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基于体外反应体系筛选黄曲霉SUMO化靶蛋白的方法

2021-04-08 13:18:55

基于体外反应体系筛选黄曲霉SUMO化靶蛋白的方法

　　技术领域

　　本发明属于微生物学领域和生物技术领域，具体涉及基于体外反应体系筛选黄曲霉SUMO化靶蛋白的方法。

　　背景技术

　　许多可逆的翻译后修饰如磷酸化、糖基化、泛素化、SUMO（small ubiquitin-related modifier）化等，被认为可能是联接遗传背景、环境因子两大因素的重要桥梁之一，介导两者的复杂交互作用，最终影响生物的性状。作为一种非常重要的蛋白翻译后修饰，SUMO化修饰可能会影响靶蛋白的稳定性、细胞定位和蛋白活性。SUMO蛋白首先在酿酒酵母里被发现，SUMO化过程和泛素化过程很类似。首先由E1活化酶Aos1-Uba2活化SUMO，之后由E1转移到E2结合酶Ubc9的Cys残基上，最后Ubc9在E3连接酶的帮助下把SUMO转移到靶蛋白的Lys残基上，完成SUMO化修饰。目前已知SUMO化的E1和E2都是唯一的，但E3酶一般有多个，不同的E3具有不同的底物特异性。

　　目前国内外对SUMO化修饰的研究正开展得如火如荼，但曲霉属的生物只有构巢曲霉和黄曲霉（Aspergillus flavus）有相关报道。我们在黄曲霉中发现AfsumO基因，证明黄曲霉存在SUMO化修饰，且该修饰对黄曲霉对环境压力的应答、产孢量、菌核数、产毒和侵染种子的致病性都有显著影响。但目前还未在黄曲霉中发现SUMO化的靶标蛋白，SUMO化修饰对黄曲霉生长发育和产毒的调控机制还是未知的。因此，筛选SUMO化靶标蛋白，分析这些靶标蛋白的调控网络，对研究SUMO化修饰对黄曲霉生长发育和产毒的调控机制是很有帮助的。然而黄曲霉是多细胞的丝状真菌，利用已有的遗传操作手段在其体内筛选、验证SUMO化靶标蛋白难度较大。

　　依据现有相关资料分析，目前SUMO化靶标蛋白的筛选方法主要是利用针对SUMO的免疫共沉淀、串联亲和纯化等手段，直接分析真核细胞/组织裂解物中的带有SUMO蛋白的复合物，利用质谱分析复合物中的SUMO化靶标蛋白，其难度和缺陷主要在于：1、SUMO化修饰本身是一个双向的、动态、具有时空性的过程，即靶标蛋白携带SUMO修饰的过程是不稳定的（SUMO化靶标蛋白会被SUMO化特异蛋白酶催化发生去SUMO化），因此现有的直接分析真核细胞/组织裂解物中的SUMO化靶标的方法其分析的SUMO化蛋白的信息是一个瞬时的信息，许多发生去SUMO化的蛋白无法被筛选分析；2、真核细胞中各种蛋白的丰度是不平均的，现有的针对蛋白质的分析手段，极有可能丢失一些低丰度蛋白的信息；3、目前的质谱技术虽然技术精度越来越高，但最终的蛋白鉴定仍基于蛋白数据库的分析，这对一些遗传背景不清晰的非模式生物来说，最终蛋白鉴定的成功率和准确性可能会受到限制，对一些同源比对得分不高即无法鉴定的蛋白，不能进行进一步分析。

　　发明人经过广泛研究，在黄曲霉中分离和克隆了SUMO化修饰酶系基因，并进行原核表达和分离纯化，构建了黄曲霉的体外SUMO化反应体系。利用该体系一方面可以快速鉴定/筛选影响黄曲霉SUMO化修饰过程的药物分子或小分子化合物；同时利用该体系可以在体外方便快速的检测某种蛋白是否能被黄曲霉的SUMO化体系修饰，进而鉴定/筛选潜在的SUMO化靶标蛋白。在此基础上，同时针对现有的技术的缺陷，本发明还公开了一种利用SUMO化体外反应体系结合表面展示技术，在体外快速筛选、验证黄曲霉SUMO化靶标蛋白的技术体系和流程，我们将SUMO蛋白进行固定化处理（固相界面或微球），利用上述体外SUMO化反应体系，同时结合蛋白体外表面展示技术（如噬菌体表面展示技术、大肠杆菌表面展示技术、酵母表面展示技术、核糖体表面展示技术、mRNA展示技术等）体外筛选带有SUMO蛋白的复合物，并通过分析其藕联的遗传物质信息，鉴定潜在的SUMO化靶标蛋白。该筛选分析体系的主要技术特点在于：1、本体系是完全的体外反应体系，相对真核细胞/组织裂解物条件更为可控，特别是体系中完全排除了SUMO化特异蛋白酶，因此SUMO化靶标蛋白的稳定性增加，检出率大大提升；2、本体系分析的通量可控，待检测蛋白可以根据需要，从几个、几十个到整个蛋白组（全cDNA文库）；3、本体系利用体外异源表达待检测蛋白，一定程度上克服了其在真核细胞/组织中的表达丰度限制，因此受限于丰度的潜在SUMO化靶标蛋白的检出率大大提升，同时也降低了高丰度造成的背景噪声；4、本体系筛选利用的表面展示体外筛选技术，都有针对核酸的转录/反转录和PCR放大过程，这更保证的一些极低丰度靶标的检出率；5、本体系中SUMO蛋白的复合物的鉴定，不是通过质谱技术，而是直接分析复合物藕联的核酸信息，相对于现有的蛋白质数据库，核酸数据库的规模更为丰富，因此信息鉴定的成功率和准确性更高。即使没有鉴定成功，只利用核酸信息，我们也可以继续进行下一步的鉴定验证工作，进而发现一些无背景的新基因。可见本体系针对性的克服了现有技术的缺陷，大大提高了SUMO化靶标蛋白筛选的分析通量规模和分析鉴定的成功率。

　　综上本发明公开了一种可在体外进行的黄曲霉SUMO化酶系反应体系，利用该体系一方面可以快速鉴定/筛选黄曲霉SUMO化修饰过程的激动剂和抑制剂，为开发新型的黄曲霉防治药物提供新的思路和技术平台；同时利用该体系可以在体外方便快速的检测某种蛋白是否能被黄曲霉的SUMO化体系修饰，进而鉴定/筛选潜在的SUMO化靶标蛋白。此外，本发明还利用该体外反应体系，结合表面展示技术，建立了一套在体外快速筛选、验证黄曲霉SUMO化靶标蛋白的技术体系和流程，本体系将大大提高黄曲霉乃至整个真核细胞中SUMO化蛋白靶标筛选的通量及成功率。

　　发明内容

　　本发明的目的在于提供基于体外反应体系筛选黄曲霉SUMO化靶蛋白的方法。

　　本发明提供的黄曲霉SUMO化体外反应体系其中包含了原核表达的黄曲霉SUMO化酶系中的修饰分子AfSumO，SUMO E1活化酶AfAosA-AfUbaB，SUMO E2结合酶AfUbcI，SUMO E3连接酶以及待检测的蛋白或药物。

　　在合适的体外反应条件下，在无待检测蛋白加入或加入的待检测蛋白未发生SUMO化修饰时，修饰物SumO将在SUMO化酶系的作用下重复自连，利用变性蛋白电泳或免疫印迹分析，结果展现为自SumO单体、二聚体至多聚体的分子量倍比“阶梯式”的蛋白带型；若待检测蛋白未发生SUMO化修饰，但会激活或抑制SUMO化酶系的活性，结果展现为上述这种SumO分子量倍比“阶梯式”蛋白带型的强度发生增强或减弱；若待检测蛋白发生SUMO化修饰，则会发生循环式的SumO连接至待检测蛋白上，利用变性蛋白电泳或免疫印迹分析，结果展现出自待检测蛋白分子量而向上的、典型的“阶梯式”的SUMO化修饰带型。

　　所述的SUMO化反应溶液体系含有如下成分：10-100 mM HEPES (pH 7.0-7.4)，0-300 mM NaCl，5-20 mM MgCl2，0-0.5 mM dithiothreitol，0-50μg/mL bovine serum albumin (Fraction V)，1-20 mM ATP，0.1-50 μg/mL重组AfSumO，0.1-50 μg/mL重组AfUbaB，0.1-50 μg/mL重组AfAosA，0.1-50 μg/mL重组AfUbcI以及0.1-50 μg/mL重组E3连接酶。

　　所述的SUMO化体外反应条件如下：4-37℃下反应5至120min。

　　所述的待检测物根据用途可包括：

　　（1）各种潜在的黄曲霉SUMO化反应的抑制剂和激动剂，可来自但不限于以下物质：化学合成或天然来源的小分子化合物及其类似物和衍生物、多肽或蛋白质。

　　（2）黄曲霉自身的组成型或条件诱导型的基因表达产物，可用于筛选其体内潜在的SUMO化修饰靶点蛋白。

　　所述的SUMO化酶系中的修饰分子AfSumO，其编码序列选自：

　　（1）核酸序列SEQ ID No. 1，编码蛋白序列SEQ ID No. 2；或

　　（2）在上述（1）限定的序列中通过密码子简并取代，或一个或几个氨基酸取代、缺失或插入，且具有其对应体内功能的由（1）限定序列所衍生的蛋白或多肽。

　　所述的SUMO E1活化酶AfAosA及AfUbaB，其编码序列分别选自：

　　（1）核苷酸序列SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4，编码蛋白序列SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6；或

　　所述的SUMO E2结合酶AfUbcI，其编码序列选自：

　　（1）核苷酸序列SEQ ID No. 7，编码蛋白序列SEQ ID No. 8；或

　　所述的SUMO E3连接酶选自但不限于以下黄曲霉中具备SUMO E3连接酶活性的基因表达产物：AfSizA、AfSizB、AfZipC、AfMMS21等，本发明的具体实施例选取AfSizA，其编码序列选自：

　　（1）核苷酸序列SEQ ID No. 9，编码蛋白序列SEQ ID No. 10；或

　　所述的黄曲霉SUMO化体外反应体系中的修饰分子AfSumO，SUMO E1活化酶AfAosA-AfUbaB，SUMO E2结合酶AfUbcI，SUMO E3连接酶AfSizA，都是将其编码序列克隆入原核表达载体进行原核表达，并利用载体上的亲和标签进行纯化获得的具备相应体内活性的高纯度重组蛋白。

　　所述的原核表达系统选自但不限于以下表达系统：lac、tac、T7、T7-lac、T5、CspA和阿拉伯糖诱导系统。

　　所述的原核表达所用的亲和标签选自但不限于以下标签：His6 tag、StrepII tag、T7 tag、Trx tag、GST tag、MBP tag、NusA tag、TF2 tag、DsbA tag、DsbC tag、Avi Tag、calmodulin binding protein tag、HA tag、flag tag、Myc tag及Chitin binding domain tag。

　　本发明还有一个目的在于，提供一种在体外快速筛选、验证黄曲霉SUMO化靶标蛋白的技术体系和流程及其应用。

　　本发明提供的一种筛选SUMO化靶标蛋白的方法，基于本发明的SUMO化体外反应体系，并结合体外展示技术，可在体外对潜在的SUMO化靶标进行不同通量的筛选及鉴定。

　　本发明提供的一种筛选SUMO化靶标蛋白的方法，利用SUMO化酶系中的修饰物SumO的亲和标签和其对应的亲和纯化介质，对体外反应体系中发生SUMO化修饰的蛋白及其偶联的遗传信息，进行富集和淘选。

　　本发明提供的一种筛选SUMO化靶标蛋白的方法，结合体外展示技术，在筛选SUMO化靶标蛋白的同时，也对靶标蛋白的遗传信息进行富集和淘选。其中所述的体外展示技术选自但不限于以下技术：噬菌体表面展示、大肠杆菌表面展示、酵母表面展示、哺乳动物细胞表面展示、核糖体表面展示及mRNA表面展示系统。

　　所述的一种筛选SUMO化靶标蛋白的方法主要包括：

　　（1）不同通量的待检测蛋白的表面展示文库构建；

　　（2）表面展示文库与SUMO化体外反应体系共同反应；

　　（3）利用SUMO化酶系中的修饰物SumO的亲和标签所对应的亲和介质，对体外反应体系中的游离SumO和发生SUMO化修饰的蛋白及其偶联的遗传信息进行富集和多轮淘选；

　　（4）通过检测筛选的SUMO化修饰的蛋白所偶联的遗传信息，鉴定潜在的SUMO化靶标蛋白。

　　本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

　　本发明的优点在于：

　　目前SUMO化靶标蛋白的筛选方法主要是利用针对SUMO的免疫共沉淀、串联亲和纯化等手段，而本发明客服了上述技术的在SUMO化靶标蛋白筛选中的几个主要缺点和限制：

　　1、本体系是完全的体外反应体系，相对真核细胞/组织裂解物条件更为可控，特别是体系中完全排除了SUMO化特异蛋白酶，因此SUMO化靶标蛋白的稳定性增加，检出率大大提升；

　　2、本体系分析的通量可控，待检测蛋白可以根据需要，从几个、几十个到整个蛋白组（全cDNA文库）；

　　3、本体系利用体外异源表达待检测蛋白，一定程度上克服了其在真核细胞/组织中的表达丰度限制，因此受限于丰度的潜在SUMO化靶标蛋白的检出率大大提升，同时也降低了高丰度造成的背景噪声；

　　4、本体系筛选利用的表面展示体外筛选技术，都有针对核酸的转录/反转录和PCR放大过程，这更保证的一些极低丰度靶标的检出率；

　　5、本体系中SUMO蛋白的复合物的鉴定，不是通过质谱技术，而是直接分析复合物藕联的核酸信息，相对于现有的蛋白质数据库，核酸数据库的规模更为丰富，因此信息鉴定的成功率和准确性更高。即使没有鉴定成功，只利用核酸信息，我们也可以继续进行下一步的鉴定验证工作，进而发现一些无背景的新基因。

　　可见本体系针对性的克服了现有技术的缺陷，大大提高了SUMO化靶标蛋白筛选的分析通量规模和分析鉴定的成功率。

　　附图说明

　　图1为本发明中黄曲霉AfSumO、AfUbaB、AfAosA、AfUbcI和AfSizA原核表达菌株的诱导表达前后的SDS-PAGE电泳图，图中泳道M表示蛋白分子量标识，N表示诱导前的全菌蛋白，而I表示诱导后的全菌蛋白。

　　图2为本发明中SUMO化体外反应体系的最终免疫印迹分析结果，图中monomer、dimer、trimer和polymer ladder分别指示AfSumO的单体、二聚体、三聚体和多聚体印迹。

　　图3展示了本发明建立的新型SUMO化靶标蛋白体外筛选鉴定技术体系的效率验证结果，其中M指示DNA分子量标识，1st、2nd和3rd分别指示第1、2、3轮筛选后的PCR扩增结果。

　　具体实施方式

　　如本文所用，基因用斜体表示，蛋白用正体表示。

　　如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

　　如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

　　本发明涉及的蛋白应理解为包含与天然来源的黄曲霉蛋白一级序列一致的蛋白及其衍生形式。本发明涉及蛋白的衍生形式包括（但并不限于）：一个或多个（通常为1-50个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个（通常为1-600个）氨基酸。例如，才本领域中，用性质相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，通常也不会改变原本蛋白的性质，例如本发明的蛋白可在N端和C端融合各种亲和标签，但并未改变蛋白本体的催化和结合活性。

　　可采用辐射或化学诱变技术来产生随机突变，也可通过定点诱变或其他已知分子生物学手段获得上述蛋白衍生形式。

　　以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

　　下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等人编著的《分子克隆：实验室手册》（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或试剂生产商推荐的条件进行。

　　以下实施例使用材料来源如下：

　　Trizol Reagent，Superscript III cDNA systhesis Kit，Phusion DNA polymerase，rTaq DNA polymerase，Restriction endonuclease，Ni-NTA agarose，Human Factor X Native Protein购自Invitrogen；

　　pColdI为Takara公司产品，可在冷激条件下，通过CspA启动子作用下启动目的基因转录表达，经亲和标签纯化后，利用Factor X移去亲和标签；核糖体展示载体pRDV为本室改造保存。

　　大肠杆菌JM109购自TaKaRa，C41(DE3)购自Lucigen；

　　Mouse anti-His6 Monoclonal antibody和HRP-conjugated Goat anti Mouse IgG (H+L)购自Sigma- aldrich；

　　S30 T7 High-Yield Protein Expression System购自Promega；

　　BeaverBeads™ His-tag Protein Purification磁珠购自Beaver；

　　其他常规化学试剂购自上海生工。

　　实施例1：黄曲霉SUMO化修饰酶系克隆及原核表达载体的构建

　　发明人通过搜索The Fungal and Oomycete Genomics Resource数据库（http://fungidb.org/fungidb/），利用生物信息学比较分析，在黄曲霉的基因组序列中发现与酿酒酵母、构巢曲霉的SUMO化修饰酶系基因具有较高的同源性的基因，分别命名为黄曲霉AfsumO、AfaosA、 AfubaB、AfubcI和AfsizA基因（其编码区核酸序列及氨基酸序列如SEQ ID NO.1-10所示）。本发明人通过RT-PCR技术从黄曲霉的cDNA中扩增出AfsumO、AfaosA、AfubaB、AfubcI和AfsizA编码区片段，将之克隆入表达载体pColdI中，为原核表达纯化黄曲霉SUMO化修饰酶系的蛋白组分做好准备。

　　具体步骤和条件如下：

　　1、黄曲霉总RNA提取及cDNA合成：接种黄曲霉新鲜孢子于马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB），180rpm，30℃培养过夜；过滤收集并干燥菌丝，液氮研磨成粉末，并参照Tritol试剂的说明书提取黄曲霉总RNA；获得的RNA沉淀干燥后用无核酸酶的水溶解，并用琼脂糖凝胶电泳检测抽提的总RNA的质量和浓度。cDNA合成参照Thermo Scientific RevertAcid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书。

　　2、AfsumO、AfaosA、AfubaB、AfubcI和AfsizA基因编码区扩增：

　　引物设计:

　　AfsumO（Forward: 5’-ATACATATGATGGCCGATGCAGGACT-3’, Reverse: 5’-ATTGGATCCTTAACCACCGATCTGCTCCT-3’）;

　　AfaosA（Forward: 5’-ATACATATGATGGAGCCACAAAGCAATAC-3’, Reverse: 5’-ATTGGATCCTTAGACGCTTGCTCCTGAGG-3’）;

　　AfubaB（Forward: 5’-ATACATATGATGCCGCGAGACACCTACT-3’, Reverse: 5’-ATTGGATCCTCAGTCGTCAATGAGAATCG-3’）;

　　AfubcI（Forward: 5’-ATACATATGATGTCTCTGTGTCTTAATCGCCT-3’, Reverse: 5’-ATTGGATCCTCAAAGCGTTGGGTTCTC-3’）;

　　AfsizA（Forward: 5’-ATACATATGATGGCCTCTGTTGGCCA-3’, Reverse: 5’-ATTGGATCCTTATGCATTATAGCCAGTTGTTTG-3’）;

　　PCR扩增编码区序列：以上述黄曲霉cDNA为模板，利用Phusion DNA polymerase和相应引物PCR扩增基因编码序列，具体程序参照试剂说明书；

　　琼脂糖凝胶分离并切胶回收相应扩增片段；

　　3、AfsumO、AfaosA、AfubaB、AfubcI和AfsizA基因编码区克隆原核表达载体构建：

　　将上述基因扩增片段与pColdI载体同时进行Nde I和BamH I双酶切， 37℃反应2hr；分别切胶回收AfsumO、AfaosA、AfubaB、AfubcI和AfsizA基因编码区和pColdI载体的双酶切产物，利用T4连接酶16℃连接1hr后，转化大肠杆菌JM109；菌落PCR鉴定阳性克隆，进一步测序鉴定，最终获得AfsumO、AfaosA、AfubaB、AfubcI和AfsizA基因的原核表达载体pCold-AfsumO、pCold-AfubaB、pCold-AfaosA、pCold-AfubcI和pCold-AfsizA。

　　实施例2：黄曲霉SUMO化修饰酶系的原核表达；

　　将实施例1中构建的黄曲霉SUMO化修饰酶系的原核表达载体，转化入大肠杆菌表达菌株中，获得黄曲霉SUMO化修饰酶系的原核表达菌株。通过冷激诱导表达，Ni柱纯化，获得了纯化的重组黄曲霉SUMO化修饰酶系AfSumO、AfAosA、AfUbaB、AfUbcI和AfSizA。

　　具体步骤和条件如下：

　　1、黄曲霉SUMO化修饰酶系的原核表达菌株构建：将上述原核表达载体pCold-AfsumO、pCold-AfaosA、pCold-AfubaB、pCold-AfubcI和pCold-AfsizA转化入大肠杆菌C41(DE3)，获得相应基因的原核表达菌株；

　　2、黄曲霉SUMO化修饰酶系的诱导表达：将上述原核表达菌株接种至LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.4-0.5，15℃冷激30min，加入IPTG至终浓度0.3mM，15℃诱导表达12-24hr，取小样检查表达情况（如附图1所示，所有基因在12hr就达到一定规模表达量）；

　　3、重组黄曲霉SUMO化修饰酶系的亲和纯化：参照Ni-NTA agarose说明书进行；

　　4、重组黄曲霉SUMO化修饰酶系亲和标签的去除：参照Human Factor X Native Protein说明书进行。

　　实施例3：黄曲霉的体外SUMO化反应

　　使用实施例2中获得的重组黄曲霉SUMO化修饰酶系组分，进行SUMO化体外反应，具体步骤和条件如下：

　　溶液体系为如下成分的混合液：50 mM HEPES (pH 7.2)，100 mM NaCl，10 mM MgCl2，0.1 mM dithiothreitol，10 mM ATP，50 μg/mL重组AfSumO （未去His6-tag），10 μg/mL重组AfAosA（去His6-tag），10 μg/mL重组AfUbaB（去His6-tag），10 μg/mL重组AfUbcI（去His6-tag）以及10 μg/mL重组AfSizA（去His6-tag）。30℃下反应30min。

　　反应产物马上进行SDS-PAGE分离，转膜和免疫印迹分析，一、二级抗体使用分别使用Mouse anti-His6 Monoclonal antibody和HRP-conjugated Goat anti Mouse IgG (H+L)，结果如附图2所示，出现典型的AfSumO分子量倍比“阶梯式”蛋白带型。

　　实施例4：黄曲霉体外SUMO化体系与核糖体表面展示结合筛选SUMO化靶标蛋白的效率验证

　　为了验证本发明建立的SUMO化靶标蛋白体外筛选鉴定技术体系的效率，发明人选取核糖体展示技术与实施例3中的SUMO化体外反应体系结合，利用黄曲霉中SizA特异的SUMO化靶标蛋白septin（AfAspA）作为阳性对照，以AfAspA(K322R)（SUMO化修饰位点突变）突变体作为背景参照，对体外SUMO化靶标蛋白筛选鉴定技术的效率进行了测试，具体步骤和条件如下

　　1、通过搜索The Fungal and Oomycete Genomics Resource数据库（http://fungidb.org/fungidb/），利用生物信息学比较分析，在黄曲霉的基因组序列中发现与酿酒酵母、构巢曲霉的septin基因具有较高的同源性的基因，分别命名为黄曲霉AfaspA基因（其编码区核酸序列和蛋白序列分别为SEQ ID NO.11、12）。通过RT-PCR技术从黄曲霉的cDNA中扩增出AfAspA编码区片段，将之克隆入核糖体展示载体pRDV中，并利用site-directed mutagenesis Kit对其322位氨基酸编码区（AAG, K）突变为（AGG，R），构建了的背景参照片段的核糖体展示载体pRDV-mAfaspA（突变体序列为SEQ ID NO.13）。同时我们将原始的AfAspA编码区片段与大肠杆菌NusA编码区通过overlap-PCR进行融合，克隆入pRDV中，构建了SUMO化修饰的阳性片段的核糖体展示载体pRDV-nusA-AfsapA。

　　2、将pRDV-gfp-AfsapA和pRDV-mAfaspA按摩尔比1：1000混合当作模板；

　　3、参照S30 T7 High-Yield Protein Expression System说明书进行体外转录和翻译；

　　4、将步骤2中的转录翻译产物加入SUMO化体外反应体系（条件同实施例3），4℃下反应1hr；

　　5、加入BeaverBeads™ His-tag Protein Purification磁珠4℃下反应30min，富集带有His标签的AfSumO以及SUMO化靶标蛋白，磁性分离后，预冷的RNase-free的PBST漂洗磁珠3次；

　　6、加入0.1M EDTA溶解结合产物，利用Trizol Reagent纯化其中的RNA，反转录后利用pRDV通用引物PCR扩增筛选片段，将筛选片段再次克隆入pRDV，重复步骤3-6。每次筛选通过扩增片段的琼脂糖凝胶电泳可观察筛选效率（阳性片段比背景片段大～1500bp）。最终我们通过仅3轮筛选，发现可将1/1000的阳性模板筛选出来，而背景片段则被完全筛掉（如附图3所示）。

　　以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

　　SEQUENCE LISTING

　　<110> 福建农林大学

　　<120> 基于体外反应体系筛选黄曲霉SUMO化靶蛋白的方法

　　<130> 23

　　<160> 23

　　<170> PatentIn version 3.3

　　<210> 1

　　<211> 279

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<400> 1

　　atggccgatg caggactccc cactggcgat gcccctgctc ccgttgagca tctcagtatc 60

　　aaagtgaccg acaacaacaa tgaagtcttc ttcaagatca agcgttcgac gcagctcaag 120

　　aagctgatgg acgcgttctg tgagcgtcaa gggaagcaga tctccactgt ccgtttcttg 180

　　ttcgacggaa ctcgtgtacg cccggaagac acgccagaca ctctggagat ggccgacggc 240

　　gataccttgg aagttcacca ggagcagatc ggtggttaa 279

　　<210> 2

　　<211> 92

　　<212> PRT

　　<213> 人工序列

　　<400> 2

　　Met Ala Asp Ala Gly Leu Pro Thr Gly Asp Ala Pro Ala Pro Val Glu

　　1 5 1015

　　His Leu Ser Ile Lys Val Thr Asp Asn Asn Asn Glu Val Phe Phe Lys

　　202530

　　Ile Lys Arg Ser Thr Gln Leu Lys Lys Leu Met Asp Ala Phe Cys Glu

　　354045

　　Arg Gln Gly Lys Gln Ile Ser Thr Val Arg Phe Leu Phe Asp Gly Thr

　　505560

　　Arg Val Arg Pro Glu Asp Thr Pro Asp Thr Leu Glu Met Ala Asp Gly

　　65707580

　　Asp Thr Leu Glu Val His Gln Glu Gln Ile Gly Gly

　　8590

　　<210> 3

　　<211> 1185

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<400> 3

　　atggagccac aaagcaatac agctcagtct atcagtgcag atgagatcgc cttgtatgat 60

　　cgccagatcc gtctttgggg tgtgaaagct caggaaaagc tacgatcggc gaatatactt 120

　　ctaattacct ttaaggcatt ggcaaatgaa gttgctaaga acctcgttct cgctggtatc 180

　　ggcacactga caattgttga ccatgagacc gtcaaggagg aagatttggg cgcccaattt 240

　　ttcgtcacgg aagaacacaa agggcagaat cgcgcgcaag cggcagcctc ctcaatacat 300

　　gcaatgaacc caagagttca gcttcggatc gatacagatg acatacacac gaagcaaccc 360

　　gacttttttg cacaattcga tgtcatcatt gcgacagagt tggacttcgc aatgtacacc 420

　　accataaatg cggcatgccg catcgcaaat cgtccattct acgcagcagg gctgcacggg 480

　　ttctacgggt tcgtattcgc agatctaatc tcacacgatt ttgttatcga acgatccaag 540

　　tcaaacgtcc cttcggctac ccaagagact ccgacgcgga gcatagttaa tatcacgacg 600

　　aagaaggaaa acgagaaagt tatcgagatg gttaccaagc gagagacata ctcgcctctg 660

　　attttggcaa atacatctcc cctcccggaa gacttcactc gtctgccacg gaaacggcga 720

　　caggtcaccc cactccttac ttgtctccga gcactgtggg agtttcaaaa gctatccgga 780

　　ggctgtatgc caactttctc tcgtcaagac ctggagctct tcactaaact cgcccgtgat 840

　　ggccatcaag aattgaaact ggatattagt accctcgact cggaattctt gcgcaccttc 900

　　ttgcagaatc tcggaagtga actaagcccc gttgccgccg ttgtcggtgg taagctagcc 960

　　caggacgtga tcaatgtatt gagcgtcaga gagcaaccta tacagaacct cttgctcttt 1020

　　gacggcgaaa agtccatcgc tcctatctac cccttacacc catttttccc tccggaagtt 1080

　　gagaatgcca tgcccgtcat tcatcctgct gcgaactcaa tccctttgaa cggcgatctt 1140

　　actttgcaac aaccaattat tcctccctca ggagcaagcg tctga 1185

　　<210> 4

　　<211> 1845

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<400> 4

　　atgccgcgag acacctactc caagcgctcg ctcgggacct tgtccagacg cttaaaagag 60

　　tcgcgcgtac tcctcgtggg cgccggtggt atcggctgcg agctgctaaa gaacctcttg 120

　　ctctctgggt tcggcgaaat ccacatcatc gatcttgata ccatcgacct gagcaatttg 180

　　aatcgtcagt ttctcttccg ctttgaacac attaaaaaat caaaggcatt ggtcgcgaag 240

　　gaagttgccc aaaagttcca accaagcgca aagctcgagg cctatcatgc gaacatcaag 300

　　gatagccgtt tcaacgtgga ttggttcgcg actttcgacg tggtcttcaa tgcgcttgac 360

　　aacctagacg cccgtcgtca tgtcaacagg atgtgtctag cggctgatgt gccattgatc 420

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　　tgctacgatt gcaactcgaa ggaagtcccc aagtcattcc cagtatgcac tatccgcagt 540

　　acaccgagcc aacctattca ttgtatcgtc tgggcgaaaa gctatctttt ccccgagctt 600

　　tttgggacaa gtgaggacga gacgccagag ttggatagta ctgaagatgt caataatgcg 660

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　　ggctcccctg aattcgctca caaagtattc acaaaggttt tcaaggagga catagaccga 780

　　ctacgtggta tggaggatat gtggaagatg cggaaggccc cggaacccct ggactttgag 840

　　aagatacagg aagagacttc gacaattgag cctacaattt cctgtaacga tcaaaaagtc 900

　　tggactttgg ccgaggactt ggtcgttttt aaggacagct tggatcgact gagtaaaagg 960

　　ttgaagacac ttctagatac aacaaagagc gacgtcaaac ccatcctagt gtttgataag 1020

　　gacgatgtgg atacgctgga ctttgtcacc gctagtgcta acctgcgagc gacgatattc 1080

　　ggaattgagc ccaaatcaaa gtttgacacg aaacagatgg ccggtaatat cataccagca 1140

　　atcgcgacca caaacgctat gactgctggt ctctgtgttc tacaggcatt caaggtcttg 1200

　　aaggatgact acgcgcatgc caaaatgatc ttcctcgaac ggtcgggtgc ccgtgcaatc 1260

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　　agggtcaaga ttgacccgga gcgggccacc ataaacgact tggtgcagga tgtcctccgc 1380

　　ttacagctag ggtacggcga agagctttca gtcagcaacg agctgggcac aatttatgac 1440

　　cctgacctcg aagataactt aactaagaag ttatcggaac tgggtgtaag caatgaaagc 1500

　　ctcataacga ttatagacga ggaggatgaa caaccgcgtg tgaaccttga actagttgtt 1560

　　gtgactgaga agcccgaatc ctcaacagga gaacaaaagc caatcacttt agtaaaggtc 1620

　　cctgagattc cccgaaaacc acgggcacct acacctaccg ttggcgagca cgttaatggc 1680

　　agttcggacc cgaacaaacg caagcgcaat gccgaggaag ccggcctctc caacggcgaa 1740

　　gaccgttcaa aacgcgtggc cagtatgtct gtcgctgacg gcgatggatc gaatcctatc 1800

　　gtcttagatg agacggaagg aggtgcgatt ctcattgacg actga 1845

　　<210> 5

　　<211> 394

　　<212> PRT

　　<213> 人工序列

　　<400> 5

　　Met Glu Pro Gln Ser Asn Thr Ala Gln Ser Ile Ser Ala Asp Glu Ile

　　1 5 1015

　　Ala Leu Tyr Asp Arg Gln Ile Arg Leu Trp Gly Val Lys Ala Gln Glu

　　202530

　　Lys Leu Arg Ser Ala Asn Ile Leu Leu Ile Thr Phe Lys Ala Leu Ala

　　354045

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　　505560

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　　65707580

　　Phe Val Thr Glu Glu His Lys Gly Gln Asn Arg Ala Gln Ala Ala Ala

　　859095

　　Ser Ser Ile His Ala Met Asn Pro Arg Val Gln Leu Arg Ile Asp Thr

　　100 105 110

　　Asp Asp Ile His Thr Lys Gln Pro Asp Phe Phe Ala Gln Phe Asp Val

　　115 120 125

　　Ile Ile Ala Thr Glu Leu Asp Phe Ala Met Tyr Thr Thr Ile Asn Ala

　　130 135 140

　　Ala Cys Arg Ile Ala Asn Arg Pro Phe Tyr Ala Ala Gly Leu His Gly

　　145 150 155 160

　　Phe Tyr Gly Phe Val Phe Ala Asp Leu Ile Ser His Asp Phe Val Ile

　　165 170 175

　　Glu Arg Ser Lys Ser Asn Val Pro Ser Ala Thr Gln Glu Thr Pro Thr

　　180 185 190

　　Arg Ser Ile Val Asn Ile Thr Thr Lys Lys Glu Asn Glu Lys Val Ile

　　195 200 205

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　　210 215 220

　　Thr Ser Pro Leu Pro Glu Asp Phe Thr Arg Leu Pro Arg Lys Arg Arg

　　225 230 235 240

　　Gln Val Thr Pro Leu Leu Thr Cys Leu Arg Ala Leu Trp Glu Phe Gln

　　245 250 255

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　　275 280 285

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　　325 330 335

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　　340 345 350

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　　355 360 365

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　　370 375 380

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　　385 390

　　<210> 6

　　<211> 614

　　<212> PRT

　　<213> 人工序列

　　<400> 6

　　Met Pro Arg Asp Thr Tyr Ser Lys Arg Ser Leu Gly Thr Leu Ser Arg

　　1 5 1015

　　Arg Leu Lys Glu Ser Arg Val Leu Leu Val Gly Ala Gly Gly Ile Gly

　　202530

　　Cys Glu Leu Leu Lys Asn Leu Leu Leu Ser Gly Phe Gly Glu Ile His

　　354045

　　Ile Ile Asp Leu Asp Thr Ile Asp Leu Ser Asn Leu Asn Arg Gln Phe

　　505560

　　Leu Phe Arg Phe Glu His Ile Lys Lys Ser Lys Ala Leu Val Ala Lys

　　65707580

　　Glu Val Ala Gln Lys Phe Gln Pro Ser Ala Lys Leu Glu Ala Tyr His

　　859095

　　Ala Asn Ile Lys Asp Ser Arg Phe Asn Val Asp Trp Phe Ala Thr Phe

　　100 105 110

　　Asp Val Val Phe Asn Ala Leu Asp Asn Leu Asp Ala Arg Arg His Val

　　115 120 125

　　Asn Arg Met Cys Leu Ala Ala Asp Val Pro Leu Ile Glu Ser Gly Thr

　　130 135 140

　　Thr Gly Phe Asn Gly Gln Val Gln Val Ile Lys Lys Gly Gln Thr Glu

　　145 150 155 160

　　Cys Tyr Asp Cys Asn Ser Lys Glu Val Pro Lys Ser Phe Pro Val Cys

　　165 170 175

　　Thr Ile Arg Ser Thr Pro Ser Gln Pro Ile His Cys Ile Val Trp Ala

　　180 185 190

　　Lys Ser Tyr Leu Phe Pro Glu Leu Phe Gly Thr Ser Glu Asp Glu Thr

　　195 200 205

　　Pro Glu Leu Asp Ser Thr Glu Asp Val Asn Asn Ala Glu Glu Ile Ala

　　210 215 220

　　Asn Leu Arg Lys Glu Ala Gln Ala Leu Lys Glu Ile Arg Glu Ser Met

　　225 230 235 240

　　Gly Ser Pro Glu Phe Ala His Lys Val Phe Thr Lys Val Phe Lys Glu

　　245 250 255

　　Asp Ile Asp Arg Leu Arg Gly Met Glu Asp Met Trp Lys Met Arg Lys

　　260 265 270

　　Ala Pro Glu Pro Leu Asp Phe Glu Lys Ile Gln Glu Glu Thr Ser Thr

　　275 280 285

　　Ile Glu Pro Thr Ile Ser Cys Asn Asp Gln Lys Val Trp Thr Leu Ala

　　290 295 300

　　Glu Asp Leu Val Val Phe Lys Asp Ser Leu Asp Arg Leu Ser Lys Arg

　　305 310 315 320

　　Leu Lys Thr Leu Leu Asp Thr Thr Lys Ser Asp Val Lys Pro Ile Leu

　　325 330 335

　　Val Phe Asp Lys Asp Asp Val Asp Thr Leu Asp Phe Val Thr Ala Ser

　　340 345 350

　　Ala Asn Leu Arg Ala Thr Ile Phe Gly Ile Glu Pro Lys Ser Lys Phe

　　355 360 365

　　Asp Thr Lys Gln Met Ala Gly Asn Ile Ile Pro Ala Ile Ala Thr Thr

　　370 375 380

　　Asn Ala Met Thr Ala Gly Leu Cys Val Leu Gln Ala Phe Lys Val Leu

　　385 390 395 400

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　　405 410 415

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　　485 490 495

　　Ser Asn Glu Ser Leu Ile Thr Ile Ile Asp Glu Glu Asp Glu Gln Pro

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　　515 520 525

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　　Arg Lys Pro Arg Ala Pro Thr Pro Thr Val Gly Glu His Val Asn Gly

　　545 550 555 560

　　Ser Ser Asp Pro Asn Lys Arg Lys Arg Asn Ala Glu Glu Ala Gly Leu

　　565 570 575

　　Ser Asn Gly Glu Asp Arg Ser Lys Arg Val Ala Ser Met Ser Val Ala

　　580 585 590

　　Asp Gly Asp Gly Ser Asn Pro Ile Val Leu Asp Glu Thr Glu Gly Gly

　　595 600 605

　　Ala Ile Leu Ile Asp Asp

　　610

　　<210> 7

　　<211> 474

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<400> 7

　　atgtctctgt gtcttaatcg cctgacagaa gaaagaaagc agtggcgacg tgaccaccct 60

　　tacggattct atgcgaagcc tcatcgaacc cctcagggtg tgttggattt gaagcgctgg 120

　　gaatgtggtg tccctggaaa ggcgcagacc ctctgggacg gcgggctttt taagcttgat 180

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　　gcctggaaac ctgccatcac cattaaacag atcctgctcg gcatccagga cctgctcgat 360

　　gaccccaatc cggagtcgcc tgcacaggcg gaagcataca atctgttcaa gaaggatcgt 420

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　　<210> 8

　　<211> 157

　　<212> PRT

　　<213> 人工序列

　　<400> 8

　　Met Ser Leu Cys Leu Asn Arg Leu Thr Glu Glu Arg Lys Gln Trp Arg

　　1 5 1015

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　　202530

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　　354045

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　　505560

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　　65707580

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　　859095

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　　100 105 110

　　Leu Gly Ile Gln Asp Leu Leu Asp Asp Pro Asn Pro Glu Ser Pro Ala

　　115 120 125

　　Gln Ala Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Lys Lys Asp Arg Pro Ala Tyr Glu

　　130 135 140

　　Lys Arg Val Arg Gln Val Val Lys Glu Asn Pro Thr Leu

　　145 150 155

　　<210> 9

　　<211> 1590

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<400> 9

　　atggcctctg ttggccagtc atccgagctt caaagtgtgg ttgctttggt gaaaacaatg 60

　　acgaacgcgc agctcaagga gatactgaga agtgaggggc tcgctgtttc tggagtaaaa 120

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　　gagcggtacg ataacctgaa gagagccgtg tacgccacga cacatcgatc aatgccacaa 240

　　ccttcaaccc cacagtcatt acctagtcac caatatcatt cttcagctaa tcaacccttg 300

　　tcaacacaac aacgaccatc gccattgagc gcgccgatga cgtcgcatgg gctcacttct 360

　　ggccggttaa atttcaaaga aagtcctttc tacactgttt tccagcagct tacacctgtt 420

　　gtggaatgca aagtacgcga acagactagg gacagtgtag aacttagagt ggttctcaac 480

　　caagatatgg cttctaggct acaggccgat ccgaacctta gggtaatggt ttactgtgct 540

　　gcagatactg ggcttaatca gtatacgaaa tcggatattg ctttccctca ccaagttgag 600

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　　acgacgagac cggctgatgt aaccgactat attcgcaaaa aacctggata tccaaatcat 720

　　attgttatga cctatgccct cactacaaag agattctttg tgcttgtcag tcttgttcag 780

　　cggcatccag ttgaggaact tgtagctgag ttgaagatga ggaagacaat ctcgaaagac 840

　　caagtactac gagaaatgaa aagcagagcg gatgacacgg acatcgttgc aacatctagc 900

　　gtcatgtcat tgaagtgtcc tttatctact cttcgaatcg cggtcccctg ccgctcggta 960

　　atatgcactc ataatcaatg ctttgatgca tactctttcc tgcaattgca agaacaggcc 1020

　　ccaacgtggt cgtgccctgt gtgttctaag gccaccagct ttgagtcatt acaaatcgat 1080

　　cagtatgttg atgatatact tcgctcaaca tctacagatg ttgaacaggt tgtagtggag 1140

　　ccagacggca gatggtcaaa tcccagagtc gtcgacgctt cagaagctgg tggagttact 1200

　　cctgagtcag atgatgacga tttaatagag ataaaggaac ttggaaatac gcccgttaaa 1260

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　　ccttcgtcga catcatctgt cgctcgtttg tcaacaaaca agcgtcctgc aacccaagtg 1380

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　　<210> 10

　　<211> 529

　　<212> PRT

　　<213> 人工序列

　　<400> 10

　　Met Ala Ser Val Gly Gln Ser Ser Glu Leu Gln Ser Val Val Ala Leu

　　1 5 1015

　　Val Lys Thr Met Thr Asn Ala Gln Leu Lys Glu Ile Leu Arg Ser Glu

　　202530

　　Gly Leu Ala Val Ser Gly Val Lys Ala Ser Leu Gln Phe Arg Ile Ile

　　354045

　　Glu Phe Ile Glu Arg Leu Asn Gln Gly Gly Gln Ile Glu Arg Tyr Asp

　　505560

　　Asn Leu Lys Arg Ala Val Tyr Ala Thr Thr His Arg Ser Met Pro Gln

　　65707580

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　　859095

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　　100 105 110

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　　115 120 125

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　　130 135 140

　　Val Arg Glu Gln Thr Arg Asp Ser Val Glu Leu Arg Val Val Leu Asn

　　145 150 155 160

　　Gln Asp Met Ala Ser Arg Leu Gln Ala Asp Pro Asn Leu Arg Val Met

　　165 170 175

　　Val Tyr Cys Ala Ala Asp Thr Gly Leu Asn Gln Tyr Thr Lys Ser Asp

　　180 185 190

　　Ile Ala Phe Pro His Gln Val Glu Leu Lys Ala Asn Leu Asp Glu Val

　　195 200 205

　　Lys Ala Asn Leu Arg Gly Leu Lys Asn Lys Pro Gly Thr Thr Arg Pro

　　210 215 220

　　Ala Asp Val Thr Asp Tyr Ile Arg Lys Lys Pro Gly Tyr Pro Asn His

　　225 230 235 240

　　Ile Val Met Thr Tyr Ala Leu Thr Thr Lys Arg Phe Phe Val Leu Val

　　245 250 255

　　Ser Leu Val Gln Arg His Pro Val Glu Glu Leu Val Ala Glu Leu Lys

　　260 265 270

　　Met Arg Lys Thr Ile Ser Lys Asp Gln Val Leu Arg Glu Met Lys Ser

　　275 280 285

　　Arg Ala Asp Asp Thr Asp Ile Val Ala Thr Ser Ser Val Met Ser Leu

　　290 295 300

　　Lys Cys Pro Leu Ser Thr Leu Arg Ile Ala Val Pro Cys Arg Ser Val

　　305 310 315 320

　　Ile Cys Thr His Asn Gln Cys Phe Asp Ala Tyr Ser Phe Leu Gln Leu

　　325 330 335

　　Gln Glu Gln Ala Pro Thr Trp Ser Cys Pro Val Cys Ser Lys Ala Thr

　　340 345 350

　　Ser Phe Glu Ser Leu Gln Ile Asp Gln Tyr Val Asp Asp Ile Leu Arg

　　355 360 365

　　Ser Thr Ser Thr Asp Val Glu Gln Val Val Val Glu Pro Asp Gly Arg

　　370 375 380

　　Trp Ser Asn Pro Arg Val Val Asp Ala Ser Glu Ala Gly Gly Val Thr

　　385 390 395 400

　　Pro Glu Ser Asp Asp Asp Asp Leu Ile Glu Ile Lys Glu Leu Gly Asn

　　405 410 415

　　Thr Pro Val Lys Gln Glu Ser Leu Pro Ala Ala Ser Leu Ser Leu Gln

　　420 425 430

　　Arg Thr Pro Ala Gln Ser Arg Glu Pro Ser Ser Thr Ser Ser Val Ala

　　435 440 445

　　Arg Leu Ser Thr Asn Lys Arg Pro Ala Thr Gln Val Ile Asp Leu Thr

　　450 455 460

　　Gly Ser Asp Asp Asp Asn Asp Asp Gly Ser Pro Val Arg Pro Pro Lys

　　465 470 475 480

　　Arg Pro Ala Leu Asn Leu Leu Asn Arg Ser Leu Pro Arg Gln Glu Phe

　　485 490 495

　　Gln Ser Ser Tyr Asn Thr Ala Leu Ala Asn Gly Lys Ala Val Pro Arg

　　500 505 510

　　Ala Gly Gln Thr Ser Ser Glu Ser Ala Ser Gln Thr Thr Gly Tyr Asn

　　515 520 525

　　Ala

　　<210> 11

　　<211> 1140

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<400> 11

　　atgagttcaa tgtcctataa acagatcaag ctgcgtcgca agaagaatgt caagaagggt 60

　　atccagttct gtttgatggt ctgtggtgcc agcggaactg gccgtactac atttgtcaac 120

　　accctttgtg gaaagcaagt tctggagggc aaggacgccg acgatgctgc caatgctcat 180

　　gttgaggagg gtgtccgcat caagccagtt acagtcgaac ttgaattgga tgacgaaggc 240

　　acccgaatct ctctcactat tgtcgacact cccggtttcg gtgatcagat tgataatgaa 300

　　gcaagctttg gtgagattgt tggatacctt gagcgccagt acgatgatat ccttgccgaa 360

　　gaatcacgaa tcaagcgaaa cccccgcttc agggacaacc gtgtccacgt ccttttgtac 420

　　ttcatcacac ccactggcca tggcctccgt gagctggata tcgaattgat gaagcgtctt 480

　　tcgcctcgtg tcaacgtcat tcccgtcatt ggaaaggctg actccctcac tcctgcagaa 540

　　ctggccgagt ccaagaagct gatcatggag gatatcgagc attaccgcat ccccgtctat 600

　　aacttccctt acgacattga ggaggatgac gaggataccg tggaagagaa cgctgaacta 660

　　cgtgggctta tgccgtttgc catcgttggc tctgatgact tcgtggaaat cgatggccgg 720

　　aaagtacgag ccaggcaata tccttgggga gttgttgagg ttgaaaaccc tcgccactct 780

　　gatttcttgg ccatccgaag tgctcttctt cacagccacc ttgcggatct gaaggagatc 840

　　acccatgact tcctttatga aaactatcgt accgagaagc tcagtaagag cgttgacggt 900

　　gccactccta cccaagattc gtcgatgaac ccagaagacc tagcatccca gtccgtccgc 960

　　ctgaaggagg aacaactccg tcgtgaggag gagaaactcc gcgagatcga actccgggtg 1020

　　cagcgtgaga ttgctgagaa gcgccaggaa ttgttggctc gtgagagcca gctgagggag 1080

　　atcgaggctc gtatggcacg cgagtccagc agccaggacg tcgccaatgg tgatgcttaa 1140

　　<210> 12

　　<211> 379

　　<212> PRT

　　<213> 人工序列

　　<400> 12

　　Met Ser Ser Met Ser Tyr Lys Gln Ile Lys Leu Arg Arg Lys Lys Asn

　　1 5 1015

　　Val Lys Lys Gly Ile Gln Phe Cys Leu Met Val Cys Gly Ala Ser Gly

　　202530

　　Thr Gly Arg Thr Thr Phe Val Asn Thr Leu Cys Gly Lys Gln Val Leu

　　354045

　　Glu Gly Lys Asp Ala Asp Asp Ala Ala Asn Ala His Val Glu Glu Gly

　　505560

　　Val Arg Ile Lys Pro Val Thr Val Glu Leu Glu Leu Asp Asp Glu Gly

　　65707580

　　Thr Arg Ile Ser Leu Thr Ile Val Asp Thr Pro Gly Phe Gly Asp Gln

　　859095

　　Ile Asp Asn Glu Ala Ser Phe Gly Glu Ile Val Gly Tyr Leu Glu Arg

　　100 105 110

　　Gln Tyr Asp Asp Ile Leu Ala Glu Glu Ser Arg Ile Lys Arg Asn Pro

　　115 120 125

　　Arg Phe Arg Asp Asn Arg Val His Val Leu Leu Tyr Phe Ile Thr Pro

　　130 135 140

　　Thr Gly His Gly Leu Arg Glu Leu Asp Ile Glu Leu Met Lys Arg Leu

　　145 150 155 160

　　Ser Pro Arg Val Asn Val Ile Pro Val Ile Gly Lys Ala Asp Ser Leu

　　165 170 175

　　Thr Pro Ala Glu Leu Ala Glu Ser Lys Lys Leu Ile Met Glu Asp Ile

　　180 185 190

　　Glu His Tyr Arg Ile Pro Val Tyr Asn Phe Pro Tyr Asp Ile Glu Glu

　　195 200 205

　　Asp Asp Glu Asp Thr Val Glu Glu Asn Ala Glu Leu Arg Gly Leu Met

　　210 215 220

　　Pro Phe Ala Ile Val Gly Ser Asp Asp Phe Val Glu Ile Asp Gly Arg

　　225 230 235 240

　　Lys Val Arg Ala Arg Gln Tyr Pro Trp Gly Val Val Glu Val Glu Asn

　　245 250 255

　　Pro Arg His Ser Asp Phe Leu Ala Ile Arg Ser Ala Leu Leu His Ser

　　260 265 270

　　His Leu Ala Asp Leu Lys Glu Ile Thr His Asp Phe Leu Tyr Glu Asn

　　275 280 285

　　Tyr Arg Thr Glu Lys Leu Ser Lys Ser Val Asp Gly Ala Thr Pro Thr

　　290 295 300

　　Gln Asp Ser Ser Met Asn Pro Glu Asp Leu Ala Ser Gln Ser Val Arg

　　305 310 315 320

　　Leu Lys Glu Glu Gln Leu Arg Arg Glu Glu Glu Lys Leu Arg Glu Ile

　　325 330 335

　　Glu Leu Arg Val Gln Arg Glu Ile Ala Glu Lys Arg Gln Glu Leu Leu

　　340 345 350

　　Ala Arg Glu Ser Gln Leu Arg Glu Ile Glu Ala Arg Met Ala Arg Glu

　　355 360 365

　　Ser Ser Ser Gln Asp Val Ala Asn Gly Asp Ala

　　370 375

　　<210> 13

　　<211> 1140

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<400> 13