一种转化药用野生稻cDNA文库改良水稻品种的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学域，特别涉及一种转化药用野生稻cDNA文库改良水稻品种的方法。
背景技术
水稻产量关乎世界粮食安全，一直以来都是农业科技工作者关注的焦点和热点。我们目前可以通过各种手段来提高水稻产量，比如施肥打药、科学种田、合理灌溉、发展杂交稻、发展再生稻、三季稻种植、通过转基因技术改良水稻等。随着社会的进步，在我们要建设环境友好型社会和要求食品安全的情况下，大力改良水稻，节约化肥少打药是一个共识，而这里就有两点值得关注，一是发展杂交稻，例如红莲型杂交稻“路优8号”和“洛优10号’，具有高产、优质、广适、节省农药化肥；二是发掘优质基因转化水稻提高水稻产量和抗逆抗病虫害能力，如显著提高水稻产量的药用野生稻基因shrunken-2(Sh2)，Bph14/I S抗褐飞虱基因等。
研究发现农杆菌侵染的宿主多，农杆菌转基因先在双子叶植物(如拟南芥和烟草等)中得到了应用，后来在单子叶植物(水稻、药用野生稻、药用野生稻、小麦等)里也得到应用。农杆菌转基因技术的高效和其具有的独特优势，使得多个大型突变体库被构建成功；研究人员可以采用一些方法如接头PCR、环化PCR,TaiL-PCR等鉴定插入位点的侧翼序列，而有的侧翼序列信息己经被提交在网站上供有需要的其他科研工作者参考和分析，好处就是省去了我们费时费力的图位克隆工作。
农杆菌介导的转基因技术的优点。1、由于插入的T-DNA序列是己知的，这就可以从正向遗传学方法研究基因和表型的关系，而且克隆基因相对简单些；2、农杆菌转基因虽然会插入多个拷贝，但是相对来说还是很低的，有利于得到纯合的能稳定遗传的单株，符合孟德尔遗传分离定律等；3、目前的研究表明T-DNA插入有偏好性，但是也有随机性，并在大型突变体库的构建中得到了应用。
药用野生稻，多年生草本，分布于广西、广东、海南，生于海拔400～1000m处的丘陵地区、坡下冲积地和沟边，存在与栽培稻的基因交换类型，也是水稻育种的原始材料，国家二级保护渐危种。本身没有药用价值，但在中国有“植物大熊猫”之美誉，由于长期处于野生状态，药用野生稻经受各种灾害和环境的自然选择，形成了许多栽培稻很少具有的优良性状，如耐冷性强、超强的分蘖力以及高抗褐飞虱，抗白叶枯病等，是水稻育种和改良品种的重要遗传资源。
目前，水稻育种分为传统杂交育种和基因重组育种，传统杂交育种具有遗传背景单一，筛选周期长的缺点，无法高效富集优良基因，基因重组育种又受限于对单一基因的测序、定位和克隆，无法高通量筛选优良的转基因水稻品种。因此，开发一种快速，简单、高效的高通量转化药用野生稻的cDNA文库改良水稻品种的方法十分必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：针对目前对药用野生稻遗传资源利用和水稻育种中存在的问题，本发明公开了一种快速，简单、高效的高通量转化药用野生稻的cDNA文库改良水稻品种的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
一种转化药用野生稻cDNA文库改良水稻品种的方法，包含以下操作步骤：
(1)药用野生稻cDNA文库的构建；
(2)药用野生稻cDNA文库序列分析：将E.coil药用野生稻cDNA库中50个随机单克隆测序分析，将测序序列上传到NCBI数据库进行药用野生稻基因BLAST分析，记录相关匹配的信息如匹配的基因登录号、百分数、CDS(coding sequence)、基因注释等，进行cDNA完整性分析和ORF预测；
(3)E.coli药用野生稻cDNA文库大规模质粒抽提：
(3.1)挑取单菌落于带有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃，250rpm振荡培养20h；
(3.2)5mL培养物分3次倒入1.5mL微量离心管中，用微量离心机于4℃，12000rpm离心30s吸去上清再倒入1.5mL的培养物再沉淀细菌；
(3.3)向离心管中加入180μL的预冷的Solution 1用旋涡震荡器重悬沉淀；
(3.4)加入360μL新配制的Solution 2盖紧管口，迅速颠倒离心管6～10次，冰上放置10～15min；
(3.5)加入270μL预冷的Solution 3轻轻混匀，冰上静置20min；
(3.6)用微量离心机于4℃以下离心5min，将上清转移到另一离心管中，加等体积的苯酚：氯仿(1：1)，振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000rpm离心l0min，将上清转移到另一离心管中；
(3.7)向上清中先加入1/10倍体积的醋酸钠再加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，-20℃低温放置15min；
(3.8)用微量离心机于4℃以12000离心5min弃上清，用70％乙醇洗1～3次，沉定于空气中干燥l0min,用20μL TE buffer溶解质粒DNA加入1μL 10mg/mL RNaseA后用Nanodroping测定质粒的浓度备用；
(4)农杆菌感受态细胞的制备，方法如下：
挑取农杆菌单菌落接种于5mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃，250rpm培养12h；吸取2mL培养物转入50mL YEB液体培养基，继续培养至OD600值为0.8，将菌液转至无菌离心管中，冰浴30min,5000rpm离心5min；用1.7mL的20mmoL/L无菌CaCl2重悬菌体，再加入300微升无菌甘油，混匀后，按每管200μL分装于无菌0.5mL微量离心管中，-70℃保存存备用。
(5)药用野生稻目的cDNA过表达文库质粒转入农杆菌，方法如下：
(A)首先从-70℃取出农杆菌感受态放置于冰上融解；
(B)在200μL的GV3101感受态细胞中加入2mg重组质粒DNA，冰浴5min,然后转至液氮中冷冻8min，迅速于37℃冰浴中温育5min后，加入800μL无抗生素YEB液体培养基，28℃，250rpm预表达培养4h～5h，然后涂铺含有卡那霉素、利福平的YEB平板，28℃培养36h；
(C)计数平板上长出的菌落数，挑取单菌落于含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平的YEB液体培养基中摇菌，28℃，250rpm培养12h，5000rpm，离心10min，收集菌体，无菌水洗涤三次后用20％甘油水溶液重悬，-20℃保存备用；
(6)农杆菌介导药用野生稻cDNA转化改良水稻品种：
(a)选择颖壳干净明亮的、当年的种子，剥去颖壳，在无菌操作台上将其置入100mL灭菌的锥形瓶中，用灭菌的蒸馏水清洗种子3次，再用75％酒精消毒2次，每次1min，然后用灭菌的蒸馏水洗3次除去酒精以后，用0.15％的升汞消毒15min，期间用手摇动锥形瓶，弃去升汞，用灭菌水清洗种子3次，然后将多余的水分除尽，按每平皿10粒种子将种子接种到B5固体培养基上，封口膜封好，28℃黑暗条件下，培养30天；
(b)将黄色胚性愈伤组织接种到新的继代培养基上，28℃避光培养25d，挑选亮黄色、干燥的致密胚性愈伤接种到预培养培养基上，此培养基加有终浓度50μg/mL乙酰丁香酮，28℃黑暗条件下培养4天；
(c)将含有药用野生稻cDNA的农杆菌涂布于含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平的YEB固体培养基上，28℃黑暗培养24h，在无菌操作台上，用枪头吸取农杆菌悬浮培养基轻轻吹打含有药用野生稻cDNA的农杆菌，然后再吸取这些溶液加入到50mL农杆菌悬浮培养基中，同时加入50μL，50mg/mL的乙酰丁香酮，标定OD600为0.8，然后加入在AS上生长5天的愈伤组织，42℃条件下热激30min；
(d)在无菌操作台上尽量除尽菌液，将愈伤组织摊开置于已经灭菌的带有滤纸平皿上吹风1h，直到愈伤组织表面水分被吹干，随后，将其转移到共培养培养基上，24℃，黑暗下培养5d；
(e)在无菌操作台上，将共培养后的愈伤组织放到大小为250mL三角瓶里，用2L灭菌的ddH2O洗5次，用含100μg/mL利福平的无菌双蒸水洗涤2次，每次持续时间15min，用手摇动，然后将愈伤组织摊开在带有无菌滤纸的平皿上进行表面干燥；
(f)将上述表面干燥的愈伤组织接种到含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平的筛选培养基上进行筛选，每平皿放置愈伤组织15颗，28℃黑暗条件下培养24天，再将愈伤组织接种到新的含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平筛选培养基上进行第二次筛选，28℃黑暗条件下培养24天；
(g)将长出的黄色致密的愈伤组织进行分化，配制分化培养基放置4～6天，然后，将待分化的愈伤组织接种到培养基上，28℃光下生长15～20天，幼苗长至3～5cm，将其移至1/2MS生根培养基上生根；
(h)当转基因苗根系足够发达，能够适应土壤生长环境时就可以对其进行炼苗，将其放置于栽培环境中生长3天，然后加无菌ddH2O炼苗4d，将转基因苗从培养基中直接取出并栽培到土壤中；
(i)转基因得到的水稻转基因系经过T0代、T1代和T2代的种植和表型观察，筛选优良水稻品系。
优选地，所述药用野生稻cDNA文库构建包含以下操作步骤：
(1)药用野生稻总RNA提取，加液氮在研钵中研磨药用野生稻的幼茎，用TRIzoL分别提取各种材料的总RNA，并取少量RNA用于琼脂糖凝胶电泳和测定其OD260/OD280，OD260/OD230值.；
(2)参照Creator SMART cDNA Construction Kit说明书采用LD PCR方法合成一二链，并电泳检测结果.将合成的cDNA产物随后用DSN双链特异性核酸酶进行均一化处理，均一化后的样品进行PCR扩增，并电泳检测结果；
(3)均一化后的PCR产物纯化回收后末端加A，用PCR clean up Kit回收加A产物，连接到pGBI121S4ABC载体上，转化到E.coli中，涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板进行培养.使用M13通用引物对随机挑取的50个单菌落进行PCR扩增后电泳鉴定，根据电泳结果估计插入片段的大小以及小片段率，并计算库容量。
优选地，所述农杆菌菌株为GV3101，E.coli菌株为DH-5α，所述水稻品种为桂99。
优选地，转基因系T0代均种植与温室，套袋自交，T1～T2代群体种植于室外大田，每份材料种植30～50株，每行10株，常规水稻种植管理，筛选优良水稻品系。
优选地，所述Solution1成分为：50mM葡萄糖、25mM pH8.0Tris·HCl、10mMpH8.0EDTA；Solution2成分为：0.2M NaOH，1％SDS，Solution2使用前现配现用，二者等体积加入；Solution3成分为：每100mL Solution3含5M的KAC 60mL，冰乙酸11.5mL，蒸馏水28.5mL；TE buffer：10mM pH8.0Tris·HCl，1mM pH8.0EDTA。
优选地，所述野生稻品种为广西药用野生稻。
本发明获得的有益效果：
将药用野生稻的基因通过cDNA文库的构建高通量转化进入水稻基因组中，在获得的转基因系中筛选具有优良基因特性的个体，转基因系与野生型相比，在株高，分蘖、抽穗期、抗病虫害方面均呈现出明显的变化，考种分析显示部分水稻转基因系与产量提升相关。本发明具有时间短、效率高、水稻突变性状丰富。对出现变化的水稻植株进行转基因验证分析，遗传背景明确，筛选可利用的优良基因用于后续水稻靶向改良。
附图说明
图1卡那霉素引物PCR鉴定阳性转基因株系
M：DNA Marker
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1：
转化药用野生稻cDNA文库改良水稻品种，步骤如下：
(1)广西药用野生稻cDNA文库的构建：
(1.1)药用野生稻总RNA提取，加液氮在研钵中研磨广西药用野生稻的幼茎，用TRIzoL分别提取各种材料的总RNA，并取少量RNA用于琼脂糖凝胶电泳和测定其OD260/OD280，OD260/OD230值.；
(1.2)参照Creator SMART cDNA Construction Kit说明书采用LD PCR方法合成一二链，并电泳检测结果.将合成的cDNA产物随后用DSN双链特异性核酸酶进行均一化处理，均一化后的样品进行PCR扩增，并电泳检测结果；
(1.3)均一化后的PCR产物纯化回收后末端加A(条件为模板:2μL，10×PCR Buffer:5μL，dNTPmix:1μL，rTaq酶:0.3μL，H2O:41.7μL，72℃，30min)，用PCR clean up Kit回收加A产物，连接到pGBI121S4ABC载体上，转化到感受态E.coli DH-5α中，涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的YEB平板进行培养.使用M13通用引物对随机挑取的50个单菌落进行PCR扩增后电泳鉴定，根据电泳结果估计插入片段的大小以及小片段率，并计算库容量；
(2)药用野生稻cDNA文库序列分析：将E.coil药用野生稻cDNA库中50个随机单克隆测序分析，将测序序列上传到NCBI数据库进行药用野生稻基因BLAST分析，记录相关匹配的信息如匹配的基因登录号、百分数、CDS(coding sequence)、基因注释等，进行cDNA完整性分析和ORF预测，挑选出44个具有ORF，其中21个克隆具有与NCBI上药用野生稻基因一致的CDS，将这21个克隆用于后续的质粒提取和转化。
(3)E.coli DH-5α药用野生稻cDNA文库大规模质粒抽提：
(3.1)挑取单菌落于带有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃，250rpm振荡培养20h；
(3.2)5mL培养物分3次倒入1.5mL微量离心管中，用微量离心机于4℃，12000rpm离心30s吸去上清再倒入1.5mL的培养物再沉淀细菌；
(3.3)向离心管中加入180μL的预冷的Solution 1用旋涡震荡器重悬沉淀；
(3.4)加入360μL新配制的Solution 2盖紧管口，迅速颠倒离心管6～10次，冰上放置10～15min；
(3.5)加入270μL预冷的Solution 3轻轻混匀，冰上静置20min；
(3.6)用微量离心机于4℃以下离心5min，将上清转移到另一离心管中，加等体积的苯酚：氯仿(1：1)，振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000rpm离心l0min，将上清转移到另一离心管中；
(3.7)向上清中先加入1/10倍体积的醋酸钠再加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，-20℃低温放置15min；
(3.8)用微量离心机于4℃以12000离心5min弃上清，用70％乙醇洗1～3次，沉定于空气中干燥l0min,用20μL TE buffer溶解质粒DNA加入1μL 10mg/mLRNaseA后用Nanodroping测定质粒的浓度备用；
所述Solution1成分为：50mM葡萄糖、25mM pH8.0Tris·HCl、10mM pH8.0EDTA；Solution2成分为：0.2M NaOH，1％SDS，Solution2使用前现配现用，二者等体积加入；Solution3成分为：每100mL Solution3含5M的KAC 60mL，冰乙酸11.5mL，蒸馏水28.5mL；TE buffer：10mM pH8.0Tris·HCl，1mM pH8.0EDTA
(4)农杆菌感受态细胞的制备，方法如下：
挑取农杆菌单菌落接种于5mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃，250rpm培养12h；吸取2mL培养物转入50mL YEB液体培养基，继续培养至OD600值为0.5～1.0，将菌液转至无菌离心管中，冰浴30min,5000rpm离心5min；用1.7mL的20mmoL/L无菌CaCl2重悬菌体，再加入300微升无菌甘油，混匀后，按每管200μL分装于无菌0.5mL微量离心管中，-70℃保存存备用。
(5)药用野生稻目的cDNA过表达文库质粒转入农杆菌，方法如下：
(A)首先从-70℃取出农杆菌感受态放置于冰上融解；
(B)在200μL的GV3101感受态细胞中加入2mg重组质粒DNA，冰浴5min,然后转至液氮中冷冻8min，迅速于37℃冰浴中温育5min后，加入800μL无抗生素YEB液体培养基，28℃，250rpm预表达培养4h～5h，然后涂铺含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平的YEB平板，28℃培养36h；
(C)计数平板上长出的菌落数，挑取单菌落于含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平的YEB液体培养基中摇菌，28℃，250rpm培养12h，5000rpm，离心10min，收集菌体，无菌水洗涤三次后用20％甘油水溶液重悬，-20℃保存备用；
(6)农杆菌GV3101介导药用野生稻cDNA转化改良水稻“桂99”：
(a)选择颖壳干净明亮的、当年的种子，剥去颖壳，在无菌操作台上将其置入100mL灭菌的锥形瓶中，用灭菌的蒸馏水清洗种子3次，再用75％酒精消毒2次，每次1min，然后用灭菌的蒸馏水洗3次除去酒精以后，用0.15％的升汞消毒15min，期间用手摇动锥形瓶，弃去升汞，用灭菌水清洗种子3次，然后将多余的水分除尽，按每平皿10粒种子将种子接种到B5固体培养基上，封口膜封好，28℃黑暗条件下，培养30天；
(b)将黄色胚性愈伤组织接种到新的继代培养基上，28℃避光培养25d，挑选亮黄色、干燥的致密胚性愈伤接种到预培养培养基上，此培养基加有终浓度50μg/mL乙酰丁香酮，28℃黑暗条件下培养4天；
(c)将含有药用野生稻cDNA的农杆菌涂布于含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平的YEB固体培养基上，28℃黑暗培养24h，在无菌操作台上，用枪头吸取农杆菌悬浮培养基轻轻吹打含有药用野生稻cDNA的农杆菌，然后再吸取这些溶液加入到50mL农杆菌悬浮培养基中，同时加入50μL，50mg/mL的乙酰丁香酮，标定OD600为0.8，然后加入在AS上生长5天的愈伤组织，42℃条件下热激30min；
(d)在无菌操作台上尽量除尽菌液，将愈伤组织摊开置于已经灭菌的带有滤纸平皿上吹风1h，直到愈伤组织表面水分被吹干，随后，将其转移到共培养培养基上，24℃，黑暗下培养5d；
(e)在无菌操作台上，将共培养后的愈伤组织放到大小为250mL三角瓶里，用2L灭菌的ddH2O洗5次，用含100μg/mL利福平的无菌双蒸水洗涤2次，每次持续时间15min，用手摇动，然后将愈伤组织摊开在带有无菌滤纸的平皿上进行表面干燥；
(f)将上述表面干燥的愈伤组织接种到含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平的筛选培养基上进行筛选，每平皿放置愈伤组织20颗，28℃黑暗条件下培养24天，再将愈伤组织接种到新的含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平筛选培养基上进行第二次筛选，28℃黑暗条件下培养24天；
(g)将长出的黄色致密的愈伤组织进行分化，配制分化培养基放置5天，然后，将待分化的愈伤组织接种到培养基上，28℃光下生长18天，幼苗长至3cm，将其移至1/2MS生根培养基上生根；
(h)当转基因苗根系足够发达，能够适应土壤生长环境时就可以对其进行炼苗，将其放置于栽培环境中生长3天，然后加无菌ddH2O炼苗4d，将转基因苗从培养基中直接取出并栽培到土壤中；
(i)转基因得到的水稻转基因系经过T0代、T1代和T2代的种植和表型观察，每份材料种植30～50株，每行10株，常规水稻种植管理，筛选优良水稻品系。
(7)阳性转基因系PCR鉴定：
首先先取5cm长的T2代水稻叶片，加入2mL离心管中，并用剪刀将其剪成0.5厘米大小，加入2xCTAB 100μL，在打样机上将水稻叶片打碎，再加入500μL的2×CTAB于65℃水浴锅中水浴1h。然后冷却到室温再加入800μL的氯仿:异戊醇(24:1)，上下颠倒10次后进行室温12000rpm离心15min。离心后吸取上清500μL，再加入500μL异丙醇，混匀后放到-20℃冰箱中沉淀30min，沉淀过后，12000rpm，4℃条件下离心15min。此时弃去上清，再用75％酒精清洗沉淀，12000rpm，4℃条件下离心15min。弃去酒精，无菌台上吹干，加入100μL无菌ddH20溶解沉淀DNA。
根据转基因载体pGBI121S4ABC上的卡那霉素基因序列片段设计引物(表1)，对转基因材料进行PCR阳性鉴定，条件如下：
PCR体系：ddH2O 5.5μL，10×buffer 1.0μL，TaqMIX 1.5μL，模板1.5μL，引物0.5μL；
PCR反应条件：95℃10min，95℃45s，64.0℃45s，72℃1min，35循环，72℃10min。
表1卡那霉素验证引物序列
实验结果如下：
药用野生稻cDNA文库库容量是6.5×106CFU/mL，转化效率是98％，并按照文库构建试剂盒CloneMinerTM II cDNA Library Construction Kit中鉴定插入片段大小的方法，通过Hind III酶切的方式鉴定了插入载体中的片段的大小介于1.2kb～2.7kb。
将白纹叶枯病病菌活化培养后制备悬液，标定菌体浓度为OD600＝1.0，置于涡旋混合器混合10秒。用剪刀蘸取菌体悬液，在T2代水稻叶片上剪切2mm的切口，每个叶片剪三个切口，每株水稻剪切5个叶片，14天后观察叶片染病情况，统计计算白纹叶枯病染病率，计算公式如下：
染病率＝产生病斑的叶片数/总叶片数x100％
表2筛选获得的部分产量提升转基因系的表型
注：“+”代表耐寒；“—”代表不耐寒。
由表2可知，根据表型综合筛选出来的具有增产潜质的部分基因系中，单株产量、株高和分蘖数均显著增加，为品种的增产提供了基础，生育期明显缩短，可以增加单位时间内的土地种植效益，抗病虫害较野生型有显著提高，产生了对白纹叶枯病的抗性，且部分株系出现耐寒特性，可用于筛选耐寒水稻品种，而药用野生稻为高抗白纹叶枯病，耐寒性强，分蘖能力强，水稻的这些性状改变可以归结于药用野生稻优良基因的转入和表达。
由图1可知经过T0、T1、T2代的种植，稳定遗传外源基因的阳性转基因系仍为绝大多数，可见本发明在高效改良水稻品种的同时，还兼具遗传稳定性，为将药用野生稻的优良基因整合进入水稻提供了可靠的方法，筛选出的阳性克隆还可用于基因功能研究和定位，为进一步了解药用野生稻的基因功能提供可能。
综上所述，本发明具有时间短、效率高、水稻突变性状丰富。对出现变化的水稻植株进行转基因验证分析，遗传背景明确，筛选可利用的优良基因用于后续水稻靶向改良，亦可利用转基因水稻的突变性状反向研究药用野生稻cDNA文库中单个或多个基因的功能，为筛选药用野生稻品种提供便利。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。
