用于水稻基因分型的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及基因组学、分子生物学、生物信息学和分子植物育种领域，具体地说，涉及用于水稻基因分型的SNP分子标记及其应用。
背景技术
水稻是我国最主要的粮食作物之一，对保障国家粮食安全起到举足轻重的作用。粮食生产的源头在于优良品种的选育，而传统的品种选育依赖于植株的表现型，一个优良品种的培育往往需要花费多至十几年的时间周期。为了提高选择效率，育种家在实践中不断探索运用分子标记技术(Molecular marker technologies)来进行育种选择。
分子标记技术是分子育种中的重要工具。传统分子标记技术，如RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)和SSR(Simple Sequence Repeat，简单序列重复)技术曾在功能基因组研究中发挥着重要作用。但是，传统的分子标记技术存在许多局限性，如通量低、数量少、操作过程繁琐，不能满足大规模商业化育种的需求。为了对目标基因进行精确控制，对遗传背景进行有效选择，对育种品种进行准确分析和鉴定，需要开发和利用高通量分子标记技术。目前，高通量分子标记技术平台主要包括：第二代测序技术、基因芯片技术以及SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)标记检测系统。SNP是指在基因组上单个核苷酸的变异所形成的核苷酸序列多态性，是目前认为最具研发潜力的检测技术，与SSR标记相比具有基因组中分布密度更高更均匀，易于实现数据整合比较，通量高、检测位点数量可达数百万个，部分标记与功能基因乃至植物表型相关等优势。SNP分子标记组合可以对品种资源进行分子标记指纹分析、对杂交群体后代进行基因型鉴定、对品种真实性进行鉴定、对育种材料遗传背景进行分析和筛选、对农艺性状进行关联分析等研究，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供用于水稻基因分型的SNP分子标记及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供用于水稻基因分型的SNP分子标记，所述分子标记选自1200个SNP标记中的至少一个，所述1200个SNP标记的编号分别为LPSNP1002～LPSNP2201，它们的信息如表1所示。每条SNP标记均由101个碱基组成，且第51位碱基为SNP位点。
第二方面，本发明提供所述分子标记的如下用途：
所述分子标记单独或组合使用在制备水稻全基因组育种芯片中的应用。
所述分子标记单独或组合使用在水稻分子标记辅助育种中的应用。
所述分子标记单独或组合使用在水稻品种鉴定及选育中的应用。
所述分子标记单独或组合使用在检测水稻育种材料中的应用。
所述分子标记单独或组合使用在水稻全基因组关联分析中的应用。
所述分子标记单独或组合使用在水稻种质资源基因指纹分析中的应用。
所述分子标记单独或组合使用在水稻全基因组选择育种中的应用。
第三方面，本发明提供一种水稻全基因组育种芯片，所述芯片包含1200个SNP标记，它们的信息如表1所示。
第四方面，本发明提供所述水稻全基因组育种芯片的以下任一种应用：
1)在水稻分子标记辅助育种中的应用；
2)在水稻品种鉴定及选育中的应用；
3)在检测水稻育种材料中的应用；
4)在水稻全基因组关联分析中的应用；
5)在水稻种质资源基因指纹分析中的应用；
6)在水稻全基因组选择育种中的应用；
7)在水稻的聚类分析及亲缘关系鉴定中的应用；
8)在水稻基因型分型检测中的应用。
具体地，本发明提供了利用KASP技术对水稻材料进行所述SNP标记检测的应用。
用于检测本发明所述SNP标记的引物，以及基于KASP技术开发的用于检测所述SNP标记的引物均属于本发明保护范围。
进一步地，本发明提供了上述SNP标记组合在水稻种质资源DNA指纹分析中的应用。
本发明提供了上述SNP标记组合在水稻品种真实性鉴定中的应用。
本发明提供了上述SNP标记组合在水稻育种材料遗传背景分析中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明中的1200个SNP标记是从3000份水稻种质资源中挑选出来的，与Rice60K芯片(ZL 201380056318.5)、Rice6K芯片(ZL 201210055775.X)等相比，所覆盖的品种更多，范围更广，更具普适性。
(二)与传统分子标记(如RAPD、SSR等)相比，具有通量高、单个数据位点成本低等优势。
(三)与基于二代测序的基因分型系统相比，无需专业的分析软件和生物信息学专业人士，具有数据分析简单的优势。而低覆盖率的二代测序具有随机性，不同批次的低覆盖度测序数据难以进行直接比较，而本发明的1200个SNP是固定的，不同批次的数据可以进行综合分析。
(四)利用本发明的SNP分子标记及其组合可以对水稻种质资源进行分子标记指纹分析，对水稻杂交群体后代进行基因型鉴定，对水稻品种真实性进行鉴定，对水稻育种材料遗传背景进行分析和筛选、对农艺性状进行关联分析，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中1200个SNP在水稻基因组上的分布图。
图2为本发明实施例2中利用KASP引物LPSNP1603对待测96份水稻样品进行荧光定量PCR检测的结果。
图3为本发明实施例3中对143份种质资源采集的DNA指纹数据进行聚类分析的结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1水稻1200SNP分子标记的开发流程
基于3000份水稻栽培品种测序数据(http://snp-seek.irri.org/index.zul)获得的3,444,971个SNP。首先利用日本晴重复区注释文件，将重测序获得的SNP中位于重复区的SNP删除。然后设置筛选出剩余位点中MAF>0.4的SNP位点。在基因组上每隔15kb的位点处设SNP搜索点，在搜索点前后各3kb的长度范围内，提取所有SNP。考虑突变对基因功能的影响，使用snpEff、VARANNO等注释软件分析变异对基因功能影响，然后根据对基因功能影响的程度进行挑选，将SNP按优先级(非同义突变>启动子区>UTR区>同义突变>Intron区)从高到低排序，选取优先级最高的作为本搜索点的SNP。本实验分析共获得24,889个搜索点，其中12,100个搜索点检索出SNP，这12,100个SNP构成本次分析的SNP集，然后再根据基因组均匀分布的原则从SNP集中筛选出核心SNP位点1200个。所述1200个SNP分子标记的信息如表1所示，它们在水稻基因组上的分布情况如图1所示。
实施例2利用KASP技术检测水稻基因型的方法
根据实施例1中获得的核心SNP标记，结合KASP技术进行水稻基因型的检测。具体方法如下：
1、根据1200个SNP位点两侧翼各50bp的核苷酸序列分别设计KASP引物(表2)；
2、选取有代表性的水稻材料，提取基因组DNA，进行PCR反应，根据PCR反应的结果验证KASP引物的可用性；
3、利用验证过的KASP引物和SNP高通量分型设备对待测水稻材料进行基因型分型，从而鉴定待测水稻的基因型。
步骤3具体如下：
(1)提取待测水稻样品的基因组DNA；
(2)利用LGC公司生产的IntelliQube SNP检测系统将PCR反应所需的待测水稻样品DNA、KASP引物、Mastermix进行高通量的分装混合；
(3)利用LGC公司生产的Hydrocycler水浴PCR仪进行高通量PCR扩增；
(4)利用IntelliQube对PCR产物进行荧光信号的检测，根据每个待测水稻样品DNA的荧光信号确定其基因型。
对待测水稻的基因型进行具体分析的方法如下：
待测水稻样品的DNA在PCR扩增的每一个循环过程中将会产生荧光信号，在某一SNP位点基因型不同的水稻样品DNA会产生不同的荧光信号。PCR扩增结束后，IntelliQube将收集不同的荧光信号信息并进行归类。
图2为利用KASP引物LPSNP1603对96份待测水稻样品进行检测的结果。图2所示为IntelliQube收集的荧光信号的结果，不同的荧光信号代表不同的SNP基因型，每一个点代表不同的待测水稻样品。左上角蓝色荧光信号点表示这些水稻待测样品在相应SNP位点的基因型为纯合AA，右下角红色荧光信号点表示这些水稻待测样品在相应SNP位点的基因型为纯合CC。使用根据1200个SNP设计的KASP引物对日本晴、9311、华占和DV85等4份水稻材料进行检测，其中1026个检测位点能得到较好的检出值(表3)。
表3 4个水稻品种的1200个SNP KASP检测结果
实施例3水稻1200个SNP标记在水稻种质资源基因指纹分析中的应用
本发明利用1200个SNP标记对143份水稻种质资源(编号为LPR001～LPR143，均来自袁隆平农业高科技股份有限公司，见表4，)进行了分析。参照实施例2的方法进行检测。利用KASP技术检测基因型，对这143个品种进行聚类分析，可以分为三类：籼稻、粳稻和中间类型(图3)，与根据表型的分类非常吻合。结果表明，本发明用于水稻基因分型的1200个SNP标记非常适合用于建立水稻品种基因指纹数据库，便于比较不同品种之间的亲缘关系，加快育种进程。
表4用于水稻分型的143份种质资源清单
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
