一种游离DNA文库构建方法以及游离DNA中低频突变的检测方法
技术领域tt
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种游离DNA文库构建方法以及游离DNA中tt低频突变的检测方法。tt
背景技术tt
游离DNA(CellFreeDNA，简称cfDNA)是指外周血中游离的DNA，以裸露核酸的形tt式存在，主要来源于细胞凋亡过程中产生的片段化的DNA或者细胞被裂解(如物理性刺激引tt发的坏死或免疫细胞杀伤作用)后产生的DNA碎片，大小基本在160-180bp左右。tt
早在1947年Mandel等就在健康人的血清和血浆中发现了游离DNA，当时并未充分tt的引起人们的重视。1977年Leon等人发现肿瘤和血清中游离DNA含量存在一定关系，之后研tt究者在肿瘤患者的血浆和血清中检测到了癌基因突变，并且与原发肿瘤相一致。20世纪60tt年代，人们在系统性红斑狼疮的患者体内发现很高水平的cfDNA,从而引发医学界普遍重tt视。1997年Lo等报道了孕妇的外周血中存在胎儿的游离DNA，为无创产前诊断提供了新的可tt能。tt
目前，cfDNA检测已成为临床应用的热点，仅需简易的血液检测，cfDNA即能为许多tt应用领域如肿瘤筛查、移植、产前诊断等提供早期诊断依据。tt
然而，对于cfDNA来说，由于其拷贝不同，对不同拷贝的DNA而言，在原基因组DNA中tt特定的突变，可能出现在cfDNA的任何一个位置上，造成通常PCR扩增中可能出现的，由于设tt计的引物离cfDNA上设计位点较远导致的较难扩增的问题。此外，来自胎儿的cfDNA或者肿tt瘤的cfDNA含量较低，一般占总cfDNA的约0.01％～10％，此外，肿瘤的异质性较为严重。因tt此，如何有效的扩增cfDNA、检测来自cfDNA中的特异DNA就成为难点。tt
中国专利申请CN201410468186.3公开了一种游离DNA的扩增方法，通过如下步骤tt进行扩增：设计并合成两条寡核苷酸，寡核苷酸甲3’端为T碱基，从寡核苷酸3’端的第二个tt碱基与寡核苷酸乙5’端开始互补，将寡核苷酸乙5’端用磷酸根修饰，经退火反应得到接头ttDNA；将游离DNA末端补平后经加A反应，得到有A粘性末端的游离DNA；以接头DNA和有A粘性tt末端的游离DNA进行连接反应得到的产物为模板，利用寡核苷酸甲为引物进行PCR扩增。该tt方法能够保证检测的有效DNA模板量充足，并且保证基因组DNA分子的全长扩增。然而，采用tt该方法进行扩增，不仅对来自胎儿或肿瘤的特异cfDNA进行扩增，同时对于正常组织的ttcfDNA也进行扩增，不利于cfDNA低频突变的检测。tt
中国专利申请CN201510487759.1公开了一种血浆中游离目标DNA低频突变的富集tt测序方法，基于通用引物进行TT-COLDPCR对所有类型变异实现第一级突变富集扩增；设计tt富集探针芯片，针对热点变异将人基因组参考序列hg19设计的探针替换为基于突变碱基设tt计的探针，其它位点探针不变，进行第二级富集捕获；基于文库构建中的插入DNA两端12bptt自身序列作为标签进行正反双链纠错比对，实现低频精确检测，该方法可对0.01％低频变tt异具有高特异性检测。然而，该方法需要进行二级扩增，且检测方法复杂，成本较高。tt
发明内容tt
本发明的目的是提供一种简单、高效的游离DNA文库构建方法和游离DNA中低频突tt变的检测方法，能够很好的还原原始DNA的突变频率。tt
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：tt
本发明一方面提供一种游离DNA文库的构建方法，包括以下步骤：tt
(1)在单链游离DNA的3’端连接唯一序列标签，所述唯一序列标签由随机序列和接tt头序列组成；tt
(2)加入PCR扩增用上游引物和下游引物进行PCR扩增，所述上游引物为针对目标tt低频突变设计的引物，所述下游引物为与接头序列对应的引物。tt
在本发明一具体实施方式中，所述唯一序列标签为合成的单链，其中，所述随机序tt列由6～12个碱基随机组成且位于靠近单链游离DNA的3’端的一侧，所述接头序列为任意的tt已知序列且位于远离单链游离DNA的3’端的一侧。tt
在本发明一具体实施方式中，所述随机序列由8～10个碱基随机组成，优选的，所tt述随机序列由8个碱基随机组成。tt
在本发明实施方式中，所述接头序列可为任意的已知序列，其序列自身不形成发tt卡二级结构，且胞嘧啶和鸟嘌呤的含量占碱基数量总和的30％-70％。优选的，接头序列选tt择长度较短的核苷酸序列，例如可为10-50个碱基，优选为11-40个碱基，12-30个碱基，13-tt25个碱基，14-20个碱基，15-18个碱基，16-17个碱基。更优选的，所述接头序列可为M13序tt列。tt
在本发明一具体实施方式中，所述唯一序列标签的核苷酸序列如序列表SEQIDttNO：1所示GTAAAACGACGGCCAGTNNNNNNNN，其中NNNNNNNN为随机序列。tt
在本发明实施方式中，所述低频突变存在于：包括但不限于癌症如肺癌、胃癌、肝tt癌、乳腺癌、肾癌、直肠结肠癌、大肠癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、鼻咽癌、口腔tt癌、甲状腺癌、膀胱癌、食管癌、神经胶质瘤等相关基因，常见遗传性疾病如Rett综合症、青tt少年型假肥大型营养不良症、成人型假肥大型营养不良症、脊肌萎缩症、遗传性脊髓小脑性tt共济失调症、延髓脊髓型肌萎缩、神经元蜡样质脂褐质沉积病等相关基因，先天性疾病如唐tt氏综合症、爱德华氏综合症、帕陶氏综合征等相关基因。tt
在本发明实施方式中，肿瘤相关基因包括但不限于下列基因：tt
在本发明实施方式中，所述遗传性疾病相关基因包括但不限于下列基因：MeCP2、ttDMD、SMN、NCL3、CLN3、SCA1、SCA2、SCA3、SBMA、HD、DMPK、PLP1、eIFB5、eIFBB3、mLC1、KCNJ2、ttCx32、mLH1、MSH1、MMACHC等。tt
在本发明实施方式中，目标低频基因的核苷酸序列可根据NCBI的Genbank数据库tt进行查询，针对目标低频基因设计的引物可采用本领域常规手段进行引物设计，也可采用tt本领域已知引物；针对接头序列设计的引物可与接头序列反向互补。tt
在本发明一具体实施方式中，所述上游引物为针对EGFRL858R设计的引物，所述tt下游引物为针对M13设计的引物。具体的，所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：tt2所示5’-GCAGCATGTCAAGATCACAGATT-3’，所述下游引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：3tt所示5’-ACTGGCCGTCGTTTTAC-3’。tt
在本发明一具体实施方式中，所述上游引物和下游引物的一端可分别与测序标签tt连接，用于测序。tt
在本发明一具体实施方式中，所述步骤(1)具体包括如下步骤：对单链游离DNA的tt3’端进行DNA末端修复，通过T4DNA连接酶将唯一序列标签与末端修复后的单链游离DNA的tt3’端相连。tt
优选的，所述DNA末端修复所用的试剂包括：dNTP，T4DNA聚合酶，Klenow片段，T4tt多核苷酸激酶(T4PolynucleotideKinase，简称T4PNK)，10XPNK缓冲液。tt
本领域技术人员也可通过其它常规手段和试剂进行DNA末端修复。tt
在本发明一具体实施方式中，所述步骤(2)中PCR扩增为本领域常规PCR扩增反应，tt按照碱基互补配对原则，以一定的方向添加扩增所需的dNTPs，经过多次的DNA变性-退火-tt延伸过程，从而实现DNA的扩增。tt
在本发明一具体实施方式中，PCR扩增反应体系如下：tt
PCR反应程序为：tt
98℃30min；tt
98℃10s，65℃30s，72℃30s(12个循环)；tt
72℃5min。tt
在本发明一具体实施方式中，所述步骤(1)之前还包括样本提取和纯化步骤。其tt中，样本的提取可按照常规方法从外周血样本中提取，尤其可从孕妇的外周血样本中提取。tt具体的，可使用游离DNA提取试剂，对外周血中的游离DNA进行提取；使用吸附柱对提取的游tt离DNA进行纯化。游离DNA提取试剂可为市售常规试剂，其提取方法为本领域技术人员所公tt知，在此不作赘述。tt
本发明另一方面提供一种游离DNA中低频突变的检测方法，包括以下步骤：tt
(1)在单链游离DNA的3’端连接唯一序列标签，所述唯一序列标签由随机序列和接tt头序列组成；tt
(2)加入PCR扩增用上游引物和下游引物进行PCR扩增，所述上游引物为针对目标tt低频突变设计的引物，所述下游引物为与接头序列对应的引物，所述上游引物和下游引物tt的一端分别与测序标签连接；tt
(3)将扩增后的DNA上机测序。tt
在本发明具体实施方式中，所述步骤(1)和步骤(2)中的唯一序列标签、随机序列、tt接头序列、目标低频突变、上游引物、下游引物与本发明构建方法中相同，在此不作赘述。tt
在本发明具体实施方式中，所述测序标签选自由6-12个碱基随机组成的序列。其tt中，测序标签可为序列已知的通用接头，本发明中经扩增后的待测DNA的两端分别连接有测tt序标签，作为测序索引。tt
在本发明一具体实施方式中，所述步骤(3)采用边合成边测序的方法进行测序。测tt序平台可为IlluminaMiseq、IlluminaHiseq2000、IlluminaHiseq2500、IlluminattHiseq1500。Illumina测序采用可逆性末端边合成边测序反应，DNA片段两端加入序列已知tt的通用接头构建文库，将文库加载到测序芯片Flowcell上，文库两端的已知序列与ttFlowcell基底上的Oligo序列互补，每条文库片段都经过桥式PCR扩增形成一个簇，在碱基tt延伸过程中，每个循环反应只能延伸一个正确互补的碱基，根据四种不同的荧光信号确认tt碱基种类，保证最终的核酸序列质量，经过多个循环后，完整读取核酸序列。tt
在本发明实施方式中，所述步骤(3)还包括对读取的核酸序列进行数据分析。tt
本发明还一方面提供一种本发明游离DNA中低频突变的检测方法在制备疾病早期tt诊断试剂盒中的应用。tt
其中，所述疾病包括但不限于癌症如肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、直肠结肠癌、tt大肠癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、鼻咽癌、口腔癌、甲状腺癌、膀胱癌、食管癌、tt神经胶质瘤等，常见遗传性疾病如Rett综合症、青少年型假肥大型营养不良症、成人型假肥tt大型营养不良症、脊肌萎缩症、遗传性脊髓小脑性共济失调症、延髓脊髓型肌萎缩、神经元tt蜡样质脂褐质沉积病等，先天性疾病如唐氏综合症、爱德华氏综合症、帕陶氏综合征等。tt
本发明有益效果：tt
本发明通过对游离DNA分子加入唯一序列标签，唯一配对引物和统一引物进行定tt向扩增，实现对游离DNA中特异位点的扩增，通过高通量测序的方法，实现对特异位点基因tt型的识别，并定性定量的分析扩增的位点。本发明方法克服了传统方法由于扩增错误引入tt的问题，同时保留了突变频率，并克服了测序错误和扩增错误可能带来的样本的假阳性问tt题，能够简单、高效的实现对cfDNA低频突变的检测。此外，本发明还可通过对cfDNA的检测，tt达到对胎儿遗传或者肿瘤细胞突变检测的目的。tt
附图说明tt
图1本发明cfDNA中低频突变的检测方法示意图tt
具体实施方式tt
如未特别指明，本发明中所使用的术语均具有本领域通常含义，所使用的化学试tt剂均为常规市售试剂，在本发明内容中，以下术语具有如下详述的含义。tt
本发明中术语“游离DNA”(CellFreeDNA，简称cfDNA)是指外周血中游离的DNA，tt以裸露核酸的形式存在，主要来源于细胞凋亡过程中产生的片段化的DNA或者细胞被裂解tt(如物理性刺激引发的坏死或免疫细胞杀伤作用)后产生的DNA碎片，大小基本在160-180bptt左右。tt
本发明中术语“dNTP”为脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxy-ribonucleosidettTriphosphate)的缩写，包括dATP，dGTP，dTTP，dCTP，dUTP等，其中N指含氮碱基，代表变量指tt代A、T、G、C、U等中的一种。tt
本发明中术语“T4DNA聚合酶”为一种模板依赖的DNA聚合酶，可在结合有引物的tt单链DNA模板上，从5’→3’方向催化DNA合成反应，其具有3'→5'外切酶活性，但不具有5'→tt3'外切酶活性。T4DNA聚合酶通常可用于催化DNA5’或3’突出末端的平滑化、通过置换反tt应进行标记DNA探针合成或定点突变过程中第二链的合成。tt
本发明中术语“Klenow片段”属于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，Klenow片段是完整的DNAtt聚合酶Ⅰ的一个片段，只有在5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，其可用于填补DNA单tt链末端成为双链。tt
本发明中术语“T4DNA连接酶”可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和tt3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合也可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单链tt缺刻(Single-strandNicks)。tt
本发明中术语“T4多核苷酸激酶”即T4PolynucleotideKinase，简称T4PNK，是tt一种多聚核苷酸5’羟基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷tt酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移。通常，当缺失ATP并且存在ADP的情况下，T4ttPNK可以显示出5'磷酸酯酶的活性，催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团tt的单核苷酸的5'磷酸基团向ADP的转移形成ATP。当ATP和ADP都适量存在时，T4PNK可以催tt化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团和ATP的γ位tt磷酸基团之间的交换反应。T4PNK可用于寡核苷酸、DNA或RNA的5’末端标记，凝胶电泳的ttMarker，DNA测序引物，PCR引物等；也可使寡核苷酸、DNA或RNA的5’端磷酸化，确保后续连接tt反应顺利进行；此外，还可催化3’磷酸化的单核苷酸的5’磷酸化，使该单核苷酸可以和DNAtt或RNA的3’末端连接；去除3’端磷酸基团。tt
在本发明一具体实施方式中，本发明提供一种游离DNA文库的构建方法，包括以下tt步骤：tt
(1)在单链游离DNA的3’端连接唯一序列标签，所述唯一序列标签由随机序列和接tt头序列组成；tt
(2)加入PCR扩增用上游引物和下游引物进行PCR扩增，所述上游引物为针对目标tt低频突变设计的引物，所述下游引物为与接头序列对应的引物。tt
在本发明一具体实施方式中，唯一序列标签为合成的单链，其中，随机序列由6～tt12个碱基随机组成且位于靠近单链游离DNA的3’端的一侧，接头序列为任意的已知序列且tt位于远离单链游离DNA的3’端的一侧。tt
在本发明一具体实施方式中，本发明还提供一种游离DNA中低频突变的检测方法，tt包括以下步骤：tt
(1)在单链游离DNA的3’端连接唯一序列标签，所述唯一序列标签由随机序列和接tt头序列组成；tt
(2)加入PCR扩增用上游引物和下游引物进行PCR扩增，所述上游引物为针对目标tt低频突变设计的引物，所述下游引物为与接头序列对应的引物，所述上游引物和下游引物tt的一端分别与测序标签连接；tt
(3)将扩增后的DNA上机测序。tt
游离DNA由于其拷贝不同，对不同拷贝的DNA而言，在原基因组DNA中特定的突变，tt可能出现在cfDNA的任何一个位置上，本发明在游离DNA的3’端连接由随机序列和接头序列tt组成的唯一标签序列，并加入唯一配对引物和统一引物定向扩增，实现对游离DNA中特异位tt点的扩增，检测示意图参见附图1。tt
在本发明一具体实施方式中，本发明还提供一种本发明检测游离DNA中低频突变tt的方法在制备疾病早期诊断试剂盒中的应用。tt
下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整tt地描述，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的tt实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都tt属于本发明保护的范围。tt
实施例1血浆中cfDNA低频突变的检测方法tt
1、样本提取tt
使用游离DNA提取试剂，对受检者血浆中游离DNA进行提取。主要步骤如下：将全血tt样本暂存于4℃冰葙中，开启高速冷冻离心机开关，将采血管放在4℃条件下1600g离心10分tt钟，去除残余细胞，再于4℃条件下16000g离心10分钟，去除残余细胞，并将上清转移至新的tt2mL离心管中。tt
在2mL离心管中加蛋白酶K600μL充分溶解并混匀的血浆，漩涡振荡器混匀10s，短tt暂离心。tt
加入600μL已混匀缓冲液GBmix，短暂离心；于56℃水浴10分钟；取出离心管，室温tt冷却5分钟，短暂离心；加入300μL冰冻无水乙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置5分钟，短暂离心；tt吸取730～750μL到吸附柱中，8000rmp离心30秒，弃废液，将管子晾干后，加入500μL缓冲液ttGD，8000rmp离心30秒，弃废液；加入500μL溶液漂洗液PW，8000rmp离心30秒，弃废液。tt12000rmp离心2分钟，将吸附柱转移到干净的1.5mL离心管上，室温晾干3分钟至乙醇挥发；tt在吸附柱中间位置加90μL洗脱缓冲液TB，室温溶解5分钟，12000rmp离心2分钟，丢弃吸附tt柱，离心管内为DNA溶液。tt
分别采用上述方法，获得10份DNA。tt
2、末端修复和唯一序列标签连接tt
将样本提取步骤中所得的10份DNA依次编号S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8，S9，S10，tt并分成2组，每组5份DNA样本，使用末端修复试剂盒进行DNA末端的修复。tt
末端修复：tt
充分混合，20℃温浴30分钟。tt
然后对末端修复后的产物进行纯化，溶解体积45μL。tt
纯化完后对每组样本分别以下表1所示的唯一序列标签，进行连接。tt
表1tt
其中NNNNNNNN为随机碱基。tt
连接体系：tt
充分混匀，20℃温浴15分钟。tt
取出后短暂离心，用磁珠对产物进行纯化，取150μL的磁珠进行产物纯化，回收的ttDNA溶于34.2μL体积洗提液中。由此，获得各连接唯一序列标签的核酸样本。tt
记录样本S1-S10对应的样本编号信息和唯一序列标签信息。tt
3、PCR扩增tt
预先从-20℃保存的试剂盘取出dNTPSolutionSet(10mM)、MgSO4(50mM)，PCR引tt物对(10pmol/μL)，其中上游引物为根据目标低频突变设计的引物(本实施例以EGFR基因21tt外显子L858R突变为例)；下游引物为与表1所示的接头(即接头：M13(-20))对应的PCR扩增tt引物。tt
本实施例中用于PCR扩增的引物对参见下表2：tt
表2tt
将上述试剂置于离心管架上室温溶解，充分混匀后短暂离心；在1.5mL的离心管中tt配制反应mix，促匀后短暂离心，分装；mix分装好后，混合后短暂离心。tt
PCR反应体系参见下表3：tt
表3tt
PCR反应程序为：tt
98℃30min；tt
98℃10s，65℃30s，72℃30s(12个循环)；tt
72℃5min；tt
16℃∞。tt
反应完成后，用磁珠法进行纯化，溶入50μL。tt
由此，获得各样本PCR扩增产物。tt
其中，本实施例中，上游引物和下游引物的一端分别与测序标签连接，测序标签选tt自由6-12个碱基随机组成的序列，可为本领域已知序列的通用接头。tt
4、Miseq测序tt
分别取10pmolPCR扩增后的DNA用IlluminaMiseqPE-150程序测序，具体操作流tt程详见Miseq操作说明书。tt
测序流程包括：文库杂交、桥式扩增、线性化、末端封闭、引物杂交。tt
文库杂交：通过测序仪把变性后的文库引入Flowcell，单链DNA片段随机地与分tt布在FC通道内壁上的接头杂交；接头随即被延伸，合成互补链，互补链与FC的内表面之间通tt过共价键结合，被固定到FC上的一定位置，而原来的模板单链则在NaOH碱变性后被冲去。tt
桥式扩增：固定在FC上的DNA单链(原文库的互补链)的另一端与FC内壁的另一种tt接头因为碱基序列互补而发生分子杂交，形成桥状结构，在DNA聚合酶的作用下，合成其互tt补链。这一双链的DNA“分子桥”在NaOH的作用下碱变性，形成2条单链，再次与其他互补接头tt杂交形成2个新的“分子桥”，从而再次被扩增。这一过程重复20次左右，称为桥式PCRtt(bridgePCR)。最终，每条单链模板都被克隆成1000-6000条序列相同的单链，而且集中在tt一起，形成一簇(cluster)。通过桥式PCR，每平方毫米面积的FC内壁上，包括顶层和底层，都tt随机分布着上百万个cluster。tt
线性化：桥式PCR形成的cluster包含有等量的正义链和反义链，测序时，每个ttcluster的每个循环都存在两种颜色的荧光，在测序时，去除其中一个方向的全部单链，只tt保留一种序列。tt
末端封闭：为了确保测序时只有测序引物被延伸，在测序引物杂交之前，在DNA片tt段的游离末端增加一个ddNTP实现末端封闭。tt
引物杂交：把测序引物灌注进FC的所有通道里，测序引物杂交到每个cluster里每tt条DNA片段的结合位点上，进行测序。tt
5、结果分析：tt
IlluminaMiseq产出的测序结果是一系列DNA序列，通过测序标签、样本的标签可tt将这些测序序列对应到每份样本，同一个样本的序列按照产前诊断的流程进行分析，最终tt给出报告，经检测，阳性样本中EGFRL858R位点均检出，并与ddPCR获得的结果相符。tt
