一种沟叶结缕草全长cDNA文库构建的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种沟叶结缕草全长cDNA文库构建的方法。
背景技术
cDNA文库是以某种生物在特定时期、特定组织或特定处理下所表达的全部mRNA为模板，经反转录形成的混合cDNA与适当的载体进行连接或重组后，转化受体菌获得包括所有mRNA信息的cDNA克隆集合；近些年，cDNA文库成为基因挖掘或分子生物学研究的重要基础，如通过cDNA文库获取大量的EST序列，采用cDNA表达文库筛选获得优异的抗逆基因，利用cDNA酵母双杂文库筛选获得互作蛋白。
沟叶结缕草（Zoysia matrella）属禾本科（Gramineae）画眉草亚科（Chloridoideae）结缕草属植物，是优异的多年生暖季型草坪草，在世界范围内广泛应用，具有较高的经济价值和生态效应；同时，沟叶结缕草为盐生植物，是盐碱地宝贵的生物基因资源，其盐胁迫下cDNA文库构建的研究未见报道。
发明内容
本发明提供了一种沟叶结缕草全长cDNA文库的构建方法，本发明的技术问题可通过如下技术方案解决：
1.采用Trizol 法提取总RNA，通过mRNA纯化试剂盒获得高质量mRNA；
2.将步骤1的mRNA反转录成cDNA，RNA消化，纯化获得高质量第一链cDNA；
3.采用cap-antibody磁珠富集步骤2中带5’帽子结构的第一链cDNA；
4.给步骤3中的cDNA加上5’接头后纯化，合成cDNA第二链，形成双链cDNA；
5.对步骤4中的双链cDNA进行分级分离及收集，获得高纯度的双链cDNA；
6.步骤5获得的双链cDNA与文库载体pDONR/Zeocin进行BP重组，电转大肠杆菌DH10B，即完成沟叶结缕草全长未剪切cDNA文库的构建。
有益效果：
1．本发明提供的沟叶结缕草全长cDNA表达文库，可直接用于测序、功能基因组学研究，用于优异基因的规模化筛选；
2．本发明提供的文库构建的方法，可为其他植物文库构建提供参考。
附图说明
图1 为具体实施方式1中提取的沟叶结缕草植株（包括根茎叶）的总RNA（a）及mRNA纯化（b）检测的电泳图及浓度检测图；
图2 为具体实施方式7中的文库浓度检测及PCR检测，a：取电转化菌液10µL按照1:100稀释取50µL涂布平板后，长出的克隆；b：随机挑选32个克隆，PCR检测其插入片段大小。
具体实施方式
1. RNA提取与mRNA纯化。
采用水培法进行盐处理，取300 mM NaCl的Hoagland 营养液处理10 d后的沟叶结缕草植株，采用Trizol RNA试剂盒（Invitrogen）提取根、茎、叶的总RNA，采用1%凝胶电泳检测RNA条带清晰，Thermo nanodrop 核酸分析仪定量结果表明（图1a），RNA浓度为884.6ng/µL，A260/A280为1.93，总体积600µL，RNA总量达到520µg。采用Dynabeads® mRNAPurification Kit（Invitrogen）分离纯化mRNA，检测结果表明（图1b），mRNA在1-5kb呈现弥散条带，mRNA浓度达到12.8 ng/µL，A260/A280为2.17，总体积400µL，mRNA总量达到5.12µg。这些结果均达到文库构建的要求。
2. 第一链cDNA合成及RNA消化。
取实施方式1中得到的mRNA，经乙醇沉淀，溶于22.5 µL DEPC水中，按下表在0.2mlRNase free tube中配置引物反应体系：
70℃处理7min，然后在15min内缓慢降至45℃；按下表依次加入：
混匀后并运行以下程序：45℃ 20min，50℃ 20min，55℃ 20min。然后经乙醇沉淀，溶于179µL DEPC水中。按下列体系进行RNA消化处理：
37℃孵育30min；然后经酚抽提和乙醇沉淀，最后用300µL TEN buffer重悬cDNA沉淀，获得高质量cDNA第一链。
3. 富集带5’帽子结构的一链cDNA。
① 取充分混匀的cap-antibody（Invitrogen）磁珠300µl，于磁架上静置2min、去上清，用300µL的TEN buffer（10 mM Tris-HCl，pH 7.5；0.1 mM EDTA；25 mM NaCl）重悬洗涤2次，去上清后，加入300µL的TEN buffer和20µg的酵母tRNA重悬磁珠，置于室温孵育10min。
② 重悬①的磁珠，加入实施方式2中获得的300µL高质量cDNA第一链，室温孵育60min，每隔20min混匀一次；然后于磁架上静置2min、去上清；用300µl的TEN buffer重悬洗涤2次，去上清后，加入300µL的TENG buffer（10 mM Tris-HCl，pH 7.5；0.1 mM EDTA；25 mMNaCl；1 mM GDP）重悬cap-antibody磁珠并转入新的1.5ml离心管中，静置，去上清。
③ 加入100µL的50 mM NaOH重悬②的磁珠，于37℃孵育10min，静置、取上清置于新的离心管中，即为洗脱的cDNA；然后加入100µL的1M Tris-Hcl（pH7.0）中和cDNA中的NaOH。重复两次，最后收集的洗脱液管中溶液总体积为400µL。
④ 采用DNA柱纯化试剂盒，纯化400µL洗脱液，用22µL的DEPC水过柱洗涤获得全长筛选富集的cDNA第一链溶液。
4. 加5’接头及双链cDNA合成。
加入以下产物置于PCR仪上，95℃ 10分钟，立即从PCR仪上取出，置于室温，放置30分钟，合成attB1 adapter接头；
将具体实施方式3中获得的22µL的cDNA第一链溶液中依次加入以下试剂
用枪混匀后置于16℃孵育24小时，然后采用DNA柱纯化试剂盒纯化，用80µL的DEPC水过柱洗涤获得带接头的cDNA第一链溶液；
按照以下体系合成cDNA第二链，形成双链cDNA溶液
68℃ 20 min，72℃ 20 min，置于冰上待用。
5. cDNA分级分离及收集。
向具体实施方式3中获得的100µl的双链cDNA中加入50µL的TEN buffer，混匀后加入分级柱（Invitrogen）中，收集全部滤过液到1号收集管；然后向分级柱中加入250µL的TENbuffer，收集全部滤过液到2号收集管；向分级柱中加入50µL的TEN buffer，收集全部滤过液到3号收集管；向分级柱中加入100µL的TEN buffer，收集全部滤过液到4号收集管；向分级柱中加入100µL的TEN buffer，收集全部滤过液到5号收集管；取2号收集管的产物，经乙醇沉淀，用14µL溶解cDNA双链，用于下一步反应。
6．BP重组及电转化。
按下表加入各成分：
混匀后置于25℃，20小时。然后加入2µL的ProreinaseK，37℃，15min；75℃，10min。再经乙醇沉淀，用8µL的TE Buffer溶解cDNA；将纯化的2uL重组产物和50µL电转感受态细胞DH10B混合加入预冷电转杯，冰上置45min；于TX ECM 630电转化仪上电击转化，其条件设置为：
电击后迅速向电转杯中加入SOC培养基1mL，将电转物取入到新的15mL离心管，置于37℃，225-250rpm摇床培养1小时；培养结束后，此即为全长未剪切cDNA文库菌液。
7．文库质量检测。
取菌液10µL按照1:100稀释取50µL涂布平板用于库容量鉴定、插入片段大小评价及测序检测；经检测（图2a），转化平板的菌液浓度为：CFU/ml= 500/50µL ×100 × 1000µL=1×106cfu/mL，共电转3次，共获得3mL菌液，总克隆数CFU达到3×106 个；
随机挑选32个克隆进行PCR扩增检测，其检测体系为：
其PCR扩增条件为：
其检测结果如图2b，重组率达到100%，平均插入片段大小为1.59kb。另外，也通过测序，BLASTX分析表明，16个克隆序列（SEQ ID NO. 6-21）中均包括了预测的起始密码子序列，全长率达到100%。
综上所述，本发明成功构建了高质量的沟叶结缕草全长cDNA文库，不仅为开展沟叶结缕草功能基因组学研究奠定了新思路，同时也为其它植物文库构建提供了新方法。
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
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<160> 21
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 第一链cDNA合成引物序列Biotin-attB2-Oligo(dT) Primer
<400> 1
ggcggccgca caactttgta caagaaagtt gggttttttt tttttttttt ttt 53
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 5’接头合成引物attB1-adapter-F
<400> 2
tcgtcgggga caactttgta caaaaaagtt gg 32
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 5’接头合成引物attB1-adapter-R
<400> 3
cccctgttga aacatgtttt ttcaacc 27
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 文库质量检测的PCR反应引物pDONR222F
<400> 4
tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtctt 36
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 文库质量检测的PCR反应引物pDONR222R
<400> 5
agagctgcca ggaaacagct atgaccatgt aatacgactc 40
<210> 6
<211> 96
<212> DNA
<213> 沟叶结缕草（Zoysia matrella）
<220>
<223> 沟叶结缕草文库基因ATG上游启动子序列
<400> 6
1tgaaaggagacgagtcgagagaagcggcggcggcagcgacccgatccgccaccgccaccg
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<210> 7
<211> 96
<212> DNA
<213> 沟叶结缕草（Zoysia matrella）
<220>
<223> 沟叶结缕草文库基因ATG上游启动子序列
<400> 7
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61 g
<210> 8
<211> 294
<212> DNA
<213> 沟叶结缕草（Zoysia matrella）
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<223> 沟叶结缕草文库基因ATG上游启动子序列
<400> 8
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<212> DNA
<213> 沟叶结缕草（Zoysia matrella）
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<223> 沟叶结缕草文库基因ATG上游启动子序列
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<212> DNA
<213> 沟叶结缕草（Zoysia matrella）
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<223> 沟叶结缕草文库基因ATG上游启动子序列
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61 ggc
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 沟叶结缕草（Zoysia matrella）
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<223> 沟叶结缕草文库基因ATG上游启动子序列
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<213> 沟叶结缕草（Zoysia matrella）
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61 ggttcatgtcc
<210> 15
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<212> DNA
<213> 沟叶结缕草（Zoysia matrella）
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<223> 沟叶结缕草文库基因ATG上游启动子序列
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<212> DNA
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<210> 17
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<212> DNA
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<223> 沟叶结缕草文库基因ATG上游启动子序列
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