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壳聚糖亲和七肽及其筛选方法和应用

2021-03-19 11:20:08

壳聚糖亲和七肽及其筛选方法和应用

　　技术领域

　　本发明属于纳米生物材料领域，更具体地讲，涉及壳聚糖亲和七肽及其应用。

　　背景技术

　　壳聚糖(chitosan)是自然界中含量仅次于纤维素的第二大天然有机高分子化合物，是唯一大量存在的碱性多糖，具有良好的生物相容性、可降解性、高电荷密度和抗菌性，从而具有独特的理化性质和生物功能，通常是甲壳素(chitin)脱乙酰化来获得。壳聚糖在生物医药领域应用广泛，而大多数生物分子与壳聚糖作用的方式是依靠非特异性相互作用，如果能够有一种方法能控制壳聚糖的特性，例如辅助壳聚糖制成纳米颗粒，提高壳聚糖与其他生物分子的识别性和特异性，这将大大提高壳聚糖的功能。

　　目前，噬菌体展示技术已被用于筛选各种无机材料和纳米结构的亲和性多肽，通过噬菌体展示肽库筛选得到的多肽可以对材料进行功能化，控制材料的形貌，以此提高材料的性能。但是，由于壳聚糖材料的柔性和多孔等特点，通过噬菌体展示肽库的筛选来获得壳聚糖亲和多肽的方法及亲和多肽都没有报道。

　　发明内容

　　本发明的第一个目的在于提供壳聚糖亲和七肽。

　　本发明的第二个目的在于提供壳聚糖亲和七肽的筛选方法。

　　本发明的第三个目的在于提供壳聚糖亲和七肽的应用。

　　为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：壳聚糖亲和七肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6任一所示。

　　为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：壳聚糖亲和七肽的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以离子凝胶化方法制备包裹壳聚糖的纳米颗粒，之后将其与噬菌体展示肽库混合，通过离心分离对肽库进行筛选，最后对筛选得到的噬菌体克隆进行ELISA鉴定及序列分析。

　　为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：壳聚糖亲和七肽在壳聚糖表面进行修饰和功能化中的应用。

　　壳聚糖亲和七肽在制备壳聚糖亲和材料中的应用。

　　SEQ ID NO.1：GQSEKHL(Gly Gln Ser Glu Lys His Leu)；SEQ ID NO.2：VSRDTPQ(Val Ser Arg Asp Thr Pro Gln)；SEQ ID NO.3：TVNFKLY(Thr Val Asn Phe Lys LeuTyr)；SEQ ID NO.4：HGGVRLY(His Gly Gly Val Arg Leu Tyr)；SEQ ID NO.5：ADRFQAL(AlaAsp Arg Phe Gln Ala Leu)；SEQ ID NO.6：HYIDFRW(His Tyr Ile Asp Phe Arg Trp)。

　　本发明的优点在于：本发明是以壳聚糖包裹的纳米颗粒来实施对壳聚糖亲和多肽的筛选，以此避免不易在平板表面形成壳聚糖涂敷层的问题，并且避免了采用平板筛选时的材料聚苯乙烯PS的影响。所筛选得到的包含亲和多肽的噬菌体单克隆对壳聚糖涂层具备强于原始肽库的亲和力；筛选得到的亲和肽，均可以改变壳聚糖包裹的介孔硅纳米颗粒的表面性质，可以显著提高纳米颗粒在碱性条件下的稳定性，这为纳米颗粒在碱性条件下的使用提供帮助。

　　附图说明

　　图1.介孔硅纳米颗粒和壳聚糖包裹的介孔硅纳米颗粒透射电镜图，左侧：介孔硅纳米颗粒，右侧：壳聚糖包裹的介孔硅纳米颗粒。

　　图2.壳聚糖亲和多肽氨基酸残基亲疏水性分析。

　　图3.(A)不同噬菌体的吸附等温曲线(B)噬菌体浓度为800pM时，不同噬菌体的相对亲和力大小(■):噬菌体C1(展示多肽P1)；(●):噬菌体C2(展示多肽P2)；(▲):噬菌体C3(展示多肽P3)；噬菌体C4(展示多肽P4)；噬菌体C5(展示多肽P5)；噬菌体C6(展示多肽P6)(◆):原始肽库噬菌体。

　　图4.不同浓度亲和多肽与壳聚糖相互作用，A)多肽P2，B)多肽P3。

　　图5.多肽吸附包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒后在不同pH条件下的Zeta电位。

　　图6.多肽在壳聚糖包裹的介孔硅纳米颗粒上的吸附量测定。

　　具体实施方式

　　下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

　　实施例

　　结合噬菌体的淘选

　　包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒的制备

　　羧基化介孔硅纳米颗粒的合成：首先称取全氟丁基磺酰氟FC-4 0.8g和混合嵌段式聚醚F-127 0.65g，依次加入到0.02M的40ml HCl溶液中，然后在250ml的三角烧瓶中冷凝回流，在全氟丁基磺酰氟FC-4溶解完全时，加入四乙氧基硅烷(TEOS)2.2g到混合物中，在30℃下强力搅拌20h，当混合液变成白色乳浊状态时，升温到100℃，继续强力搅拌24h。将所得到的产物在室温下冷却，使用超纯水和纯乙醇的混合液在12,000rpm转速下洗涤产物三次，将所得到的固体在真空干燥箱烘干后，使用管式炉在550℃下煅烧3h，得到介孔硅颗粒。称取100mg MSNs，然后加入到含有0.25ml 3-丙氨基三乙氧基硅烷的20ml无水乙醇溶液中，在室温状态下剧烈搅拌24h。然后，使用无水乙醇反复多次洗涤混合物，并在60℃下真空干燥，得到氨基修饰的介孔硅颗粒(MSNs-NH2)。

　　称取20mg的丁二酸酐，加入到10ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，再加入50mgMSNs-NH2，在室温状态下剧烈搅拌12h后，使用乙醇和去离子水洗涤多次，然后在60℃下真空干燥，得到羧基修饰的介孔硅颗粒(MSNs-COOH)。

　　称取0.2g壳聚糖，溶于200ml 1％乙酸溶液中，在磁力搅拌器上搅拌24h。然后使用0.5M NaOH将壳聚糖溶液pH调至6.0。将调节pH后的溶液使用0.45μM的滤膜抽滤，除去不溶的壳聚糖颗粒。称取0.1g羧基化的介孔硅纳米颗粒加入到20ml壳聚糖溶液中，在磁力搅拌器上连续搅拌36h。将溶液转移到离心管中12000rpm离心30min，倒掉上清，使用超纯水重悬，重复2次上述重悬离心步骤，最后真空干燥。

　　包裹介孔硅壳聚糖纳米颗粒的Zeta电位

　　称取50mg包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒溶于50ml超纯水中，超声分散30min。使用马尔文纳米激光粒度仪测量包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒的粒径和Zeta电位。

　　包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒TEM

　　用于透射电镜(TEM)观察的样品的前处理和制备方法如下：

　　(1)将制备好的包裹介孔硅壳聚糖纳米颗粒超声分散于超纯水中

　　(2)使用微量移液器枪吸取10μL上述分散液小心滴在有碳膜支持的电镜铜网上。

　　(3)在室温下放置干燥后，将电镜铜网装进电镜样品杆中。在电镜样品室中放入样品杆准备进行观察。结果如图1.

　　噬菌体肽库筛选壳聚糖亲和多肽

　　包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒亲和多肽筛选

　　(1)称取50mg包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒溶于50ml TBST(0.2％Tween-20)中，超声分散30min。

　　(2)取1ml上述溶液加入1.5ml EP管中，然后加入10μl原始七肽库，在室温下旋转震荡60min。

　　(3)12000rpm，10min离心上一步溶液，并使用TBST(0.2％Tween-20)洗沉淀10次，在最后一次洗沉淀后将溶液转移到新的EP管中，并离心倒掉上清。

　　(4)在EP管中加入非特异性缓冲溶液0.2M Gly-HCl(pH 2.2)，1mg/mlBSA分离颗粒上结合的噬菌体：温和摇动10min后，16,000rpm离心10min，将上清吸取到另一个干净EP管中，然后在加入1/6体积1M Tris-HCl(pH 9.1)中和洗脱液，混匀。

　　(5)测定噬菌体滴度

　　①细菌的准备：接种ER2738单克隆至5ml LB培养基中，37℃振荡培养至对数生长中期(OD600约0.5)

　　②准备琼脂平板：将LB/IPTG/Xgal放置于37℃培养箱中预温备用，每个噬菌体稀释梯度对应一个平板。

　　③准备顶层琼脂：将顶层琼脂在微波炉里融化后，分装成3ml等份与灭菌过的试管中，在45℃保温备用。

　　④噬菌体系列梯度稀释：洗脱中和的噬菌体用LB培养基进行10倍梯度稀释。梯度范围为101-104。

　　⑤感染与铺板：当细菌培养到对数中期后，分装成200ml等份于干净EP管中，每个噬菌体稀释梯度对应一管。吸取10μl不同稀释度的噬菌体加入到ER2738中，快速振荡混匀，室温静置1min。将感染后的细胞加入到45℃保温的顶层琼脂试管中，一次一管，快速混匀后立即倒入37℃保温的LB/IPTG/Xgal平板上，轻旋令顶层琼脂铺开到平板上。

　　⑥培养及计数：待平板室温冷却5min后，37℃倒置过夜培养。第二日，选择约有100个噬菌斑的平板进行计数，然后以该数目乘以该板的噬菌体稀释倍数得到每10μl洗脱液的pfu(plage forming units)。

　　(6)洗脱噬菌体的扩增

　　①挑选ER2738单克隆接种到含四环素的LB培养基中过夜培养，第二天按1:100的比例稀释到20ml的LB培养基中。

　　②将洗脱中和后的噬菌体(约80μl)加入到20ml LB培养基中，37℃强力震动培养4.5h。

　　③将培养物转入到50ml离心管中，4℃12,000g离心10min。将上清转移到新的50ml离心管中再次离心，尽量去除残留菌体及碎片。

　　④收集上清约80％到新的无菌离心管中，加入1/6体积的20％PEG/NaCl溶液混匀，4℃静置至少2h。

　　⑤4℃，12000g离心PEG沉淀15min。弃去上清再短暂离心，吸尽残留上清液，在离心管内有指印大小的噬菌体沉淀残留。

　　⑥用1ml TBS溶液将沉淀溶解，将悬液移入1.5ml无菌EP管中，4℃，12,000rpm离心5min。上清转移到新的无菌EP管后加入1/6体积的20％PEG/NaCl溶液混匀，冰上孵育45min。

　　⑦4℃，14,000rpm离心10min，弃去上清，再短暂离心一次，吸尽残液。然后沉淀重悬于200μl TBS溶液中，离心1min后将上清转移到新的无菌EP管中。扩增后的噬菌体存放于4℃，用于滴度测定和下一轮的筛选。

　　(7)根据步骤(5)中的方法测定洗脱扩增物中的噬菌体滴度。

　　(8)进行第二轮筛选：用上一轮筛选后扩增的洗脱物中的2×1011pfu的噬菌体量重复步骤(2)-(4)，在清洗步骤中将Tween浓度调整到0.3％(v/v)。第二轮洗脱物扩增后测定滴度用于第三轮的筛选。

　　(9)第三轮筛选：第二轮洗脱物扩增后测定滴度后用于第三轮的筛选。同时使用0.4％(v/v)Tween20浓度用于清洗步骤。第四至五轮筛选按上述步骤进行。第五轮筛选后所得的洗脱物在LB/IPTG/Xgal平板上测定滴度。平板可贮存于4℃冰箱中，在1-3天内挑选蓝色噬菌斑进行测序。

　　(10)噬菌斑的扩增

　　①挑选ER2738单克隆接种到含四环素的LB培养基中过夜培养，第二天按1:100的比例稀释到LB培养基中，将培养基1ml每管分装到培养管中。每个噬菌斑需要一个培养管。在第三轮洗脱物测定滴度的平板上挑选蓝色噬菌斑到1ml含菌培养管中。

　　②37℃震荡培养4.5h。

　　③将上一步扩增的后的菌液转移到1ml干净EP管中，离心30s后将上清转移到另一干净EP管中，再次离心后取80％上清转移到干净EP管中。

　　(11)噬菌斑测序：使用biomiga M13单链噬菌体DNA提取试剂盒对扩增后的噬菌斑进行提取DNA，然后送上海睿迪生物技术有限公司测序。

　　单克隆噬菌体的测序

　　1.采用-96引物进行自动测序。测序过程由上海生工完成。

　　2.按噬菌体肽库的说明书中方法对测序所得结果进行分析，找出随机7

　　肽的基因编码区，并按照说明书中提供精简遗传密码表(如下表1)写出相

　　应的氨基酸序列。

　　表1精简遗传密码表

　　酶联免疫吸附实验(Elisa)

　　(1)在对扩增后的噬菌斑进行DNA测序时，将测序剩下的噬菌斑上清4℃贮存。

　　(2)挑选ER2738单克隆接种到含四环素的LB培养基中过夜培养，第二天按1:100的比例稀释到20ml LB培养基中。

　　(3)在含ER2738的LB培养基中加入5μl含噬菌体上清，37℃剧烈振荡培养4.5h。

　　(4)将上一步培养物转入50ml离心管中，12,000g离心10min，将上清再转移到50ml离心管中后，再次离心。

　　(5)取80％上清到另一50ml离心管中，加入1/6体积的20％PEG/NaCl沉淀。然后4℃放置5h。

　　(6)4℃12,000g离心上清15min获得沉淀，弃去上清后再次短暂离心，吸尽残留液体。

　　(7)使用1ml TBS将沉淀重悬，然后悬液转移到1ml干净EP管中，4℃离心5min尽量去除残留菌体及碎片。

　　(8)将上清转移到1ml干净EP管中，加入1/6体积的20％PEG/NaCl，冰上孵育45min。然后4℃14000rpm离心10min，弃去上清后再短暂离心，吸尽残余上清。

　　(9)沉淀重悬于50μl TBS溶液中。按照上文表述方法测定该溶液噬菌体滴度，并于4℃贮存。

　　(10)称取0.5g壳聚糖，溶于200ml 1％乙酸溶液中，在磁力搅拌器上搅拌24h。然后使用0.5M NaOH将壳聚糖溶液pH调至5.5。将调节pH后的溶液使用0.45μM的滤膜抽滤，除去不溶的壳聚糖颗粒。在96孔板中加入壳聚糖溶液，每孔200μl，然后将96孔板放置于干燥环境下过夜，在孔板内部形成壳聚糖膜。

　　(11)在96孔板中加入封阻液，并在4℃下放置2h。将封阻液倒出，使用1×TBST洗板6次，每次洗板后将孔板倒置在干净的纸巾上拍打除尽残液。

　　(12)在另一个单独的封阻液处理过的96孔板上每孔加入200μl TBST，在每排第一个孔内加入1012个噬菌体，并在后面的每排中对噬菌体2倍梯度稀释至最后一排孔。

　　(13)使用多孔移液枪将96孔板上稀释好的噬菌体加入到包被有壳聚糖的96孔板内，在室温下震荡作用1h。

　　(14)1×TBST洗板6次，每次洗板后将孔板倒置在干净的纸巾上拍打除尽残液。

　　(15)在1×TBST中以1比5000的比例稀释辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体，在96孔板上每孔加入200μl稀释抗体，在室温下震荡作用1h。

　　(16)1×TBST洗板6次，每次洗板后将孔板倒置在干净的纸巾上拍打除尽残液。

　　(17)准备辣根过氧化物酶底物溶液：称取11mg ABTS溶于50ml 50mM的柠檬酸钠溶液(pH 4.0)中，过滤除菌后，4℃贮存。在加入底物溶液之前，将36μl 30％过氧化氢溶液加入到21ml ABTS贮存液中。

　　(18)在96孔板中每孔加入200μl ABTS溶液，室温震荡作用15min。

　　(19)在酶标仪415nm处读取96孔板各孔吸光度值。结果如图3。

　　筛选多肽序列性质分析

　　针对测序出的噬菌体单链DNA序列，通过序列比对获得外源插入的DNA序列，从而得到多肽的氨基酸序列，进一步分析氨基酸残基对多肽与壳聚糖分子吸附的影响。结果如图2。各条多肽的性质通过强耀生物多肽计算器获得(http://www.chinapeptides.com/toolcfuben.php)。

　　表面等离子共振(SPR)研究多肽与壳聚糖之间的相互作用

　　1.配体固定：打开biacore-software软件，选择Run-wizard，surfacepreparationimmobilization，单击New，芯片选择CM5，对FC1和2两个通道分别设置，1，2通道配对使用(1通道作为参比)，参比通道用活化-封闭无配体固定的方式，本实验用通道2.偶联配体。直接的共价偶联方式有氨基、巯基或醛基等方法可选，最常用氨基偶联。配置合适的浓度的壳聚糖溶液，首先加入EDC/NHC混合液活化芯片表面羧基，利用共价结合的方式将壳聚糖偶联在CM5芯片表面，最后利用乙醇胺进行封闭。

　　3.进样：选择Run-Manual run，flow path选择1-2串联通道，在referencesubtraction选择2-1，点击Start。分别配制浓度为500mM，250mM，125mM，62.5mM的多肽溶液，均放到样品架上。点击Sample injection的图标，选择某一浓度样品的对应位置，将contact time设为120s，dissociation设为120s，然后系统开始进样。

　　4.数据分析：根据实验结果拟合出动力学常数。结果如图4.

　　多肽对包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒Zeta电位的影响

　　称取50mg包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒溶于50ml超纯水中，超声分散30min。取700μl上诉溶液，将合成的多肽加入到其中，使多肽浓度为300μg/ml，使用马尔文纳米激光粒度仪测量包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒的Zeta电位。结果如图5.

　　BCA试剂盒对多肽的吸附量进行测定

　　为了研究亲和多肽在包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒表面的吸附量，以亲和多肽初始浓度为5mg/ml，分别稀释该溶液到1，0.875,0.75，0.625,0.5，0.373,0.25mg/ml，吸取上述溶液40μl分别加入到160μl浓度为1mg/ml包裹介孔硅的壳聚糖纳米颗粒溶液中，相互作用半小时后，14000rpm离心5min，吸取上清20μl加入到96孔板中，同时在96孔板上加入200μl BCA工作液，然后在酶标仪上测量各浓度上清吸光度。然后根据吸附前吸光度减去吸附后上清吸光度换算出颗粒表面多肽吸附量。结果如图6。

　　序列表：