一种原代牙髓干细胞的制备方法及构建牙髓干细胞库的方法
技术领域
本发明具体涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种原代牙髓干细胞的制备方法及构建牙髓干细胞库的方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化能力的细胞，在特定条件下能向人体成熟组织、器官进行诱导分化，已被广泛应用于再生医学各个方面的研究。干细胞的来源主要为胚胎干细胞和间充质干细胞，其中胚胎干细胞由于涉及伦理学问题而限制其临床转化研究；间充质干细胞主要来源骨髓，即骨髓间充质干细胞，但其在临床转化研究过程中存在给供体造成侵入性损伤等缺点。自从2000年Gronthos等[GRONTHOS S，MANKANI M，BRAHIM J，et al.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and in vivo.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(25)：13625-13630.]从健康成人第三磨牙中发现牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)以来，以前作为口腔医疗废弃物的脱落牙齿和拔除智齿等已经“变废为宝”，成为DPSCs研究的主要来源。DPSCs是一种具有高度增殖能力和多向分化潜能的间充质干细胞，具有来源丰富、取材安全方便、不涉及伦理学问题、免疫原性低等优点，在再生医学领域取得了很大进展，具有广阔的应用前景。同时，DPSCs在适当条件下能被诱导分化为骨组织、软骨组织、脂肪组织、神经组织、肌组织、角膜等多种组织细胞，并能够被诱导为具有类胚胎干细胞特性的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，能够作为以后多种疾病临床转化研究中的种子细胞。目前，已有多个国家建立牙髓干细胞库以供临床治疗或科学研究需要。
牙髓干细胞库的构建过程包括牙髓干细胞培养、牙髓干细胞的传代以及牙髓干细胞冻存三部分。其中，牙髓干细胞的培养过程又分为牙体收集、牙体运输、牙髓组织提取以及干细胞的培养等，而在这个过程中的每一步都对最终获得牙髓干细胞的生物学活性有较大的影响。目前，对于牙髓组织的提取和培养过程，传统方法为组织块直接培养法和胶原酶消化培养法两种，但存在培养周期过长、细胞量较少、易导致分化以及消化不完全或消化过度等缺点。
传统酶消化法制备牙髓干细胞消化的时间为20min-3h不等，如专利人牙髓干细胞库的构建方法(CN 101717750 A)里面提到，从正畸或智齿来源的牙髓组织剪碎后利用胶原酶和分散酶在37℃，5％CO2环境中消化50min得到牙髓干细胞；专利一种临床用牙髓干细胞及其制备方法(CN 104694464 A)利用胶原酶和dispase II将牙髓组织消化1-3h得到牙髓干细胞；专利一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法及细胞复苏方法(CN 104630141 A)利用胰酶替代物消化牙髓组织20min得到牙髓干细胞。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种原代牙髓干细胞的制备方法及构建牙髓干细胞库的方法，可以在短时间内(≤10min)将牙髓组织消化好，提取到足够多的DPSCs。
本发明采用的技术解决方案是：一种原代牙髓干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)牙体收集；
(2)牙髓提取：将收集的离体牙进行前处理后提取牙髓；
(3)牙髓组织消化及干细胞培养：将提取的牙髓组织置于无菌PBS中，剪碎牙髓组织至1mm2，然后，利用离心管收集牙髓组织，并于常温条件下1000rpm，离心10min，弃上清，滴加3mg/mL I型胶原酶+4mg/mL中性蛋白酶混合酶吹散牙髓组织，I型胶原酶与中性蛋白酶体积比例为1∶1，置于37℃，180rpm恒温摇床环境中进行消化，5-10min后，滴加血清培养基终止消化，1000rpm条件下，离心处理5min收集组织块及细胞，1mL完全α-MEM培养基重悬，接种于35mm的无菌培养皿中，于37℃，5％CO2细胞培养箱中进行培养，1d后完全α-MEM培养基补液2mL，每隔3d更换一次α-MEM培养基；
(4)对牙髓干细胞进行传代处理。
所述的完全α-MEM培养基为10-20％FBS+100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素。
所述的步骤(2)牙髓提取中前处理为采用牙齿储存液冲洗离体牙的牙体2次，每次1min，然后利用1％聚维酮碘消毒液泡离体牙1min，最后再用牙齿储存液冲洗离体牙2次，每次1min。
所述的步骤(4)对牙髓干细胞进行传代处理步骤为：当牙髓细胞融合达到80％-90％时，用胰酶/EDTA混合酶进行消化，1000rpm条件下离心5min，收集细胞，用完全α-MEM培养基分散细胞，细胞悬液平均分配到2个细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养，每隔3d换液一次。
一种构建牙髓干细胞库的方法，包括以下步骤：
(1)牙体收集；
(2)牙体运输；
(3)牙髓提取；
(4)牙髓组织消化及干细胞培养；
(5)牙髓干细胞的传代；
(6)牙髓干细胞的生物学功能检测；
(7)牙髓干细胞的冻存和复苏。
所述的牙髓干细胞的生物学功能检测包括CCK-8检测、免疫荧光染色检测、成脂向分化检测、成骨向分化检测或成软骨向分化检测中的一种或几种。
所述的步骤(7)牙髓干细胞的冻存包括以下步骤：取符合标准对数生长期的牙髓干细胞，当细胞融合达到80％-90％时，用胰酶/EDTA混合酶进行消化，1000rpm条件下离心5min，收集细胞，用10％DMSO+90％FBS的细胞冻存液，调整细胞浓度为3×106个/mL，将细胞悬液1mL分别装入冻存管中，然后将冻存管依次编号放入细胞专用冻存盒中，以1℃/min速度降温，放入-80℃冰箱冻存12h，最后细胞冻存管转入液氮中进行长期贮存，并做好相应的登记。
所述的步骤(7)牙髓干细胞的复苏包括以下步骤：细胞冻存管从液氮中取出后，快速放入37℃水浴环境中进行解冻，然后用5mL的完全α-MEM培养基进行稀释，1000rpm条件下离心5min，收集细胞，用完全α-MEM培养基吹散，转入35-mm无菌细胞培养皿中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中进行培养，3天更换一次培养基。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种原代牙髓干细胞的制备方法及构建牙髓干细胞库的方法，利用恒温摇床在特定温度和转速条件下，可以在几分钟时间内将牙髓组织消化好，提取到足够多的具有较好生物学活性的牙髓干细胞，既缩短了牙髓干细胞原代提取的时间，节约了时间成本，可以大规模生产，同时获得的足量牙髓干细胞，能够满足牙髓干细胞在干细胞库的构建以及后期干细胞临床治疗以及再生医学研究领域的使用需求，与常规条件下牙髓组织半消化30min或全消化1h左右对照组相比，DPSCs量无明显统计学差异，但细胞增殖活性明显高于对照组。因此，本方法在DPSCs库的构建过程中可以成批快速进行，缩短了DPSCs原代提取的时间，节约了时间成本，适合于大规模生产。
说明书附图
图1为本发明牙髓组织的提取流程图。
图2为不同条件以及不同时间牙髓干细胞培养8d以及传代后第一代的光镜图片，其中TES代表在恒温摇床消化条件，TE代表半消化，E代表全消化。
图3为不同条件以及不同时间牙髓干细胞CCK-8检测结果，其中TES代表在恒温摇床消化条件，TE代表半消化，E代表全消化。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。
牙体收集
经患者提前预约和登记后，在指定的口腔医院门诊室收集拔除的无龋牙健康智齿(年龄≤30岁)。首先，利用无菌PBS缓冲液冲洗离体牙2次，每次1min；其次，利用无菌眼科弯镊仔细清理离体牙表面的残留软组织，并用无菌PBS缓冲液再次冲洗清理后的离体牙2次，每次1min；最后，利用75％酒精棉球擦拭离体牙2次，每次1min，然后置于含有4℃牙齿储存液的无菌牙齿收集管中，冰盒保存。
牙齿储存液配置：无菌PBS缓冲液+双抗(100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)，体积比例10∶1。
牙体运输
收集到的离体牙在2-4℃条件下，运送至干细胞实验室并于24h内提取牙髓组织。
牙髓提取
离体牙的前处理：首先，利用牙齿储存液冲洗离体牙的牙体2次，每次1min；然后，利用1％聚维酮碘消毒液(PVP-I)浸泡离体牙1min；最后，再用牙齿储存液冲洗离体牙2次，每次1min。
牙髓提取：首先，利用牙科环形裂钻环切牙体牙颈部(不暴露牙髓)；然后，利用无菌纱布包裹牙体，将牙体分离，暴露牙髓，置于含有牙齿储存液的培养皿中；最后，利用探针、镊子等医疗器械分离牙髓，置于无菌PBS中，如图1所示。
牙髓组织消化及干细胞培养
将提取的牙髓组织置于无菌PBS中，使用显微眼科剪，剪碎牙髓组织(大小约1mm2)；然后，利用离心管收集牙髓组织，并于常温条件下1000rpm，离心10min。弃上清，滴加3mg/mL I型胶原酶+4mg/mL中性蛋白酶混合酶(体积比例为1∶1)吹散牙髓组织，置于37℃，180rpm恒温摇床环境中进行消化。分别于5、10、15以及20min后，滴加血清培养基终止消化，离心收集组织块及细胞(1000rpm，5min)，1mL完全α-MEM培养基(20％FBS+100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)重悬，接种于35-mm的无菌培养皿中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中进行培养，1d后补液2mL，每隔3d更换一次培养基。其中，牙髓组织在37℃恒温环境中半消化30min和全消化60min(细胞悬液利用70um细胞筛过滤)作为对照组，其他培养条件与实验组一致，实验结果如图2所示。
牙髓干细胞的传代
当细胞融合达到80％-90％时，用胰酶/EDTA混合酶进行消化，离心(1000rpm，5min)，收集细胞，用完全α-MEM培养基分散细胞，细胞悬液平均分配到2个细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养，每隔3d换液一次。
牙髓干细胞的生物学功能检测
CCK-8检测：选取生长状态较好的P1代牙髓干细胞，调整细胞浓度为2.0×103接种于96-孔细胞培养板中，加入复苏培养液，放入37℃，5％C02培养箱中进行培养，每隔3d更换一次培养基。分别于培养后1，3和5d，每孔加入10μL的CCK-8溶液，放入细胞培养箱中继续培养1h，然后在酶标仪上观察450nm处的吸光度值(0D值)，结果如图3所示，TES为10min，牙髓干细胞的增殖活性明显高于其他实验组和对照组，有明显统计学差异(*P＜0.05versus TE 30min，#P＜0.05versus E 60min)。
免疫荧光染色：将恒温摇床条件下消化10min的P3代牙髓干细胞接种于六孔板爬片上，培养结束后，4％多聚甲醛固定30min，BSA联合0.1TritonX-100破膜封闭30min；CD146，STRO-1一抗4℃孵育过夜；PBST冲洗3次，二抗避光孵育1h，PBST冲洗3次，DAPI避光孵育5min，PBST冲洗3次；荧光显微镜观察拍片。
成脂向分化：选取对数生长期的P3代牙髓干细胞(恒温摇床条件下消化10min)，常规消化，所得的细胞悬液按照20000个/cm2的密度接种于六孔板中，滴加完全α-MEM培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养，每隔3d换液一次，当细胞融合度达到100％左右时，在完全α-MEM细胞培养基中加入OriCellTM成脂诱导剂(Cyagen，USA)，放入CO2细胞培养箱中进行培养，每隔3d更换一次含有成脂诱导剂的细胞培养基。细胞连续培养21d后，终止诱导，4％多聚甲醛(PFA)固定10min，油红-O染色剂染色，光学显微镜观察。
成骨向分化：选取对数生长期的P3代牙髓干细胞(恒温摇床条件下消化10min)，常规消化，所得的细胞悬液按照20000个/cm2的密度接种于35-mm的细胞培养皿中，滴加完全α-MEM培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养，当细胞融合度达到70％左右时，在完全α-MEM细胞培养基中加入OriCellTM成骨诱导剂(Cyagen，USA)，放入CO2细胞培养箱中进行培养，每隔3d更换一次含有成骨诱导剂的细胞培养基。细胞连续培养21d后，终止诱导，室温条件下，4％多聚甲醛(PFA)固定10min，茜素红-S染色剂染色3min，光学显微镜观察。
成软骨向分化：选取对数生长期的P3代牙髓干细胞(恒温摇床条件下消化10min)，常规消化，调整细胞悬液浓度为5×105个/mL，取1mL细胞悬液放入15mL离心管中，常温离心(1000rpm，5min)收集细胞，弃上清，在该离心管中直接加入含有OriCellTM成软骨诱导剂(Cyagen，USA)的完全α-MEM细胞培养基(加入过程必须缓慢，以免冲散细胞)，细胞以细胞团的形式放入37℃，5％CO2培养箱中进行培养，每隔3d换液一次。28d后，终止诱导，4％多聚甲醛(PFA)固定过夜，石蜡包埋切片(4-5μm)，阿尔新蓝染色剂染色，光学显微镜观察。
牙髓干细胞的冻存和复苏
牙髓干细胞的冻存：取符合标准对数生长期的牙髓干细胞，当细胞融合达到80％-90％时，用胰酶/EDTA混合酶进行消化，离心(1000rpm，5min)，收集细胞，用细胞冻存液(10％DMSO+90％FBS)调整细胞浓度为3×106个/mL，将细胞悬液1mL分别装入冻存管(1.5mL)中，然后将冻存管依次编号放入细胞专用冻存盒(温度下降速度：1℃/min)中，放入-80℃冰箱冻存12h，最后细胞冻存管转入液氮中进行长期贮存，并做好相应的登记。
牙髓干细胞的复苏：实行快速复苏的原则，细胞冻存管从液氮中取出后，快速放入37℃水浴环境中进行解冻，然后用5mL的完全α-MEM培养基进行稀释，离心(1000rpm，5min)，收集细胞，用完全α-MEM培养基吹散，转入35-mm无菌细胞培养皿中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中进行培养，3天更换一次培养基。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
