应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置
（一）技术领域
本发明属于生物医疗器械技术领域，特别涉及一种应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置。
（二）背景技术
作为最重要的分子生物学分析方法之一，测序技术的出现不仅为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物学研究提供重要数据，而且在基因诊断和基因治疗等应用研究中也发挥着重要的作用。
高通量测序技术是测序发展历程的一个里程碑,它为现代生命科学研究提供了前所未有的机遇。第二代高通量测序技术(二代测序)可进行基因组测序、转录组测序、基因表达调控、转录因子结合位点的检测以及甲基化等研究。二代测序也是在目前用于解析遗传病遗传机制、药物基因组学、肿瘤个性化治疗、生物标记物鉴定等问题应用最为广泛也最直接的技术手段。
在二代测序的实验步骤中，测序文库的制备是非常关键的一步。传统测序文库的制备需要样本核酸提取、酶前处理或机械剪切、加接头进行链结、PCR扩增等等工序，操作复杂，自动化程度不高。同时为了避免污染，以上操作需要在不同的实验室中进行，对实验室物理空间分布具有严格要求，并且需要操作人员经过专业培训，否则将影响后续测序结果的准确性。
（三）发明内容
本发明为了弥补现有技术第二代测序文库制备技术自动化程度低且操作过程中易引入污染，从而影响测序结果的准确性，并且操作程序专业繁琐，非专业人士不能独立完成的不足，提供了一种应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置，该应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置将建库与纯化的过程完全自动化，且实现全封闭操作，实现零污染、高重复性的文库制备，也解决部分实验室物理空间不足的难题。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置，包括盒体，盒体的顶面上设置进样口，其特殊之处在于：还设置文库转移口，进样口、文库转移口上设置可左右滑动以封闭或打开进样口、文库转移口的密封盖，盒体底部分别设置1个文库收集池、1个样品池、9个试剂仓、1个废液槽，其中，样品池与进样口相对设置，文库收集池与文库转移口相对设置，盒体内分别设置螺杆、取样针，所述螺杆左、右两端分别经轴承三、轴承四与盒体相应侧转动连接，螺杆水平设置，螺杆的右端伸出盒体与螺杆旋钮相连，螺杆上设置连接件，该连接件与螺杆通过螺纹相连，连接件的顶面上设置有取样针容置孔，取样针容置孔的中心轴与螺杆的中心轴垂直，取样针容置孔底部固定设置第一弹簧，第一弹簧与取样针容置孔通轴设置，第一弹簧由取样针容置孔底部向上延伸并伸出取样针容置孔，取样针套设在第一弹簧内，取样针通过管道与负压发生器连通，负压发生器包括壳体、活塞和活塞杆，活塞杆上套有第二弹簧，活塞杆的自由端固定连接压杆针的左端，压杆针的右端伸出盒体，用于推进活塞杆，取样针的上方设置有压板，压板包括压板本体及与压板本体连接的压板轴，其中，压板轴与螺杆平行设置，压板轴的左端通过轴承一与盒体转动连接，压板轴的右端通过轴承二与盒体转动连接， 压板轴的右端伸出盒体与压板旋转相连，
应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置测序方法，包括以下步骤：
将RNA文库构建所用到所有试剂都预先放入盒体底部的试剂仓中，RNA样品经反转录为cDNA、DNA片段化、末端修复、加接头、PCR扩增并纯化后，取样针把构建好的文库转移至文库收集池中，将盒体顶部的密封盖打开，通过文库转移口取出构建好的文库，然后就放到测序平台上进行测序。
所述的应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置，其特殊之处在于：文库制备所需的所有试剂分别置于试剂仓中，文库收集池、废液槽、试剂仓的开口端由锡箔纸封闭。
所述的应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置，其特殊之处在于：文库收集池、样品池、试剂仓、废液槽的上方设置多孔板，多孔板左、右端分别与盒体内壁固定设置，多孔板上的孔与试剂仓、废液槽、样品池、文库收集池的开口端分别对应。
所述的应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置，其特殊之处在于：盒体内壁设有限定压板轴旋转角度的压板限位板，压板限位板位于压板本体下方，压板限位板的中心轴与压板轴垂直。
所述的应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置，其特殊之处在于：轴承三、轴承四安装处均安装密封垫。
所述的应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置，其特殊之处在于：试剂仓1-9中分别盛放的试剂为试剂组合一或试剂组合二，其中，
试剂组合一为：
试剂仓一：RNA反转录试剂混合液，
试剂仓二：DNA片段化试剂混合液；
试剂仓三： EDTA 溶液；
试剂仓四：无DNase、RNase水；
试剂仓五：CMPμre Beads；
试剂仓六：乙醇溶液；
试剂仓七：DNA末端修复及加A试剂混合液；
试剂仓八：Adaptor连接反应试剂混合液；
试剂仓九：PCR扩增试剂混合液，
试剂组合二为：
试剂仓一：RNA反转录试剂混合液，
试剂仓二：DNA片段化试剂混合液；
试剂仓三： EDTA 溶液；
试剂仓四：Nuclease-free Water；
试剂仓五：AMPμre Beads；
试剂仓六：乙醇溶液；
试剂仓七：DNA末端修复及加A试剂混合液；
试剂仓八：Adaptor连接反应试剂混合液；
试剂仓九：PCR扩增试剂混合液。
其中，
试剂组合一优选为：
试剂舱一：RNA反转录试剂混合液4 μl；
试剂舱二：DNA片段化试剂混合液4.2 ul，主要成分：10X dsDNA Fragmentase Reaction Bμffer 2 μl、100X 100 mg/ml 的BSA 0.2 μl、dsDNA Fragmentase 2 μl；
试剂舱三：0.5M 的EDTA 10-20 μl；
试剂舱四：无DNase、RNase水 310-350 μl；
试剂舱五：CMPμre Beads 310-350 μl；
试剂舱六：80%乙醇 900-1100 μl；
试剂舱七：DNA末端修复及加A试剂混合液8.5 μl，主要成分：10x End Repair Reaction Buffer 6.5 μl、End Prep Enzyme Mix 2 μl；
试剂舱八：Adaptor连接反应试剂混合液18.5 μl，主要成分：T4 DNA ligase buffer 14 μl、T4 DNA ligase 2 μl、Adaptor 2.5 μl；
试剂舱九：PCR扩增试剂混合液27 μl，主要成分：HiFidelity 2X PCR Master Mix 25 μl、univesial primer 1μl、Index primer 1μl。
试剂组合二优选为：
试剂舱一：RNA反转录试剂混合液4 μl；
试剂舱二：DNA片段化试剂混合液4.2 μl，其为10X dsDNA Fragmentase Reaction Bμffer 2 μl、100X 100 mg/ml 的BSA 0.2 μl、dsDNA Fragmentase 2 μl；
试剂舱三：0.5M 的EDTA 10-20 μl；
试剂舱四： Nuclease-free Water 210-235 μl；
试剂舱五：AMPμre Beads 215-230 μl；
试剂舱六：80%乙醇 1120-1200 μl；
试剂舱七：DNA末端修复及加A试剂混合液18 ul，其为NEXTflex™ End-Repair & Adenylation Buffer Mix 15 μl、NEXTflex™ End-Repair & Adenylation Enzyme Mix 3 μl；
试剂舱八：Adaptor连接反应试剂混合液50 ul，其为NEXTflex™ Ligase Enzyme Mix 47.5 μl、Adaptor 2.5 μl；
试剂舱九：PCR扩增试剂混合液14 ul，其为NEXTflex™ PCR Master Mix 12μl、NEXTflex™ Primer Mix 2 μl。
所述的应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置，其特殊之处在于：当选用试剂组合一时，测序方法具体包括以下步骤：
文库制备样本：纯化的单链RNA，溶于超纯水中，RNA浓度150-300 ng/μl，RNA纯度：OD260/OD280=1.78-2.0。
试剂舱1-9中分别盛放RNA文库制备试剂。
文库制备流程如下：
以1 μg RNA样本进行文库制备，用移液器吸取10-15 μl样本通过进样口加入到样品池中，封闭进样口。
1、RNA反转录为cDNA
外部机械操控盒体内部的小型移液器将样品池中3.3-6.7 μl的RNA样本转移至试剂舱一中，同时从试剂舱四中转移无DNase、RNase水9.3-12.7 μl至试剂舱一中，保证总体积为20 μl，与试剂舱一中的反转录试剂混合液发生反应，反应条件如下：37℃ 15 min；85℃ 5 seconds；4℃保持。
2、DNA片段化反应
外部机械操控盒体内部的小型移液器将试剂舱一中的cDNA溶液15 μl转移到试剂舱二中，同时从试剂舱四中转移无DNase、RNase水0.8 μl到试剂舱二中，使反应总体积为20 μl，与试剂舱二中的DNA片段化试剂混合液发生反应。
反应条件：35-38℃ 温育25-30分钟。
然后从试剂舱三中吸取5 μl的0.5 M EDTA加入试剂舱一，终止酶促反应。
3、cDNA片段纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10-15次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移25 μl的磁珠液放到试剂舱二中；
2）盒体内部小型移液器上下吸打5-10次混匀，室温静置5-10分钟；
3）控制外部机械的磁力架装置上升至试剂舱二位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）盒体内部小型移液器吸取试剂舱二中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇60 μl至试剂舱二中，静置30-60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱二位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱二中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置10-15分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水35-40 μl至试剂舱一中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次混匀，室温静置5-10分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱二位置，使磁珠与洗脱的cDNA分离。
4、DNA末端修复反应及加A反应：
1）转移试剂舱二中的cDNA纯化溶液25 μl至试剂舱七中，然后转移试剂舱四中的无DNase、RNase水31.5 μl至试剂舱七，利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次混匀，与试剂舱七中的DNA末端修复反应及加A反应混合液进行反应；
2）反应程序如下：12-15℃ 15-20 min；35-37℃ 15-20 min；70-72℃ 20-25 min；4℃保持。
5、末端修复DNA的纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10-15次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移65 μl的磁珠液放到试剂舱七中；
2）盒体内部小型移液器上下吸打5-10次混匀，室温静置5-10分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱七中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇100 μl至试剂舱七中，静置30-60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱七中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置10-15分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水75 μl至试剂舱七中，利用小型移液器上下吸打5-10次，室温静置5-10分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱七位置，使磁珠与洗脱的cDNA分离。
6、连接adaptor
吸取试剂舱七中的cDNA纯化溶液65 μl 至试剂舱八中，与试剂舱八中的Adaptor连接反应试剂混合液反应；
利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次混匀；
反应条件：20-25℃温育15-20分钟。
7、连接adaptor的DNA片段选择性回收
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10-15次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移83.5 μl的磁珠液放到试剂舱八中；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次，室温静置5-10分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱八中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇100 μl至试剂舱八中，静置30-60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱八中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置10-15分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水30 μl至试剂舱八中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次，室温静置5-10分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱八位置，使磁珠与洗脱的cDNA分离。
8、PCR扩增
吸取试剂舱八中的连接adaptor后的cDNA选择性回收片段23 μl，转移至试剂舱九中，与试剂舱九中的PCR扩增试剂混合液反应。
反应程序如下：预变性 95-98℃ 30-45 s；变性 95-98℃ 10-15 s；退火 60-65℃ 30-40 s；延伸 70-72℃ 30-40 s；6-10个循环；终延伸 70-72℃ 4-5 min。
9、PCR产物纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10-15次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移50 μl的磁珠液放到试剂舱九中；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次，室温静置5-10分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱九位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱九中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇60 μl至试剂舱九中，静置30-60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱九位置，使磁珠和上清溶液分离，静置5-10分钟，吸取试剂舱九中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水35-40 μl至试剂舱九中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次，室温静置5-10分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱九位置，使磁珠与PCR产物分离。
10、取出PCR产物
将试剂舱九中的PCR纯化溶液25-30 μl转移至文库收集池，通过文库转移口从外部将PCR纯化溶液移出盒体，即可拿到测序平台上进行簇生成和测序，也可将RNA文库存放在-20℃保存。
所述的应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置，其特殊之处在于：当选用试剂组合二时，测序方法具体包括以下步骤：
文库制备样本：纯化的单链RNA，溶于超纯水中，RNA浓度150-300 ng/μl，RNA纯度：OD260/OD280=1.78-2.0。
试剂舱1-9中分别盛放RNA文库制备试剂。
文库制备流程如下：
以1 μg RNA样本进行文库制备，用移液器吸取10-15 μl样本通过进样口加入到样品池中，封闭进样口。
1、RNA反转录为cDNA
外部机械操控盒体内部的小型移液器将样品池中3.3-6.7 μl的RNA样本转移至试剂舱一中，同时从试剂舱四中转移Nuclease-free Water 9.3-12.7 μl至试剂舱一中，保证总体积为20 μl，与试剂舱一中的反转录试剂混合液发生反应，反应条件如下：37℃ 15 min；85℃ 5 seconds；4℃保持。
2、DNA片段化反应
外部机械操控盒体内部的小型移液器将样品池中的15 μl cDNA溶液转移到试剂舱二中，同时从试剂舱四中转移Nuclease-free Water 0.8 μl到试剂舱二中，使反应总体积为20 μl，与试剂舱二中的DNA片段化试剂混合液发生反应。
反应条件：35-38℃ 温育30-40分钟，。
然后从试剂舱三中吸取5 μl的0.5 M EDTA加入试剂舱二，终止酶促反应。
3、DNA片段纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10-15次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移35 μl的磁珠液放到试剂舱二中；
2）盒体内部小型移液器上下吸打5-10次混匀，室温静置5-10分钟；
3）控制外部机械的磁力架装置上升至试剂舱二位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）盒体内部小型移液器吸取试剂舱二中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇60 μl至试剂舱二中，静置30-60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱二位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离。吸取试剂舱二中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置10-15分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 30-35 μl至试剂舱二中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次混匀，室温静置5-10分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱二位置，使磁珠与洗脱的cDNA分离，
4、DNA末端修复反应及加A反应：
1）转移试剂舱二中的cDNA纯化溶液20 μl至试剂舱七中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次混匀，与试剂舱七中的DNA末端修复反应及加A反应混合液进行反应；
反应程序如下：22-25℃ 18-22 min；70-72℃ 20-25 min；4℃保持。
5、末端修复DNA的纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10-15次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移80 μl的磁珠液放到试剂舱七中；
2）盒体内部小型移液器上下吸打5-10次混匀，室温静置5-10分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱七中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇100 μl至试剂舱七中，静置30-60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱七中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置10-15分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 60 μl至试剂舱七中，利用小型移液器上下吸打5-10次，室温静置5-10分钟；
将磁力架上升至试剂舱七位置，使磁珠与洗脱的DNA分离。
6、连接adaptor
1）吸取试剂舱七中的cDNA纯化溶液50 μl 至试剂舱八中，与试剂舱八中的Adaptor连接反应试剂混合液反应；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打10-15次混匀。
3）反应条件：22-25℃温育15-20分钟。
7、连接adaptor的DNA片段选择性回收
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10-15次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移60 μl的磁珠液放到试剂舱八中；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次，室温静置5-10分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱八中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇200 μl至试剂舱八中，静置30-60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱八中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置5-10分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 30 μl至试剂舱八中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次，室温静置5-10分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱八位置，使磁珠与洗脱的cDNA分离。
8、PCR扩增
吸取试剂舱八中的连接adaptor后的cDNA选择性回收片段20 μl，转移至试剂舱九中，与试剂舱九中的PCR扩增试剂混合液反应。
反应程序如下：预变性 95-98℃ 2-2.5 min；变性 95-98℃ 30-40 s；退火 60-65℃ 30-40 s；延伸 70-72℃ 60-90 s；4-10个循环；终延伸 70-72℃ 4-5 min。
9、PCR产物纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10-15次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移40 μl的磁珠液放到试剂舱九中；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次，室温静置5-10分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱九位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱九中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇200 μl至试剂舱九中，静置30-60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱九位置，使磁珠和上清溶液分离，静置5-10分钟，吸取试剂舱九中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置5-10分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 35-40μl至试剂舱九中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次，室温静置5-10分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱九位置，使磁珠与PCR产物分离，
10、取出PCR产物
将试剂舱九中的PCR纯化溶液25-30 μl转移至文库收集池，通过文库转移孔从外部将PCR纯化溶液移出盒体，即可拿到测序平台上进行簇生成和测序，也可将RNA文库存放在-20℃保存。
所述的应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置，其特殊之处在于：文库制备方法具体还包括步骤：
文库质量检测：制备好的RNA文库用琼脂糖凝胶电泳检测RNA文库中的片段长度分布范围，若构建的文库质量良好，可以直接进行测序。
本发明有益效果：本发明将RNA文库构建所用到所有试剂都预先放入盒体底部的试剂仓中，RNA样品经反转录为cDNA、DNA片段化、末端修复、加接头、PCR扩增并纯化后，取样针把构建好的文库转移至文库收集池中，将盒体顶部的密封盖打开，通过文库转移口取出构建好的文库，然后就可以放到测序平台上进行后续的测序。将RNA样品由进样口加至样品池后密封进样口，构建过程产生的废液等都存放在盒体底部的废液槽内，整个建库过程都在盒体内部完成，全程封闭，不与外界接触，不会产生污染，解决了科研及临床试验工作中让人颇为头疼的污染问题，同时解放了人工，即使是本领域内的普通技术人员都能独立操作实施，提高了效率。
（四）附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
附图1为本发明装置的结构示意图；
附图2为本发明压板和压板限位板的位置关系示意图；
附图3为本发明螺杆与连接件的位置关系示意图，
图中，1盒体，11进样口，2压板轴，21轴承一， 23轴承二，24压板限位板，25压板本体，26压板轴，3取样针，31活塞，32负压发生器，33第二弹簧，34压杆针，35第一弹簧，36管道，4螺杆，41轴承三，42轴承四，44连接件，5样品池，61试剂仓一，62试剂仓二，63试剂仓三 ，64试剂仓四，65试剂仓五，66试剂仓六，67试剂仓七，68试剂仓八，69试剂仓九，7废液槽 ，8锡箔，9多孔板，12文库转移口，13文库收集池。
（五）具体实施方式
本实施例应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置包括盒体1，盒体1的顶面上设置进样口11，其特征在于：还设置文库转移口12，进样口11、文库转移口12上设置可左右滑动以封闭或打开进样口11、文库转移口12的密封盖，盒体1底部从左往右依次设置1个文库收集池13、1个样品池5、8个试剂仓61-69、1个废液槽7，试剂仓一 61、 试剂仓二 62、 试剂仓三 63、试剂仓四 64、试剂仓五 65、试剂仓六66、试剂仓七 67、试剂仓八68、试剂仓九69、样品池 5 和文库收集池13、废液槽7的顶部位于同一平面，文库制备所需的所有试剂均置于试剂仓61-69中，为避免试剂被污染，文库收集池13、废液槽7、试剂仓61-69的开口端由锡箔8封闭，样品池5的开口端未封闭。样品池5与进样口11相对设置，可以使用移液器将建库样本通过进样口11加入到样品池5中；文库收集池13与文库转移口12相对设置，用于盛放最终构建好的文库，可以用移液器通过文库转移口12将制备好的文库吸出储存或直接用于测序；废液槽7用于盛装文库制备过程中产生的所有废液。
试剂仓一 61、 试剂仓二 62、 试剂仓三 63、试剂仓四 64、试剂仓五 65、试剂仓六 66、试剂仓七 67、试剂仓八68、试剂仓九69、废液槽7、样品池 5 和文库收集池13的上部设置有多孔板 9，多孔板 9 与盒体 1 内壁固定连接，多孔板 9 上的孔分别对应试剂仓一 61、 试剂仓二 62、 试剂仓三 63、试剂仓四 64、试剂仓五 65、试剂仓六66、试剂仓七 67、试剂仓八68、试剂仓九69、废液槽7、样品池 5 和文库收集池13的开口端。盒体1内分别设置螺杆4、取样针3，所述螺杆4左、右两端分别经轴承三41、轴承四42与盒体1相应侧转动连接，螺杆4水平设置，螺杆4的右端伸出盒体1与螺杆旋钮相连，螺杆4上设置连接件44，该连接件44与螺杆4通过螺纹相连，转动螺杆旋钮，连接件44与螺杆4相对运动，连接件44的顶面上设置有取样针容置孔 45，取样针容置孔 45 的中心轴与螺杆 4 的中心轴垂直，取样针容置孔 45 底部固定设置第一弹簧 35，第一弹簧 35 与取样针容置孔 45 通轴设置，第一弹簧 35 由取样针容置孔 35底部向上延伸并伸出取样针容置孔 45，取样针 3 套设在第一弹簧 35 内，旋转螺杆旋钮，取样针随着连接件 44在试剂仓61-69、样品池 5、废液槽 7、文库收集池13之间的移动，取样针 3 通过管道 36 与负压发生器 32 连通，负压发生器 32 包括壳体、活塞 31 和活塞杆，活塞杆上套有第二弹簧 33，活塞杆的自由端固定连接压杆针 34 的左端，压杆针 34 的右端伸出盒体 1，用于推进活塞杆，当不推动压杆针 34 时，第二弹簧 33将压杆针 34 弹回原位，取样针 3 的上方设置有压板 2，压板 2 包括压板本体 25 及与压板本体 25连接的压板轴 26，其中，压板轴 26 与螺杆 4 平行设置， 压板轴 26 的左端通过轴承一 21 与盒体 1 转动连接，压板轴 26 的右端通过轴承二 23 与盒体 1 转动连接， 压板轴 26 的右端伸出盒体 1与压板旋转相连。压板本体 25 用于向下按压取样针 3，旋转压板旋钮，压板轴 26 带动压板本体 25向下按压取样针 3，不旋转压板旋钮时，第一弹簧 35 将压板本体 25 弹回原位。故盒体内部的取样针3，通过活塞31、负压发生器32、第二弹簧33及第一弹簧35的作用实现在盒体底部不同试剂仓61-69间左右以及上下移动，完成液体的吸取与释放。试剂仓61-69，可按顺序加入反转录、DNA片段化、片段末端修复、加接头、PCR扩增和纯化所需的各种试剂，然后用锡箔8密封，实现文库制备过程的全封闭、零污染。各试剂仓放置试剂依次为：试剂仓一61（盛放反转录试剂混合液）、试剂仓二62（盛放DNA片段化试剂混合液）、试剂仓三63（盛装0.5M 的EDTA）、试剂仓四64（盛装无DNase、RNase水）、试剂仓五65（盛放DNA片段选择性回收磁珠）、试剂仓六66（盛装80%乙醇）、试剂仓七67（盛放DNA末端修复及加A试剂混合液）、试剂仓八68（盛放Adaptor连接反应试剂混合液）、试剂仓九69（盛放PCR扩增试剂混合液）。
盒体 1内壁还固定设置有用于限定压板轴 26旋转角度的压板限位板 24，压板限位板 24 位于压板本体 25 下方，压板限位板 24 的中心轴与压板轴 26 垂直，压板轴 26 转至一定角度时，压板 25 与压板限位板 24 接触，压板轴 26 不能继续旋转。
本发明的全自动文库制备装置与外部机械部分配合使用，外部机械由控制系统控制，可以在控制系统上输入指令，按照检测步骤设置好取液间隔、取哪个试剂仓中的试剂以及吸取试剂的体积等。样品由进样口11注入样品池5，封闭进样口；外部机械根据设定好的步骤操作内部的取样针3在不同试剂仓间左右以及上下移动，完成液体的吸取与释放，完成文库制备的一系列流程。最终制备好的文库集中于文库收集池13，手动使用移液器将制备好的文库吸出，储存或直接进行测序。
实施例1
本实施例应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置的测序步骤如下：
文库制备样本：纯化的单链RNA，溶于超纯水中。RNA浓度215 ng/μl，RNA纯度：OD260/OD280=1.85。
试剂舱1-9中分别盛放的试剂及体积为：
试剂舱一：RNA反转录试剂混合液4 μl（5×PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)；
试剂舱二：DNA片段化试剂混合液4.2 ul（主要成分：10X dsDNA Fragmentase Reaction Bμffer 2 μl、100X BSA (100 mg/ml) 0.2 μl、dsDNA Fragmentase 2 μl）；
试剂舱三：0.5M 的EDTA 10 μl；
试剂舱四：无DNase、RNase水 310 μl；
试剂舱五：CMPμre Beads 310μl；
试剂舱六：80%乙醇 900μl；
试剂舱七：DNA末端修复及加A试剂混合液8.5 μl（主要成分：10x End Repair Reaction Buffer 6.5 μl、End Prep Enzyme Mix 2 μl）
试剂舱八：Adaptor连接反应试剂混合液18.5 μl（主要成分：T4 DNA ligase buffer 14 μl、T4 DNA ligase 2 μl、Adaptor 2.5 μl）；
试剂舱九：PCR扩增试剂混合液27 μl（主要成分：HiFidelity 2X PCR Master Mix 25 μl、univesial primer 1μl、Index primer 1μl）。
文库制备流程如下：
以1 μg RNA样本进行文库制备，用移液器吸取10 μl样本通过进样口加入到样品池中，封闭进样口。用手将盒体快速甩两下，以确保所有试剂都集中于试剂舱底部。（以下所有反应程序都通过控制系统的软件程序操控外部机械来实现。）
1、RNA反转录为cDNA
外部机械操控盒体内部的小型移液器将样品池中4.6μl的RNA样本转移至试剂舱一中，同时从试剂舱四中转移无DNase、RNase水11.4 μl至试剂舱一中，保证总体积为20 μl，与试剂舱一中的反转录试剂混合液发生反应，反应条件如下：37℃ 15 min；85℃ 5 seconds；4℃保持。
2、DNA片段化反应
外部机械操控盒体内部的小型移液器将试剂舱一中的cDNA溶液15 μl转移到试剂舱二中，同时从试剂舱四中转移无DNase、RNase水0.8 μl到试剂舱二中（使反应总体积为20 μl），与试剂舱二中的DNA片段化试剂混合液发生反应。
反应条件：37℃ 温育30分钟。
然后从试剂舱三中吸取5 μl的0.5 M EDTA加入试剂舱一，终止酶促反应。
3、DNA片段纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移25 μl的磁珠液放到试剂舱二中；
2）盒体内部小型移液器上下吸打5次混匀，室温静置10分钟；
3）控制外部机械的磁力架装置上升至试剂舱二位置，静置10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）盒体内部小型移液器吸取试剂舱二中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇60 μl至试剂舱二中，静置30秒；
6）将磁力架上升至试剂舱二位置，静置5分钟，使磁珠和上清溶液分离。吸取试剂舱二中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水35 μl至试剂舱一中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5次混匀，室温静置10分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱二位置，使磁珠与洗脱的cDNA分离。
4、DNA末端修复反应及加A反应：
1）转移试剂舱二中的cDNA纯化溶液25 μl至试剂舱七中，然后转移试剂舱四中的无DNase、RNase水31.5 μl至试剂舱七，利用盒体内部小型移液器上下吸打5次混匀，与试剂舱七中的DNA末端修复反应及加A反应混合液进行反应；
2）反应程序如下：12℃ 20 min；35℃ 20 min；70℃ 25 min；4℃保持。
5、末端修复DNA的纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移65 μl的磁珠液放到试剂舱七中；
2）盒体内部小型移液器上下吸打5次混匀，室温静置10分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置5分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱七中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇100 μl至试剂舱七中，静置30秒；
6）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置5分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱七中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水75 μl至试剂舱七中，利用小型移液器上下吸打5次，室温静置10分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱七位置，使磁珠与洗脱的cDNA分离。
6、连接adaptor
1）吸取试剂舱七中的cDNA纯化溶液65 μl 至试剂舱八中，与试剂舱八中的Adaptor连接反应试剂混合液反应；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打5次混匀；
反应条件：20℃温育20分钟。
7、连接adaptor的DNA片段选择性回收
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移83.5 μl的磁珠液放到试剂舱八中；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打5次，室温静置10分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置5分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱八中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇100 μl至试剂舱八中，静置30秒；
6）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置5分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱八中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水30 μl至试剂舱八中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5次，室温静置10分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱八位置，使磁珠与洗脱的cDNA分离。
8、PCR扩增
吸取试剂舱八中的连接adaptor后的cDNA选择性回收片段23 μl，转移至试剂舱九中，与试剂舱九中的PCR扩增试剂混合液反应。
反应程序如下：预变性 95℃ 45 s；变性 95℃ 15 s；退火 60℃ 40 s；延伸 70℃ 40 s；6个循环；终延伸 70℃ 5 min。
9、PCR产物纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10-15次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移50 μl的磁珠液放到试剂舱九中；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打5次，室温静置10分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱九位置，静置5分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱九中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇60 μl至试剂舱九中，静置30秒；
6）将磁力架上升至试剂舱九位置，使磁珠和上清溶液分离，静置5分钟，吸取试剂舱九中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水35μl至试剂舱九中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5次，室温静置10分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱九位置，使磁珠与PCR产物分离。
10、取出PCR产物
将试剂舱九中的PCR纯化溶液30μl转移至文库收集池，通过文库转移口从外部将PCR纯化溶液移出盒体，即可拿到测序平台上进行簇生成和测序，也可将cDNA文库存放在-20℃保存。
11、文库质量检测
制备好的RNA文库用琼脂糖凝胶电泳检测RNA文库中的片段长度分布范围，若构建的文库质量良好，可以直接进行测序。
实施例2
本实施例应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置的测序步骤如下：
文库制备样本：纯化的单链RNA，溶于超纯水中。RNA浓度150 ng/μl，RNA纯度：OD260/OD280=2.0。
试剂舱三：0.5M 的EDTA 20 μl；
试剂舱四：无DNase、RNase水 350 μl；
试剂舱五：CMPμre Beads 350 μl；
试剂舱六：80%乙醇 1100 μl；
文库制备流程如下：
以1 μg RNA样本进行文库制备，用移液器吸取15 μl样本通过进样口加入到样品池中，封闭进样口。
1、RNA反转录为cDNA
外部机械操控盒体内部的小型移液器将样品池中6.7 μl的RNA样本转移至试剂舱一中，同时从试剂舱四中转移无DNase、RNase水9.3 μl至试剂舱一中，保证总体积为20 μl，与试剂舱一中的反转录试剂混合液发生反应。
2、DNA片段化反应
反应条件：38℃ 温育25分钟。
3、DNA片段纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打15次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移25 μl的磁珠液放到试剂舱二中；
2）盒体内部小型移液器上下吸打10次混匀，室温静置5分钟；
3）控制外部机械的磁力架装置上升至试剂舱二位置，静置10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇60 μl至试剂舱二中，静置60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱二位置，静置10分钟，使磁珠和上清溶液分离。吸取试剂舱二中的上清，转移至废液槽；
8）室温静置15分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水40 μl至试剂舱一中，利用盒体内部小型移液器上下吸打10次混匀，室温静置5分钟。
4、DNA末端修复反应及加A反应：
1）转移试剂舱二中的cDNA纯化溶液25 μl至试剂舱七中，然后转移试剂舱四中的无DNase、RNase水31.5 μl至试剂舱七，利用盒体内部小型移液器上下吸打10次混匀，与试剂舱七中的DNA末端修复反应及加A反应混合液进行反应；
2）反应程序如下： 15℃ 15 min； 37℃ 15 min； 72℃ 20 min；4℃保持。
5、末端修复DNA的纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打15次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移65 μl的磁珠液放到试剂舱七中；
2）盒体内部小型移液器上下吸打10次混匀，室温静置5分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇100 μl至试剂舱七中，静置60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置10分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱七中的上清，转移至废液槽；
8）室温静置15分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水75 μl至试剂舱七中，利用小型移液器上下吸打10次，室温静置5分钟。
6、连接adaptor
利用盒体内部小型移液器上下吸打10次混匀；
反应条件： 25℃温育15分钟。
7、连接adaptor的DNA片段选择性回收
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打15次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移83.5 μl的磁珠液放到试剂舱八中；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打10次，室温静置5分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇100 μl至试剂舱八中，静置60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置10分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱八中的上清，转移至废液槽；
8）室温静置15分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水30 μl至试剂舱八中，利用盒体内部小型移液器上下吸打10次，室温静置5分钟。
8、PCR扩增
反应程序如下：预变性 98℃ 30 s；变性98℃ 10s；退火 65℃ 30s；延伸 72℃ 30 s； 10个循环；终延伸72℃ 4 min。
9、PCR产物纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打15次将试剂舱五中的CMPure磁珠彻底混匀，然后转移50 μl的磁珠液放到试剂舱九中；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打10次，室温静置5分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱九位置，静置10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇60 μl至试剂舱九中，静置60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱九位置，使磁珠和上清溶液分离，静置10分钟，吸取试剂舱九中的上清，转移至废液槽；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水40 μl至试剂舱九中，利用盒体内部小型移液器上下吸打10次，室温静置5分钟。
10、取出PCR产物
将试剂舱九中的PCR纯化溶液30 μl转移至文库收集池，通过文库转移口从外部将PCR纯化溶液移出盒体，即可拿到测序平台上进行簇生成和测序，也可将cDNA文库存放在-20℃保存。
其他与实施例1相同。
实施例3
本实施例应用于第二代高通量测序的全自动RNA文库制备装置的测序步骤如下：
文库制备样本：纯化的单链RNA，溶于超纯水中。RNA浓度300 ng/μl，RNA纯度：OD260/OD280=1.78。
试剂舱三：0.5M 的EDTA 15 μl；
试剂舱四：无DNase、RNase水 330μl；
试剂舱五：CMPμre Beads 330 μl；
试剂舱六：80%乙醇 1000 μl；
文库制备流程如下：
以1 μg RNA样本进行文库制备，用移液器吸取13 μl样本通过进样口加入到样品池中，封闭进样口。
1、RNA反转录为cDNA
外部机械操控盒体内部的小型移液器将样品池中3.3μl的RNA样本转移至试剂舱一中，同时从试剂舱四中转移无DNase、RNase水12.7μl至试剂舱一中，保证总体积为20 μl，与试剂舱一中的反转录试剂混合液发生反应。
3、DNA片段纯化
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水38μl至试剂舱一中，利用盒体内部小型移液器上下吸打8次混匀，室温静置7分钟。
9、PCR产物纯化
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的无DNase、RNase水35 μl至试剂舱九中，利用盒体内部小型移液器上下吸打8次，室温静置8分钟。
10、取出PCR产物
将试剂舱九中的PCR纯化溶液28 μl转移至文库收集池，通过文库转移口从外部将PCR纯化溶液移出盒体，即可拿到测序平台上进行簇生成和测序，也可将cDNA文库存放在-20℃保存。
其他与实施例1相同。
实施例4
文库制备样本：纯化的单链RNA，溶于超纯水中。RNA浓度150 ng/μl，RNA纯度：OD260/OD280=2.0。
试剂舱1-9中分别盛放的试剂及体积为：
试剂舱一：RNA反转录试剂混合液4 μl（5×PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)；
试剂舱二：DNA片段化试剂混合液4.2 μl（10X dsDNA Fragmentase Reaction Bμffer 2 μl、100X BSA (100 mg/ml) 0.2 μl、dsDNA Fragmentase 2 μl）；
试剂舱三：0.5M 的EDTA 10 μl；
试剂舱四： Nuclease-free Water 210μl；
试剂舱五：AMPμre Beads 215μl；
试剂舱六：80%乙醇 1120μl；
试剂舱七：DNA末端修复及加A试剂混合液18 ul（NEXTflex™ End-Repair & Adenylation Buffer Mix 15 μl、NEXTflex™ End-Repair & Adenylation Enzyme Mix 3 μl）；
试剂舱八：Adaptor连接反应试剂混合液50 ul（NEXTflex™ Ligase Enzyme Mix 47.5 μl、Adaptor 2.5 μl）；
试剂舱九：PCR扩增试剂混合液14 ul（NEXTflex™ PCR Master Mix 12μl、NEXTflex™ Primer Mix 2 μl）。
文库制备流程如下：
以1 μg RNA样本进行文库制备，用移液器吸取10μl样本通过进样口加入到样品池中，封闭进样口。用手将盒体快速甩两下，以确保所有试剂都集中于试剂舱底部。（以下所有反应程序都通过控制系统的软件程序操控外部机械来实现。）
1、RNA反转录为cDNA
外部机械操控盒体内部的小型移液器将样品池中6.7 μl的RNA样本转移至试剂舱一中，同时从试剂舱四中转移Nuclease-free Water 9.3 μl至试剂舱一中，保证总体积为20 μl，与试剂舱一中的反转录试剂混合液发生反应，反应条件如下：37℃ 15 min；85℃ 5 seconds；4℃保持。
2、DNA片段化反应
外部机械操控盒体内部的小型移液器将样品池中的15 μl cDNA溶液转移到试剂舱二中，同时从试剂舱四中转移Nuclease-free Water 0.8 μl到试剂舱二中（使反应总体积为20 μl），与试剂舱二中的DNA片段化试剂混合液发生反应。
反应条件：35℃ 温育40分钟。
然后从试剂舱三中吸取5 μl的0.5 M EDTA加入试剂舱二，终止酶促反应。
3、DNA片段纯化
1)通过盒体内部小型移液器上下吸打10次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移35 μl的磁珠液放到试剂舱二中；
2)盒体内部小型移液器上下吸打5次混匀，室温静置10分钟；
3)控制外部机械的磁力架装置上升至试剂舱二位置，静置5分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4)盒体内部小型移液器吸取试剂舱二中的上清，转移至废液槽；
5)将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇60 μl至试剂舱二中，静置30秒；
6)将磁力架上升至试剂舱二位置，静置5分钟，使磁珠和上清溶液分离。吸取试剂舱二中的上清，转移至废液槽；
7)重复步骤5、6；
8)室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥；
9)将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 30 μl至试剂舱二中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5次混匀，室温静置10分钟；
10)将磁力架上升至试剂舱二位置，使磁珠与洗脱的cDNA分离。
4、DNA末端修复反应及加A反应：
1）转移试剂舱二中的cDNA纯化溶液20 μl至试剂舱七中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5次混匀，与试剂舱七中的DNA末端修复反应及加A反应混合液进行反应；
2)反应程序如下：22℃ 22 min；70℃ 25 min；4℃保持。
5、末端修复DNA的纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移80 μl的磁珠液放到试剂舱七中；
2）盒体内部小型移液器上下吸打5次混匀，室温静置10分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置5分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱七中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇100 μl至试剂舱七中，静置30秒；
6）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置5分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱七中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 60 μl至试剂舱七中，利用小型移液器上下吸打5次，室温静置10分钟；
10)将磁力架上升至试剂舱七位置，使磁珠与洗脱的DNA分离。
6、连接adaptor
1)吸取试剂舱七中的cDNA纯化溶液50 μl 至试剂舱八中，与试剂舱八中的Adaptor连接反应试剂混合液反应；
2)利用盒体内部小型移液器上下吸打10次混匀；
3)反应条件：22℃温育20分钟。
7、连接adaptor的DNA片段选择性回收
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移60 μl的磁珠液放到试剂舱八中；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打5次，室温静置10分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置5分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱八中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇200 μl至试剂舱八中，静置30秒；
6）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置5分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱八中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置5分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 30 μl至试剂舱八中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5次，室温静置10分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱八位置，使磁珠与洗脱的cDNA分离。
8、PCR扩增
吸取试剂舱八中的连接adaptor后的cDNA选择性回收片段20 μl，转移至试剂舱九中，与试剂舱九中的PCR扩增试剂混合液反应。
反应程序如下：预变性 95℃ 2.5 min；变性 95℃ 40 s；退火 60℃ 40 s；延伸 70℃ 90 s；4个循环；终延伸 70℃ 5 min。
9、PCR产物纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移40 μl的磁珠液放到试剂舱九中；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打5次，室温静置10分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱九位置，静置5分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱九中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇200 μl至试剂舱九中，静置30秒；
6）将磁力架上升至试剂舱九位置，使磁珠和上清溶液分离，静置5分钟，吸取试剂舱九中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置5分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 35μl至试剂舱九中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5次，室温静置10分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱九位置，使磁珠与PCR产物分离。
10、取出PCR产物
将试剂舱九中的PCR纯化溶液25μl转移至文库收集池，通过文库转移孔从外部将PCR纯化溶液移出盒体，即可拿到测序平台上进行簇生成和测序，也可将RNA文库存放在-20℃保存。
11、文库质量检测
制备好的RNA文库用琼脂糖凝胶电泳检测RNA文库中的片段长度分布范围，若构建的文库质量良好，可以直接进行测序。
实施例5
文库制备样本：纯化的单链RNA，溶于超纯水中。RNA浓度300 ng/μl，RNA纯度：OD260/OD280=1.78。
试剂舱1-9中分别盛放的试剂及体积为：
试剂舱一：RNA反转录试剂混合液4 μl（5×PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)；
试剂舱二：DNA片段化试剂混合液4.2 μl（10X dsDNA Fragmentase Reaction Bμffer 2 μl、100X BSA (100 mg/ml) 0.2 μl、dsDNA Fragmentase 2 μl）；
试剂舱三：0.5M 的EDTA 10-20 μl；
试剂舱四： Nuclease-free Water 210-235 μl；
试剂舱五：AMPμre Beads 215-230 μl；
试剂舱六：80%乙醇 1120-1200 μl；
试剂舱七：DNA末端修复及加A试剂混合液18 ul（NEXTflex™ End-Repair & Adenylation Buffer Mix 15 μl、NEXTflex™ End-Repair & Adenylation Enzyme Mix 3 μl）；
试剂舱八：Adaptor连接反应试剂混合液50 ul（NEXTflex™ Ligase Enzyme Mix 47.5 μl、Adaptor 2.5 μl）；
试剂舱九：PCR扩增试剂混合液14 ul（NEXTflex™ PCR Master Mix 12μl、NEXTflex™ Primer Mix 2 μl）。
文库制备流程如下：
以1 μg RNA样本进行文库制备，用移液器吸取10-15 μl样本通过进样口加入到样品池中，封闭进样口。用手将盒体快速甩两下，以确保所有试剂都集中于试剂舱底部。（以下所有反应程序都通过控制系统的软件程序操控外部机械来实现。）
1、RNA反转录为cDNA
外部机械操控盒体内部的小型移液器将样品池中3.3-6.7 μl的RNA样本转移至试剂舱一中，同时从试剂舱四中转移Nuclease-free Water 9.3-12.7 μl至试剂舱一中，保证总体积为20 μl，与试剂舱一中的反转录试剂混合液发生反应，反应条件如下：37℃ 15 min；85℃ 5 seconds；4℃保持。
2、DNA片段化反应
外部机械操控盒体内部的小型移液器将样品池中的15 μl cDNA溶液转移到试剂舱二中，同时从试剂舱四中转移Nuclease-free Water 0.8 μl到试剂舱二中（使反应总体积为20 μl），与试剂舱二中的DNA片段化试剂混合液发生反应。
反应条件：35-38℃ 温育30-40分钟。
然后从试剂舱三中吸取5 μl的0.5 M EDTA加入试剂舱二，终止酶促反应。
3、DNA片段纯化
1)通过盒体内部小型移液器上下吸打10-15次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移35 μl的磁珠液放到试剂舱二中；
2)盒体内部小型移液器上下吸打5-10次混匀，室温静置5-10分钟；
3)控制外部机械的磁力架装置上升至试剂舱二位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4)盒体内部小型移液器吸取试剂舱二中的上清，转移至废液槽；
5)将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇60 μl至试剂舱二中，静置30-60秒；
6)将磁力架上升至试剂舱二位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离。吸取试剂舱二中的上清，转移至废液槽；
7)重复步骤5、6；
8)室温静置10-15分钟，使磁珠在空气中干燥；
9)将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 30-35 μl至试剂舱二中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次混匀，室温静置5-10分钟；
10)将磁力架上升至试剂舱二位置，使磁珠与PCR产物分离。
4、DNA末端修复反应及加A反应：
1）转移试剂舱二中的cDNA纯化溶液20 μl至试剂舱七中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次混匀，与试剂舱七中的DNA末端修复反应及加A反应混合液进行反应；
2)反应程序如下：22-25℃ 18-22 min；70-72℃ 20-25 min；4℃保持。
5、末端修复DNA的纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10-15次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移80 μl的磁珠液放到试剂舱七中；
2）盒体内部小型移液器上下吸打5-10次混匀，室温静置5-10分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱七中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇100 μl至试剂舱七中，静置30-60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱七中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置10-15分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 60 μl至试剂舱七中，利用小型移液器上下吸打5-10次，室温静置5-10分钟；
10)将磁力架上升至试剂舱七位置，使磁珠与洗脱的DNA分离。
6、连接adaptor
1)吸取试剂舱七中的cDNA纯化溶液50 μl 至试剂舱八中，与试剂舱八中的Adaptor连接反应试剂混合液反应；
2)利用盒体内部小型移液器上下吸打10-15次混匀；
3)反应条件：22-25℃温育15-20分钟。
7、连接adaptor的DNA片段选择性回收
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10-15次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移60 μl的磁珠液放到试剂舱八中；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次，室温静置5-10分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱八中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇200 μl至试剂舱八中，静置30-60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱八中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置5-10分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 30 μl至试剂舱八中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次，室温静置5-10分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱八位置，使磁珠与PCR产物分离。
8、PCR扩增
吸取试剂舱八中的连接adaptor后的cDNA选择性回收片段20 μl，转移至试剂舱九中，与试剂舱九中的PCR扩增试剂混合液反应。
反应程序如下：预变性 95-98℃ 2-2.5 min；变性 95-98℃ 30-40 s；退火 60-65℃ 30-40 s；延伸 70-72℃ 60-90 s；4-10个循环；终延伸 70-72℃ 4-5 min。
9、PCR产物纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打10-15次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移40 μl的磁珠液放到试剂舱九中；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次，室温静置5-10分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱九位置，静置5-10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱九中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇200 μl至试剂舱九中，静置30-60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱九位置，使磁珠和上清溶液分离，静置5-10分钟，吸取试剂舱九中的上清，转移至废液槽；
7）重复步骤5、6；
8）室温静置5-10分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 35-40μl至试剂舱九中，利用盒体内部小型移液器上下吸打5-10次，室温静置5-10分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱九位置，使磁珠与PCR产物分离。
10、取出PCR产物
将试剂舱九中的PCR纯化溶液25-30 μl转移至文库收集池，通过文库转移孔从外部将PCR纯化溶液移出盒体，即可拿到测序平台上进行簇生成和测序，也可将cDNA文库存放在-20℃保存。
11、文库质量检测
制备好的cDNA文库用琼脂糖凝胶电泳检测cDNA文库中的片段长度分布范围，若构建的文库质量良好，可以直接进行测序。
实施例5
文库制备样本：纯化的单链RNA，溶于超纯水中。RNA浓度300 ng/μl，RNA纯度：OD260/OD280=1.78。
试剂舱三：0.5M 的EDTA 20 μl；
试剂舱四： Nuclease-free Water 235 μl；
试剂舱五：AMPμre Beads 230 μl；
试剂舱六：80%乙醇 1200 μl。
文库制备流程如下：
以1 μg RNA样本进行文库制备，用移液器吸取15 μl样本通过进样口加入到样品池中，封闭进样口。
1、RNA反转录为cDNA
外部机械操控盒体内部的小型移液器将样品池中6.6 μl的RNA样本转移至试剂舱一中，同时从试剂舱四中转移Nuclease-free Water 9.4 μl至试剂舱一中，保证总体积为20 μl。
2、DNA片段化反应
反应条件： 38℃ 温育30分钟。
3、DNA片段纯化
1)通过盒体内部小型移液器上下吸打15次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移35 μl的磁珠液放到试剂舱二中；
2)盒体内部小型移液器上下吸打10次混匀，室温静置5分钟；
3)控制外部机械的磁力架装置上升至试剂舱二位置，静置10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
5)将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇60 μl至试剂舱二中，静置60秒；
6)将磁力架上升至试剂舱二位置，静置10分钟，使磁珠和上清溶液分离。吸取试剂舱二中的上清，转移至废液槽；
8)室温静置15分钟，使磁珠在空气中干燥；
9)将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 35 μl至试剂舱二中，利用盒体内部小型移液器上下吸打10次混匀，室温静置5分钟。
4、DNA末端修复反应及加A反应：
1）转移试剂舱二中的cDNA纯化溶液20 μl至试剂舱七中，利用盒体内部小型移液器上下吸打10次混匀，与试剂舱七中的DNA末端修复反应及加A反应混合液进行反应；
2)反应程序如下： 25℃ 18 min； 72℃ 20 min；4℃保持。
5、末端修复DNA的纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打15次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移80 μl的磁珠液放到试剂舱七中；
2）盒体内部小型移液器上下吸打10次混匀，室温静置5分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇100 μl至试剂舱七中，静置60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱七位置，静置10分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱七中的上清，转移至废液槽；
8）室温静置15分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 60 μl至试剂舱七中，利用小型移液器上下吸打10次，室温静置5分钟。
6、连接adaptor
2)利用盒体内部小型移液器上下吸打15次混匀；
3)反应条件： 25℃温育15分钟。
7、连接adaptor的DNA片段选择性回收
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打15次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移60 μl的磁珠液放到试剂舱八中；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打10次，室温静置5分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇200 μl至试剂舱八中，静置60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱八位置，静置10分钟，使磁珠和上清溶液分离，吸取试剂舱八中的上清，转移至废液槽；
8）室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 30 μl至试剂舱八中，利用盒体内部小型移液器上下吸打10次，室温静置5分钟。
8、PCR扩增
反应程序如下：预变性 98℃ 2 min；变性 98℃ 30 s；退火 65℃ 30s；延伸 72℃ 60 s； 10个循环；终延伸 72℃ 4 min。
9、PCR产物纯化
1）通过盒体内部小型移液器上下吸打15次将试剂舱五中的AMPure磁珠彻底混匀，然后转移40 μl的磁珠液放到试剂舱九中；
2）利用盒体内部小型移液器上下吸打10次，室温静置5分钟；
3）将磁力架上升至试剂舱九位置，静置10分钟，使磁珠和上清溶液分离；
4）吸取试剂舱九中的上清，转移至废液槽；
5）将磁力架降低，吸取试剂舱六中的80%乙醇200 μl至试剂舱九中，静置60秒；
6）将磁力架上升至试剂舱九位置，使磁珠和上清溶液分离，静置10分钟，吸取试剂舱九中的上清，转移至废液槽；
8）室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥；
9）将磁力架降低，吸取试剂舱四中的 Nuclease-free Water 40μl至试剂舱九中，利用盒体内部小型移液器上下吸打10次，室温静置5分钟；
10）将磁力架上升至试剂舱九位置，使磁珠与PCR产物分离。
10、取出PCR产物
将试剂舱九中的PCR纯化溶液30 μl转移至文库收集池，通过文库转移孔从外部将PCR纯化cDNA溶液移出盒体，即可拿到测序平台上进行簇生成和测序，也可将cDNA文库存放在-20℃保存。
其他与实施例4相同。
