一种用于铜绿假单胞菌核酸检测的探针、基因芯片及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种用于铜绿假单胞菌核酸检测的探针、基因芯片及试剂盒。
背景技术
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又称绿脓杆菌，该菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。铜绿假单胞菌感染可发生于很多解剖部位，包括皮肤、皮下组织、骨、耳、眼、尿路和心脏瓣膜。感染部位与细菌的入口及病人的易感性有关。烧伤时，焦痂下区域可成为大量细菌侵犯的场所，进而成为引起菌血症的病灶，而菌血症常是烧伤的致死性并发症。铜绿假单胞菌引起的很多感染发生在衰弱或免疫受损的住院病人，它是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌，是呼吸机相关性肺炎的常见原因。除医院内获得感染外，HIV感染者很容易在社区获得该菌的感染，而且一旦被铜绿假单胞菌感染，常可出现晚期HIV感染的体征。并且该病菌还具有多重耐药的特点，且有先天和后天获得的耐药性，其感染后的临床治疗十分困难。因此，对铜绿假单胞菌的检测尤为重要。
目前，在铜绿假单胞菌的检测技术包括生化鉴定和PCR检测，国内外标准中仍沿用传统的理化检测方法，包括涂布法、多试管 MPN 法、滤膜法等，需要纯培养和生化鉴定等多个步骤，整个检测周期 3-5 天，灵敏度低，且生化鉴定在实际操作中常因结果不确实而无法准确判断。而PCR鉴定需要测序和比对，耗时较长，一般要 5 天左右。两种检测方法检测周期均较长，不能满足现场快速检测的需要。
基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上 , 借助核酸分子杂交配对的特性对 DNA 样品的序列信息进行高效的解读和分析。采用基因芯片进行检测，其检测通量大，在一张芯片上可以同时对一种病原物的多个基因进行检测或者一次性完成几种病原体检测，直接针对病原体基因进行，结果更准确，具有检测灵敏度高、特异性好，所需样本量少等优点。
传统的基因芯片技术的检测，是基于荧光标记探针的荧光发光来进行检测的。其信号弱，必须经过激发，才能发光，需要昂贵的激光扫描设备。本发明基因芯片利用化学发光检测杂交信号，在常温下即可完成杂交过程，不需要大型仪器设备，降低了检测的投资成本和应用成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测、特异性好、结果直观准确的铜绿假单胞菌核酸检测探针、基因芯片和试剂盒，以简化检测步骤，提高检测速度，降低检测成本和应用成本，并且提高检测灵敏度，满足现场快速检测的需要。
本发明实现其目的的技术方案如下：
用于铜绿假单胞菌核酸检测的探针，包括该细菌的PAK基因探针1、2，Pf4基因探针1、2；所述探针序列如下：
PAK基因探针1、2序列为SEQ ID NO.1～2；
Pf4基因探针1、2序列为SEQ ID NO.3～4。
进一步地，本发明内容还包括一种用于铜绿假单胞菌核酸检测的基因芯片，包括固体相和前述探针。
进一步地，本发明的内容还包括一种用于铜绿假单胞菌核酸检测的基因芯片试剂盒，包括前述基因芯片。
进一步地，所述的铜绿假单胞菌核酸检测检测的基因芯片试剂盒，还包括以下引物对：PAK基因引物对和Pf4基因引物对，所述引物对的序列如下：
PAK基因引物对，序列为SEQ ID NO.5～6；
Pf4基因引物对，序列为SEQ ID NO.7～8。
进一步地，所述引物上含有生物素标记。
进一步地，所述的铜绿假单胞菌核酸检测试剂盒还包括多重PCR反应体系、阴性对照品、阳性对照品、杂交缓冲液、亲和素（辣根过氧化物酶标记）、清洗液、ECL显色液。
进一步地，所述的阴性对照品为生理盐水，所述阳性对照品为含有目的基因的PAK基因质粒、Pf4基因质粒的混合液，所述目的基因序列分别为SEQ ID NO.9～10。
进一步地，所述杂交缓冲液为Quick Reaction Buffer(重庆威斯腾生物有限公司提供)，所述清洗液配方为用800ml蒸馏水溶解8g NaCl，0.2g KCl和3g Tris-base。用HCl调至ph7.4，用蒸馏水定容到1L。
进一步地，所述亲和素（辣根过氧化物酶标记）使用时需要用杂交缓冲液稀释到合适浓度。
进一步地，所述多重PCR体系为： 50～150ng/μL的扩增模板1μL，Premix Taq 10μL，浓度为8～12μM的不同上、下游引物各0 .6μL。
本发明的有益效果是：通过特异性引物和探针的选择，利用了多重PCR技术与基因芯片技术相结合的方法，利用化学发光检测基因芯片杂交信号，超越传统的理化检测方法，不需要大型仪器设备，不仅简化检验步骤，缩短检验周期，降低了检测的投资成本和应用成本，并且提高检测灵敏度和特异性，满足医院等的现场检测的需求，具有广阔的临床应用市场潜力。
附图说明
附图1为铜绿假单胞菌两个基因经过多重PCR扩增后的产物凝胶电泳图（M：DL500 DNA Marker；CK-：阴性对照样本扩增结果；CK+：阳性对照样本扩增结果；PA：铜绿假单胞菌样本扩增结果）。
附图2中A为检测本发明的基因芯片检测铜绿假单胞菌基因组扩增杂交结果； B为阳性对照样本扩增杂交结果；C为阴性对照样本扩增杂交结果。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
【实施例 1】目标片段、引物和探针的设计
通过NCBI数据库查找铜绿假单胞菌的基因序列，选择PAK基因、Pf4基因的保守序列作为靶标（ID分别为CP020659和KM975472），根据引物与探针设计原则，设计各病原体基因的扩增引物与探针，为了使芯片结果用显色液显色后可直接通过肉眼判读，在各病原体靶基因的上下游引物5’端用生物素进行标记，具体序列如下：
PAK基因
PAK基因靶序列扩增引物
F引物(PAK-F)：序列为SEQ ID NO.5；
R引物(PAK-R)：序列为SEQ ID NO.6；
PAK探针1：序列为SEQ ID NO.1；
PAK探针2：序列为SEQ ID NO.2；
Pf4基因
F引物(Pf4-F)：序列为SEQ ID NO.7；
R引物(Pf4-R)：序列为SEQ ID NO.8；
Pf4探针1：序列为SEQ ID NO.3；
Pf4探针2：序列为SEQ ID NO.4。
【实施例 2】芯片的制备
将氨基修饰的探针及对照物探针，按照表 1 排列分别将探针点样到NC上，每组设两个平行点样点，紫外交联20min固定探针。
对照物ProbeT探针序列为SEQ ID NO.11。
表1铜绿假单胞菌芯片矩阵
【实施例 3】检测方法
1、基因组提取：本试剂盒不提供细菌基因组DNA提取试剂，使用宝生物工程(大连)有限公司的细菌DNA提取试剂盒，货号9763。
2、扩增体系，组分见表2。
表2 PAK、Pf4基因多重PCR扩增体系
PCR反应程序为：95℃ 5min；95℃ 10s、58℃ 30s、72℃ 30s、32个循环；72℃ 10min。
3、杂交
材料：阴性对照品为双蒸水；阳性对照为以PAK、Pf4基因为模板扩增的靶序列与19T载体构建的质粒；杂交缓冲液为Quick Reaction Buffer(重庆威斯腾生物有限公司提供)，清洗液配方为用800ml蒸馏水溶解8g NaCl，0.2g KCl和3g Tris-base。用HCl调至pH7.4，用蒸馏水定容到1L，加1ml吐温20；亲和素（辣根过氧化物酶标记）使用时需要用杂交缓冲液稀释到合适浓度；ECL显色液购置于赛默飞世尔科技公司，货号32106；按照实施例2制作基因芯片。
杂交步骤如下：
a. 将 PCR 扩增产物 95℃加热 3 分钟，迅速置于冰上；
b. 取10μl PCR产物与2mL杂交缓冲液混合，与芯片一起放入杂交盒中，在常温下，于水平摇床上孵育60min。
c.使用杂交缓冲液清洗2次，每次5min。
d. 清洗后，将亲和素（辣根过氧化物酶标记）加入到杂交盒中，孵育10min。
e. 用清洗液清洗3次，每次5min
f. 在晾干的基因芯片上点样ECL显色液，使用上海天能科技有限公司生产的Tanon 4600 全自动化学发光图像分析系统显色。
本发明通过特异性的引物和探针的选择，利用了多重PCR技术与基因芯片技术相结合的方法，不仅提高了检测的准确度和特异性，并且在常温下即可完
成杂交过程，利用化学发光检测基因芯片杂交信号，不需要大型仪器设备，降低了检测的投资成本和应用成本，满足医院等的现场检测的需求。
序列表
<110> 重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司
<120> 一种用于铜绿假单胞菌核酸检测的探针、基因芯片及试剂盒
<130> 2017
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(未知)
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<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 50
<212> DNA
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<212> DNA
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<213> 人工序列(未知)
<400> 11
tttttttttt tttttttttt tttttttt 28
