附图说明" src="/d/file/p/2020/11-23/e18109002c35148d01ddbd86324d9531.gif" />
采用De novo转录组分析鉴定隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶基因的方法
技术领域
本发明属于生物食品领域，涉及一种鉴定隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶基因的方法及其应用。
背景技术
DHA即二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)是人脑发育、成长的重要物质之一，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20％，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50％。因此，它对胎儿和婴幼儿的大脑和视网膜的发育，以及成年人脑功能的维修等方面有着重要的作用。此外，DHA对冠心病、中风、高血压等心血管系统的疾病、神经失常、老年痴呆症和抑郁症等神经系统的疾病也有积极的影响。DHA作为一种必需脂肪酸，其增强记忆与思维能力、提高智力等作用更为显著。人群流行病学研究发现，体内DHA含量高的人的心理承受力较强，智力发育指数也高。DHA还可用于癌症治疗，抑制发炎等。据荷兰帝斯曼公司的估计，DHA的全球市场价值约为25-26.2亿美元，并且以每年15％以上的速度增长。截止目前为止，深海鱼油一直是市售的DHA的主要来源。但这一主要来源存在诸多缺点，比如海洋污染造成的对鱼油安全性的担忧，鱼油质量会随着鱼的种类、捕捞季节和地点的不同而不同，含EPA、易受环境污染、纯化成本高，鱼油的特殊气味也限制了鱼油来源的DHA作为一种食品添加剂的应用。尤其是考虑到DHA的主要消费者是怀孕妇女和年幼的孩子，其可能的不利影响更令人担忧；此外，世界渔业资源的逐年萎缩对DHA的可持续性供应的影响也值得考虑。
微藻中寇氏隐甲藻由于其快速的生长速率及较高的DHA含量、几乎不含其它不饱和多脂肪酸等副产物、易于在实验室条件下大规模培养等优势，近年来在生产中的应用越来越广泛，相关的研究也越来越深入，并逐渐可以替代传统的从鱼类产品中直接提取DHA的方法。隐甲藻作为一种原始的真核单细胞微藻，其生长周期可粗划分为细胞生长阶段和稳定时期，其中稳定期是隐甲藻积累DHA的主要阶段。然而，目前隐甲藻的基因组信息尚未公布，其DHA的合成途径尚不明确，限制了工程改造寇氏隐甲藻的各种努力。在这种情况下，Denovo转录组，又称为从头测序应运而生。该方法不需要任何现有基因组信息，就可以对某个物种的全部转录本进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的全部转录本的序列信息以及不同条件下表达响应过程。因此，利用De novo转录组来解析隐甲藻中DHA的生物合成途径，特别是脂肪酸去饱和催化机制，对进一步提高隐甲藻中DHA含量具有重要指导意义。
发明内容
本发明的目的是利用二代测序技术illumina/solexa系统，对寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)转录组进行de novo深度测序。对测序结果进行生物信息学分析后，得到该物种转录组中全部与DHA合成相关的基因序列(全长或部分)。最终鉴定出DHA积累期在转录组水平表达量显著变化的、和DHA生物合成相关的功能基因。
其过程主要包括如下步骤：
(1)对隐甲藻进行DHA合成的发酵培养：
将隐甲藻在含有2.0g/L酵母提取物，9.0g/L葡萄糖，25.0g/L的海水盐的培养基中25℃静态培养生长3-5天。然后以10％(v/v)的菌种接种量，接种到含50mL培养基(2.0g/L酵母提取物，25.0g/L海盐和9.0g/L葡萄糖)的250毫升锥形瓶中，并在摇床上培育2天(转速为180rpm，25℃)。随后放大接种到含100mL培养基(7.5g/L酵母提取物，25.0g/L海盐，27.0g/L葡萄糖)的500毫升锥形瓶中，并在摇床上培养三天后用于接种7.5升的生物反应器。最终以20％(v/v)的菌种接种量转入发酵罐培养(7.5g/L酵母提取物，25.0g/L海盐，27.0g/L葡萄糖)，并按照前60小时内C：N质量比2:1补料，之后改为10：1补料。并始终将葡萄糖含量控制在15-25g/L，溶氧控制在30％，温度25℃。
(2)RNA提取及转录组测序：
①细胞收集：
在48h，72h和96h三个时间点取样，用紫外分光光度计测得不同油脂积累阶段在48h，72h和96h的OD490值，按照OD490＝5收集细胞；在4℃，7,500-8,000rpm条件下离心10min，弃去上清，之后迅速放入液氮中冷却。
②RNA的提取：
利用液氮研磨法对步骤(2)①收集到的菌体细胞进行充分裂解，并保证在研磨过程中始终存在液氮。随后将研磨好的菌体分别加入到1.5mL离心管中，利用RNeasy PlantMini Kit试剂盒和DNase I对隐甲藻的转录组进行纯化提取。
③测序文库的构建：
利用NanoDrop和1％的琼脂糖凝胶电泳对步骤(2)②获得的各样品进行质量检测，并利用Ribo-ZeroTM rRNA removal Kit(Plant Leaf)对质量检测合格的样品进行核糖体RNA的去除。随后利用ProtoScript II反转录酶和随机引物以及Actinomycin D对第一条cDNA链进行合成，利用Second Strand Synthesis Enzyme Mix对第二条cDNA链进行合成。随后将AxyPrep Mag PCR Clean-up(Axygen)纯化后的双链cDNA进行末端修复与A尾的连接，并收集长度至360bp之内的转录本进行文库的构建。
③文库测序：
根据测序仪Illumina HiSeq 2500的说明，步骤(2)③获得的各样品进行2*150bp的Paired-end(PE)测序，其中图像分析与碱基判断根据HiSeq Control Software(HCS)+OLB+GAPipeline-1.6(Illumina)完成，共计产生214,142,690条原始的reads。
(3)数据分析与处理：
①测序数据质量控制：
利用NGS QC Toolkit软件对步骤(2)获得的各个样品进行数据过滤：
1：去除引物序列；
2：去除read 5’端前5bp的碱基；
3：去除read 3’端质量值低于30的碱基。
②数据拼接：
利用Trinity软件对步骤(3)①获得的样品数据进行合并进行de novo拼接，其中min_cov参数设置为2，其余参数为默认参数。
③定量分析与过滤：
利用RSEM软件分别将步骤(3)①获得的样品数据比对到步骤(3)②得到的拼接结果中，进行转录本定量分析。随后将潜在的噪音序列(在三个样本中最大FPKM值小于1，或最大比对reads数小于10的转录本剔除)，最终得到87,911 个转录本和82,106个Unigenes。随后利用Transdecoder软件对潜在的编码蛋白进行预测。
(4)基因功能注释与统计分析：
①功能注释：
利用BLAST软件对对步骤(3)③获得的转录本在NR,NT,KEGG,SWISSPORT和GO等数据库中以E-value<1e-5为阈值进行功能注释。根据注释信息，筛选到大量的脂肪酸去饱和酶的序列信息及相对表达量。
②相关性的统计分析：
用R软件对步骤(4)①获得的各样本中的脂肪酸去饱和酶相对表达量进行对应分析，找到各样本和脂肪酸去饱和酶表达的关系；在对应分析图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大；同时，图中各个相关转录本用黑色三角表示，距离中心点越远的转录本，其在不同样本中的表达差异就越大；通过将得分图与载荷图叠加，得到一个二维散点图，其中分布在样本周围的转录本，为该样本中特异表达的转录本，可被认为是与DHA生物合成相关的重要候选脂肪酸去饱和酶基因。
从图3可以看出分布在样品周围为该样品中较其他样品表达差异明显的转录本，分布在48h(生长阶段)，72h(饱和脂肪酸积累阶段)和96h(不饱和脂肪酸积累阶段)样品周围的转录本可视为与DHA生物合成密切相关的基因。因此，编码delta-5 fatty aciddesaturase(delta-5位脂肪酸去饱和酶)的TR16340|c2_g1_i2，编码delta-9 fatty aciddesaturase(delta-9位脂肪酸去饱和酶)的转录本TR63320|c0_g2_i1和编码acyl-CoAdesaturase(乙酰辅酶A去饱和酶)的TR20109|c0_g1_i1的转录本可能与隐甲藻脂肪酸积累以及DHA合成有关；同时，编码delta-6 fatty acid desaturase(delta-6位脂肪酸去饱和酶)的转录本TR9998|c0_g1_i1和隐甲藻不饱和脂肪酸的转换阶段具有重要作用，该基因可被认为是隐甲藻中与DHA生物合成相关的重要候选脂肪酸去饱和酶基因。
(5)qRT-PCR验证
以转录组样本测序的cDNA为模板，利用Primer Express软件进行引物设计，进行qRT-PCR验证。
qRT-PCR反应体系配置如下：
设置qRT-PCR反应程序:
溶解曲线程序:
程序完成之后，采用StepOnePlus分析软件对qRT-PCR数据进行分析。利用18SrRNA内参基因和目标基因之间的△CT差值，计算基因直接的相对表达量。从图5的结果显示，qRT-PCR与转录组测序的结果相关系数均大于0.65，其中TR9998|c0_g1_i1在96h上调3倍，证实TR9998|c0_g1_i1是隐甲藻中DHA生物合成的一个重要标记基因。
本发明的实施方案是选用来自美国菌株保藏中心ATCC的寇氏隐甲藻(菌株代码ATCC 30556)为试材，运用Illumina/Solexa转录组深度测序获得隐甲藻DHA合成相关基因，并进而验证该基因的变动以及与DHA生物合成的关系。该方法除通量大、速度快、成本低的优点外，还可应用于无全基因组背景的物种的研究上；此外，该方法产生的海量数据经qRT-PCR验证可靠，可以为后续深入研究隐甲藻的其他特定代谢提供信息依据。
针对本发明中鉴定的寇氏隐甲藻中与DHA生物合成相关脂肪酸去饱和酶基因TR9998|c0_g1_i1(delta-6 fatty acid desaturase)，可利用基因工程的原理，将其在寇氏隐甲藻中进行过量表达，从而达到改善提高寇氏隐甲藻中油脂及DHA含量的效果。
本发明从蔻氏隐甲藻成功地分离获得了在DHA积累阶段下表达量明显上升的基因TR9998|c0_g1_i1(delta-6 fatty acid desaturase)，这给利用基因工程手段进一步提高隐甲藻DHA合成能力提供了方向和靶点。以上概括地描述了本发明，可通过参照本文提供的某些具体实施例进一步理解本发明，这些实施例仅是为了说明而不是限制本发明。
附图说明
图1为隐甲藻在DHA发酵培养中的生长曲线与葡萄糖消耗曲线。
图2为隐甲藻不同发酵阶段的总油脂和DHA的含量和百分比变化。图中总油脂和DHA百分比含量与48小时样本具有显著差别时，我们用“*”进行了标记。
图3为隐甲藻中脂肪酸去饱和酶的对应分析得分图与载荷图的重叠二维图。各样本名称分别用不同颜色进行了标记，每个灰色字体表示转录组拼接后的自动获得的ID号。x轴和y轴分别表示了对应分析的第一维和第二维。
图4为隐甲藻中脂肪酸去饱和酶催化反应的机制。红色箭头表示在发酵后期发生差异表达的转录本。
图5为qRT-PCR与转录组测序的表达相关性。A)72小时与48小时样本比较；B)96小时与48小时样本的比较。横轴表示RNA测序结果差异倍数的log2转换值，纵轴表示qRT-PCR结果差异表达倍数的log2转换值，两者之间的相关系数在图的右下角展示。误差线表示重复样之间的标准差。
图6、图7和图8为序列表。
具体实施方式
表1为隐甲藻中鉴定到的脂肪酸去饱和酶基因在不同样本中的表达情况。
表2为验证基因表达所使用的qRT-PCR的引物。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
本发明各实施例使用的寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)，该菌购自美国菌株保藏中心ATCC，菌株代码ATCC 30556。
选择寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)为实验材料仅是作为例证，证明此方法可以成功地应用于寇氏隐甲藻脂肪酸去饱和酶的发现和鉴定，但本发明同样可以应用于其他微生物应用于其他相关生物产物关键基因的寻找。
实施例1
鉴定隐甲藻中与DHA生物合成相关脂肪酸去饱和酶基因的方法，包括如下步骤：
(1)对隐甲藻进行DHA合成的发酵培养：
将隐甲藻在含有2.0g/L酵母提取物，9.0g/L葡萄糖，25.0g/L的海水盐的培养基中25℃静态培养生长3-5天。然后以10％(v/v)的菌种接种量，接种到含50mL培养基(2.0g/L酵母提取物，25.0g/L海盐和9.0g/L葡萄糖)的250毫升锥形瓶中，并在摇床上培育2天(转速为180rpm，25℃)。随后放大接种到含100mL培养基(7.5g/L酵母提取物，25.0g/L海盐，27.0g/L葡萄糖)的500毫升锥形瓶中，并在摇床上培养三天后用于接种7.5升的生物反应器。最终以20％(v/v)的菌种接种量转入发酵罐培养(7.5g/L酵母提取物，25.0g/L海盐，27.0g/L葡萄糖)，并按照前60小时内C：N质量比2:1补料，之后改为10：1补料。并始终将葡萄糖含量控制在15-25g/L，溶氧控制在30％，温度25℃。
(2)RNA提取及转录组测序：
①细胞收集：
在48h，72h和96h三个时间点取样，用紫外分光光度计测得不同油脂积累阶段在48h，72h和96h的OD490值，按照OD490＝5收集细胞；在4℃，7,500-8,000rpm条件下离心10min，弃去上清，之后迅速放入液氮中冷却。
②RNA的提取：
利用液氮研磨法对步骤(2)①收集到的菌体细胞进行充分裂解，并保证在研磨过程中始终存在液氮。随后将研磨好的菌体分别加入到1.5mL离心管中，利用RNeasy PlantMini Kit试剂盒和DNase I对隐甲藻的转录组进行纯化提取。
③测序文库的构建：
利用NanoDrop和1％的琼脂糖凝胶电泳对步骤(2)②获得的各样品进行质量检测，并利用Ribo-ZeroTM rRNA removal Kit(Plant Leaf)对质量检测合格的样品进行核糖体RNA的去除。随后利用ProtoScript II反转录酶和随机引物以及Actinomycin D对第一条cDNA链进行合成，利用Second Strand Synthesis Enzyme Mix对第二条cDNA链进行合成。随后将AxyPrep Mag PCR Clean-up(Axygen)纯化后的双链cDNA进行末端修复与A尾的连接，并收集长度至360bp之内的转录本进行文库的构建。
③文库测序：
根据测序仪Illumina HiSeq 2500的说明，步骤(2)③获得的各样品进行2*150bp的Paired-end(PE)测序，其中图像分析与碱基判断根据HiSeq Control Software(HCS)+OLB+GAPipeline-1.6(Illumina)完成，共计产生214,142,690条原始的reads。
(3)数据分析与处理：
①测序数据质量控制：
利用NGS QC Toolkit软件对步骤(2)获得的各个样品进行数据过滤：
1：去除引物序列；
2：去除read 5’端前5bp的碱基；
3：去除read 3’端质量值低于30的碱基。
②数据拼接：
利用Trinity软件对步骤(3)①获得的样品数据进行合并进行de novo拼接，其中min_cov参数设置为2，其余参数为默认参数。
③定量分析与过滤：
利用RSEM软件分别将步骤(3)①获得的样品数据比对到步骤(3)②得到的拼接结果中，进行转录本定量分析。随后将潜在的噪音序列(在三个样本中最大FPKM值小于1，或最大比对reads数小于10的转录本剔除)，最终得到87,911个转录本和82,106个Unigenes。随后利用Transdecoder软件对潜在的编码蛋白进行预测。
(4)基因功能注释与统计分析：
①功能注释：
利用BLAST软件对对步骤(3)③获得的转录本在NR,NT,KEGG,SWISSPORT和GO等数据库中以E-value<1e-5为阈值进行功能注释。根据注释信息，筛选到大量的脂肪酸去饱和酶的序列信息及相对表达量。
②相关性统计分析：
用R软件对步骤(4)①获得的各样本中的脂肪酸去饱和酶相对表达量进行对应分析，找到各样本和脂肪酸去饱和酶表达的关系；在对应分析图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大；同时，图中各个相关转录本用黑色三角表示，距离中心点越远的转录本，其在不同样本中的表达差异就越大；通过将得分图与载荷图叠加，得到一个二维散点图，其中分布在样本周围的转录本，为该样本中特异表达的转录本，可被认为是与DHA生物合成相关的重要脂肪酸去饱和酶基因。
从图3可以看出分布在样品周围为该样品中较其他样品表达差异明显的转录本，分布在48h(生长阶段)，72h(饱和脂肪酸积累阶段)和96h(不饱和脂肪酸积累阶段)样品周围的转录本可视为与DHA生物合成密切相关的基因。因此，编码delta-5 fatty aciddesaturase的TR16340|c2_g1_i2,编码delta-9 fatty acid desaturase的转录本TR63320|c0_g2_i1和编码acyl-CoA desaturase的TR20109|c0_g1_i1的转录本可能与隐甲藻脂肪酸积累以及DHA合成有关；同时，编码delta-6 fatty acid desaturase的转录本TR9998|c0_g1_i1和隐甲藻不饱和脂肪酸的转换阶段具有重要作用，该基因可被认为是隐甲藻中与DHA生物合成相关的重要脂肪酸去饱和酶基因。
(5)qRT-PCR验证
以转录组样本测序的cDNA为模板，利用Primer Express软件进行引物设计，进行qRT-PCR验证。
qRT-PCR反应体系配置如下：
设置qRT-PCR反应程序:
溶解曲线程序:
程序完成之后，采用StepOnePlus分析软件对qRT-PCR数据进行分析。利用18SrRNA内参基因和目标基因之间的△CT差值，计算基因直接的相对表达量。从图5的结果显示，qRT-PCR与转录组测序的结果相关系数均大于0.65，其中TR9998|c0_g1_i1在96h上调3倍，证实TR9998|c0_g1_i1是隐甲藻中DHA生物合成的一个重要标记基因。
综上所述，本发明为今后进一步鉴定与DHA的生物合成相关的标记基因，提供了可行的技术路线和关键的理论基础。
表1：实施例1隐甲藻中脂肪酸去饱和酶基因的种类及表达量
表2:验证基因表达使用的qRT-PCR引物
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明藻能生物科技有限公司
<120> 采用De
novo转录组分析鉴定隐甲藻中与DHA生物合成相关的脂肪酸去饱和酶基因的
方法
<130> 2017.02.24
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1983
<212> DNA
<213> 蔻氏隐甲藻
<400> 1
caagtgcagc tgctcttcca atcggctcag acaaggatct gcagtcgatt tcgtatcttc 60
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tcg 1983
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<212> PRT
<213> 寇氏隐甲藻
<400> 2
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