲剂列于表8中。对基于Tris和基于PBS的缓冲剂执行不同修饰以优化缓冲条件以实现最大的蛋白质回收率和SPN检测容量。

　　表8：测试并且比较总蛋白和过敏原回收率的不同缓冲剂

　　

　　实验设立：将不同浓度的过敏原(例如谷蛋白)掺混至预烘烤或后烘烤蛋糕中。常规面包、无谷蛋白(GF)面包和无谷蛋白蛋糕也用作食品来源，以用不同测试提取缓冲剂测试过敏原回收率。将不同提取缓冲剂添加至食品样品，(缓冲剂的配方如上表中所述)。从1：20(0.5g样品和10ml缓冲剂)、1:10(0.5gr样品和5ml缓冲剂)、1:5(0.5gr样品和2.5缓冲剂)开始测试不同的样品缓冲剂比。我们还尝试增加样品大小和保持缓冲剂稳定在2.5ml。食品样品为2.5ml缓冲剂中0.5、1、1.5、2和2.5gr。使用轻柔MAC或手持均质器使具有缓冲剂的食品样品均质化。将均质化的溶液放在室温下15分钟以使沉淀物沉降或以5000rpm离心5分钟。收集顶部水溶液并且传递至新的管中用于进一步分析。使用BCA Pierce试剂盒或通过测试总氮(试纸)测试总蛋白质提取。使用市售ELISA试剂盒测试特异性过敏原回收率。对于鸡蛋和花生样品，还测试特异性SPN。

　　如图15所示，比较表明在基于PBS的缓冲剂中，添加β羟基乙醇并不增加总蛋白提取，但添加10％EtOH增加总蛋白提取。

　　具有不同pH值的基于Tris的缓冲剂和添加剂与Neogen谷蛋白提取缓冲剂比较。结果示出，pH8.0的Tris缓冲剂、5mM EDTA和20％EtOH(在图16中称为DOTS缓冲剂)与Neogen谷蛋白提取缓冲剂相比导致更佳的谷蛋白回收率。此外，对于Tris缓冲剂(pH8.0、5mM EDTA和20％EtOH，称为DOTS缓冲剂)，来自后烘烤的谷蛋白回收增加200％，但用Neogen缓冲剂无回收(图16)。比较还表明，回收自用任一缓冲剂1:50稀释后的预烘烤食品的谷蛋白太稀而不能检测。还示出，100mM pH8.0的Tris缓冲剂比pH7.4和添加EDTA(5mM)和10％EtOH的改善了总蛋白提取。

　　为进一步优化提取缓冲剂，进一步用不同盐和添加剂(如表5中所列出)来修饰基于Tris的缓冲剂。各修饰的pH8.0的基于Tris的缓冲剂中的组分标明在表9中。

　　表9：修饰的基于Tris的缓冲剂

　　

　　图17示出使用缓冲剂A至F的谷蛋白回收率。然后进一步修饰缓冲剂A以降低明胶的浓度至0.5％。此降低可以允许更容易的过滤。修饰的缓冲剂称为缓冲剂A+。在测试中，用40μg/100μl谷蛋白掺混预烘烤和后烘烤的蛋糕。用缓冲剂A+或Neogen提取缓冲剂提取烘烤商品，并且取决于样品，以1:10、1:100或1:1000的比例稀释提取样品，以处于用于检测的ELISA试剂盒的线性范围内。图18(A&B)示出仅缓冲剂A+可以回收约7-10％的掺混的谷蛋白。图5示出使用缓冲剂A+的牛奶过敏原的回收率百分比。预烘烤和后烘烤的掺混的牛奶过敏原的10％和100％分别使用缓冲剂A+回收。Neogen ELISA提取缓冲剂生成与缓冲剂A+类似的回收率百分比(图19)。

　　测试缓冲剂A+对其它常见的过敏原(诸如谷蛋白、甲壳动物、腰果、花生、大豆和牛奶)的提取能力并且与Neogen ELISA缓冲剂比较。结果示出在图20(A&B)中。

　　在另一组测试中，进一步用列于表5中的不同盐和添加剂修饰基于PBS的缓冲剂。修饰的基于PBS的缓冲剂称为P+缓冲剂或者P-缓冲剂，并且P+和P-缓冲剂中的组分列于表10中。

　　表10：基于PBS的缓冲剂：P+缓冲剂和P-缓冲剂

　　用P+缓冲剂和P-缓冲剂测试预烘烤和后烘烤商品中的过敏原回收率。图21A和图21B分别示出预烘烤商品和后烘烤商品中的过敏原回收率。

　　进一步修饰PBS缓冲剂以增加过敏原回收率百分比。修饰包括降低MgCl2的浓度和添加另一盐KCl。修饰的基于PBS的缓冲剂(称为K缓冲剂)的组分列于表11中。

　　表11：基于PBS的缓冲剂：K缓冲剂

　　

　　

　　测试结果表明K缓冲剂可以显著地增加过敏原回收率，并且适用于任何测试的过敏原和所有食品来源(例如预烘烤和后烘烤的)(参见表12)。

　　表12：K缓冲剂回收率

　　

　　

　　与Elution ELISA缓冲剂(Elution Technolgies Neogen和BioCheck)相比，K缓冲剂具有与洗脱缓冲剂(Elution buffer)可比的提取能力(图22A&B)。

　　考虑到在寡核苷酸结合实验中基于Tris的缓冲剂通常优选的事实，K缓冲剂中的PBS组分被替换为pH 8.0的Tris以生成T缓冲剂。T缓冲剂中的组分列于表13中。测试Tris碱对过敏原回收率以及SPN结合的影响。图23比较K缓冲剂、T缓冲剂和洗脱ELISA缓冲剂中的腰果过敏原回收率。

　　表13：基于Tris的缓冲剂：T缓冲剂

　　实施例13：使用不同提取缓冲剂测试SPN结合亲合力

　　在测试不同提取缓冲剂的过敏原回收率之后，测试对用不同缓冲剂回收的过敏原的信号多核苷酸(SPN)结合亲合力，并且比较以开发用于SPN介导的过敏原检测的通用提取缓冲剂。

　　使用溶菌酶SPN(MB4、MB5和MB6)执行一组结合测定。实验程序：如上所述使食品样品均质化(一般将2.5ml缓冲剂添加至0.5食品样品。使样品均质化并且离心。将25ul的样品添加至96平底孔板。重悬浮特异性SPN至100uM浓度，并且将25ul的SPN添加至板(最终浓度50uM)。样品立即用GloMax Promega平板读数器使用蓝色激光读数。(将检测定量为FITC的强度减去背景-单独缓冲剂和未掺混样品)。

　　信号多核苷酸的序列MB4、MB5和MB6如下示出：

　　MB4:5‘荧光素-

　　TGCAGCTAAGCAGGCGGCTCACAAAACCATTCGCATGCGGCTGCA-Dabcyl-3’(SEQ ID NO:13)

　　MB5:5‘荧光素-

　　TGCAGCTAAGCAGGCGGCTCACAAAACCATTCGCATGCGGCCTGCA-Dabcyl-3’(SEQ ID NO:14)

　　MB6:5‘荧光素-

　　TGCAGCTAAGCAGGCGGCTCACAAAACCATTCGCATGCGGCGCTGCA-Dabcyl-3’(SEQ ID NO:15)

　　图24和图25比较P+缓冲剂和P-缓冲剂对MB6对蛋清的结合亲合力的作用。P+缓冲剂和P-缓冲剂的类似结合曲线(图25)表明，尽管提取缓冲剂中明胶的存在对于蛋白质提取是非常关键的，明胶对于SPN的结合的作用不显著。如图10中所示，P+缓冲剂降低SPN对蛋清的结合亲合力。然而，结果表明K缓冲剂可以增加SPN对蛋清的结合亲合力(图26)。与T缓冲剂中SPN对纯蛋清的结合亲合力相比，K缓冲剂可以允许较低溶菌酶水平的检测(图27)。类似地，T缓冲剂允许检测掺混到巧克力蛋糕(图28)和含有鸡蛋的食品(诸如Twinkies)(图29)中的较低水平的溶菌酶。

　　还在K缓冲剂中测试Ara H1SPN(MB7和MB9)的结合亲合力。信号多核苷酸MB7和MB9被设计分别具有以下序列。

　　MB7:5’荧光素

　　-TCGCACATTCCGCTTCTACCGGGGGGGTCGAGCTGAGTGGATGCGAATCTGTGGGTGGGCCGTAAGTCCGTGTGTGCGAA TGTGCGA Dabcyl-3’(SEQ ID NO:16)

　　MB9:5’荧光素

　　-TCGCACATTCCGCTTCTACCGGGGGGGTCGAGCTGAGTGGATGCGAATCTGTGGGTGGGCCGTAAGTCCGTGTGTGCGAA AATGTGCGA Dabcyl-3’(SEQ ID NO:17)

　　MB7和MB9二者都可以特异性结合至花生过敏原，但不结合至蛋清和卵类粘蛋白(图30A&B为MB7并且图31A&B为MB9)。

　　还测试K缓冲剂对MB7和MB9对食品基质中的花生过敏原的结合亲合力的作用。将不同量的花生细粉掺混在预烘烤或者后烘烤的马克杯蛋糕基质中。使用K缓冲剂回收过敏原，并且提取的样品在SPN(即MB7或MB9)检测前稀释。图32(A&B)示出，当使用K缓冲剂作为提取缓冲剂时，MB7可以检测掺混到预烘烤和后烘烤的蛋糕中的低ppm水平。类似地，如图33(A&B)所示，当使用K缓冲剂作为提取缓冲剂时，MB9还可以检测掺混到预烘烤和后烘烤的蛋糕中的低ppm水平。与用ELISA测定检测的过敏原回收率相比，当使用K缓冲剂作为提取缓冲剂时，MB7和MB9二者显著地增加花生回收率(图34)。

　　还测试商业处理过的食品。结果表明，当使用K缓冲剂作为提取缓冲剂时，MB7和MB9可以检测处理处理过的食品(诸如卷饼和冰淇淋)中的稀释的花生过敏原(图35)。

　　还执行测试以比较K缓冲剂和T缓冲剂对MB9对纯花生蛋白质的结合亲合力的作用。如图36中所示，T缓冲剂可以允许较低AraH1水平的检测。

　　然后，我们在不同反应时间进一步测试SPN检测信号，并且发现0分时的即时检测信号并未显著地不同于30分的。图37A&B证明MB7和MB9的即时检测信号类似于在30分的那些。

　　实施例14：测试物理断裂对SPN结合亲合力的作用

　　然后，我们进一步地测试样品大小、用于制备蛋白质样品的方法和物理程序以及它们对过敏原回收率和对过敏原的SPN结合亲合力的影响。

　　实验程序

　　食品样品和大小：0.5g、1g、1.5g和2g的Twinkies香草(vanila)布丁和掺混牛肉用于这次测试。

　　分离器：低功率和高功率的不同分离器用于处理食品样品，诸如轻柔MAC、迷你MAC、连续分离器。轻柔MAC上的蛋白质程序用于制备蛋白质样品。

　　提取缓冲剂：如在实施例11和实施例12中讨论的T缓冲剂用于蛋白质提取和过敏原回收。

　　过滤：为了除去碎片、浓缩样品和富集特定大小蛋白质，在处理样品之后执行过滤程序。

　　测试结果

　　示出所有样品大小的牛奶过敏原回收率没有显著差别(图38A-C)。然而，较大样品大小中结合至溶菌酶的MB5减少了(图39)。

　　测试不同的分离器和蛋白质程序。结果表明不同的食品之间的高可变性。例如，当使用不同的分离器时，来自鸡肉、Twinkie和糖霜的牛奶过敏原回收率是不同的(图40A-C)。与其它分离器相比，轻柔MAC给出最高的对溶菌酶的MB5结合。然而，低功率连续分离器并未显著地不同于轻柔MAC(图41)。

　　实施例15：为8种食品过敏原选择和设计的信号多核苷酸

　　对于筛选、选择和工程化可以检测食品过敏原的基于适体的信号多聚核苷酸的一般实验设计描述在实施例9和实施例11中。按照这些选择和设计程序，进行基于SELEX方法的体外筛选实验，并且选择针对过敏原靶的适体，所述过敏原靶包括鸡蛋、谷蛋白、牛奶、大豆、鱼、花生、腰果和甲壳动物，超过相反靶(counter-target)(非靶蛋白质的组合)，并且进一步工程化它们的检测靶食品过敏原的能力。

　　实验过程

　　各种RNA库用于选择23℃下在选择缓冲剂中的结合能力，所述选择缓冲剂由100mMTris[pH 8]、5mM EDTA、150mM NaCl、10mM MgCl2、0.1％SDS、0.1％明胶、1％NP-40(Tergitol)、0.5％脱氧胆酸钠组成。给定轮的选择开始于在任一单独缓冲剂中孵育RNA库成员(负选择)，然后收集未响应(即裂开)的库的部分。各轮的第二部分(当需要时)由用非正靶(如相反靶)的完全组合来孵育来自先前负选择步骤的非响应分子组成，或者仅仅用选择缓冲剂再次用于第二负选择。再一次，收集非响应(非裂开)分子。各轮的最终步骤由用缓冲剂中的正靶(过敏原中的每一个，视情况而定)孵育来自先前步骤的材料，然后收集响应材料(即裂开RNA)组成。各选择轮之后为反转录生成cDNA、通过PCR进行库扩增和通过转录再生RNA库。在使不同随机序列的初始库经受变化的连续轮的选择(即负选择、反选择和正选择)之后，再次项目依赖地，并且富集的库被分成三个部分以执行平行评估。平行评估涉及同时暴露富集的库的三分之一至单独的选择缓冲剂，另一个三分之一暴露至选择缓冲剂中的相反靶复合物，并且富集的库的最终的三分之一暴露至缓冲剂中的靶过敏原。鉴定并且废弃不加区别地与靶过敏原和相反靶反应或者在不存在靶过敏原时仍生成响应的任何残余RNA分子，用于进一步分析。

　　富集的RNA库在平行评估之后经受PAGE凝胶评估。40皮摩尔的富集的库单独地暴露至选择缓冲剂中的负(仅缓冲剂)靶、相反靶或靶过敏原。在23℃下孵育5分钟之后，收集显示出正响应(即分裂)材料的库，乙醇沉淀、逆转录并且PCR扩增用于测序和生物信息学分析。

　　选择的适体

　　选择一组适体序列并且进一步设计为信号多核苷酸，用于检测8种不同食品过敏原，包括腰果、花生、鱼、牛奶、大豆、谷蛋白、鸡蛋和甲壳动物。选择6种不同信号多核苷酸用于分别检测腰果、花生、鱼、鸡蛋和谷蛋白；并且选择5种分别用于检测牛奶、大豆和甲壳动物。这些信号多核苷酸的序列列于表14中。除在表14中标记为SPN的适体(各信号多核苷酸的结合区)之外，包括引物对的原始序列也列为用于设计信号多核苷酸的起始序列(即核糖开关序列)，所述起始序列在表14中标记为Ribo-SPN。然后进一步在5’端和3’端中的一个或两个处修饰针对各食品过敏原的选择的适体，以优化结合亲合力。修饰的序列中的一些也包括在表14中，其标记为SPN-comp。意欲在5’端具有荧光素(例如FITC/FAM分子)和在3’端具有淬灭剂的修饰的序列为将如本文描述测试用于过敏原检测的信号多核苷酸。按照实施例10中描述的设计程序，还预测各设计的信号多核苷酸的3维结构。所有热力学数据参见表15。

　　表14：用于检测8种不同食品过敏原的信号多核苷酸

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　表15：各序列的热力学数据(ΔG)