一种适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法。
背景技术
染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture，3C)技术是一种研究染色体和蛋白互作和染色体构象的技术，可以提供遥远的基因位点之间的关联性的详细信息，此关联性可以从甲醛固定的细胞核中捕获，并且可以从染色体的三维折叠方式被推断。近年来，在第二代测序技术的迅速发展下，由3C技术衍生出来的Hi-C则是以整个细胞核为研究对象，研究整个基因组范围内基因位点之间的关联性。在Hi-C技术中，以整个细胞系为研究对象，利用高通量测序技术，结合生物信息学方法，研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系；通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获，获得高分辨率的染色质三维结构信息。Hi-C技术应用十分广泛，贯穿当今生命科学研究的前沿及热点领域。现有的Hi-C技术对构建3C文库的过程进行了稍许修改。具体的，在连接前，使用生物素标记的核苷酸填充酶切产生的粘性末端。平末端连接后，提取DNA并使用超声波对DNA进行随机打断，最后捕获生物素标记了的DNA片段以确保用以后续分析的数据更多的来自真实的互作。将通过第二代测序得到的DNA序列对比对到参考基因组后，如果一对序列对应于不同的n段酶切片段，那么就认为这两个片段之间有n次相互作用，从而能够构建一个全基因组中所有酶切片段之间连接频率的矩阵。
常规的Hi-C高通量测序建库以细胞系作为研究对象，其染色质比较单一，更容易获得比较好的结果，但是限制了其使用范围，距离研究普遍揭示生物学功能的目标还很遥远。如原核生物相较于真核生物染色质上结合的蛋白要少得多，现有适用于真核生物的Hi-C建库方法无法获得互作片段从而并不适用于原核生物。因此有必要开发一种适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法，该方法通过设计合适的内源酶灭活条件，从而降低了长时间高温对细菌三维结构的破坏，解决了原核生物染色质偏少、互作捕获难度大的技术问题，实现了细菌的Hi-C高通量测序建库，扩大了Hi-C技术的适用范围。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法，所述方法包括以下步骤：
(1)对样品进行甲醛交联获得交联后的物料；
(2)液氮研磨和溶菌酶并行裂解交联后物料，使裂解细胞释放细胞染色质；细胞染色质依次经SDS灭活内源酶、经Sau3AI核酸内切酶酶切打断获得酶切后物料；所述SDS灭活内源酶的条件为：65℃孵育10min后立即放置冰上；
(3)用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行末端补平，获得末端补平后DNA；
(4)对所述末端补平后DNA进行DNA细胞核分子内连接获得分子内连接后物料；
(5)解交联分子内连接后物料并去除未连接的末端生物素，获得纯化的DNA，超声波随机打断DNA成利于测序的片段大小从而获得DNA测序文库。
进一步地，所述灭活内源酶的步骤包括：
(1)取液氮研磨样品0.1g，加入SET buffer 500μL、50mg/mL溶菌酶2.8μL充分混匀，37℃温浴1h；
(2)2000g、4℃离心5min，去上清，使用500μL 1×CutSmart重悬；
(3)2000g、4℃离心5min，去上清，向每管溶解染色质中添加500μL1×CutSmart，吹打混匀，重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫；所述1×CutSmart中含SDS，所述SDS的终浓度为0.3％；
(4)65℃孵育10min，并立即放置冰上，瞬时离心以移除管盖液体。
进一步地，所述步骤(2)中SDS采用Triton X-100中和，所述Triton X-100的浓度为20％，中和后Triton X-100的终浓度为3％。
进一步地，所述步骤(2)中Sau3AI核酸内切酶的浓度为5000units/mL。
更进一步地，所述步骤(2)中酶切反应包括向每管内源酶灭活物料中加5000units/mL的Sau3AI核酸内切酶16μL，900rpm 37℃反应过夜。
进一步地，所述步骤(5)中去除未连接的末端生物素的反应体系包括以下用量的各组分：解交联分子内连接后物料1μg、10x NEBuffer2.1 10μL、10mM dGTP 1μL、10mM dATP 1μL、3U/μL T4DNA Polymerase 1.67μL、水85.33μL。
进一步地，所述方法还包括捕获目的片段与文库扩增。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提出的适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法，通过设计合适的内源酶灭活条件，调整灭活时间和温度，从而降低了长时间高温对细菌三维结构的破坏，从而解决了原核生物染色质偏少、互作捕获难度大的技术问题，实现了细菌的Hi-C高通量测序建库，扩大了Hi-C技术的适用范围。
(2)由于细菌甲基化会严重影响MboI及DpnII的酶切效率，导致实验失败。因此本发明的适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法在工具酶的选择上，避开了对细菌甲基化敏感的MboI及DpnII，选用对细菌甲基化不敏感的Sau3AI，以对细菌基因组进行良好的酶切，Sau3AI为4碱基内切酶，相较其他6碱基内切酶，可以将酶切分辨率从4096bp提高至256bp，显著增加了酶切精度。
(3)本发明的方法构建的Hi-C文库测序数据不仅仅可以用于基因表达调控的研究，还可以用于辅助基因组组装。
(4)本发明的建库方法操作流程简便，可以复制到其他具备分子生物学基础的其他实验室。
附图说明
图1为本发明的适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法流程图。
图2为鉴定基因组完整性、酶切效果的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图3为本发明的方法构建的文库大小分布结果示意图。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明针对原核生物染色质偏少、互作捕获难度大的技术问题提出了一种新的适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法，所述方法包括以下步骤。
1.利用甲醛变性蛋白的能力，将正常生长的菌体加入一定浓度的甲醛交联固定蛋白，使得染色体的互作形态被固定下来；然后甘氨酸中和甲醛，终止交联。
2.液氮研磨和溶菌酶并行裂解交联后物料，使裂解细胞释放细胞染色质；然后细胞染色质依次经SDS灭活内源酶、经Sau3AI核酸内切酶酶切打断获得酶切后物料。
其中，细胞染色质SDS灭活内源酶的步骤包括：
(1)取液氮研磨样品0.1g，加入SET buffer 500μL、50mg/mL溶菌酶2.8μL充分混匀，37℃温浴1h；
(2)2000g、4℃离心5min，去上清，使用500μL 1×CutSmart重悬；
(3)2000g、4℃离心5min，去上清，向每管溶解染色质中添加500μL 1×CutSmart，吹打混匀，重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫；所述1×CutSmart中含SDS，所述SDS的终浓度为0.3％；
(4)65℃孵育10min，并立即放置冰上，瞬时离心以移除管盖液体。
灭活内源酶未反应的SDS采用Triton X-100中和，所述Triton X-100的浓度为20％，中和后Triton X-100的终浓度为3％。
其中酶切反应具体操作为向每管内源酶灭活物料中加5000units/mL的Sau3AI核酸内切酶16μL，900rpm 37℃反应过夜。
3.用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行末端补平，获得末端补平后DNA。
4.对所述末端补平后DNA进行DNA细胞核分子内连接获得分子内连接后物料。
5.解交联分子内连接后物料，并去除未连接的末端生物素，降低生物素捕获阶段的背景，获得纯化的DNA。超声波随机打断DNA成利于测序的片段大小从而获得DNA测序文库。
其中去除未连接的末端生物素的反应体系包括以下用量的各组分：解交联分子内连接后物料1μg、10x NEBuffer2.1 10μL、10mM dGTP 1μL、10mM dATP1μL、3U/μL T4DNA Polymerase 1.67μL、水85.33μL。
本发明的建库方法还包括捕获目的片段与文库扩增。使用链霉亲和素磁珠( MyOneTMStreptavidin C1，Thermo Fisher)特异性捕获标记了生物素的DNA片段，对捕获的DNA片段进行PCR扩增以达到高通量测序所需文库量，通过一次高通量测序的少量数据初步检测文库的质量，同一染色体上互作的可能性绝对大于不同染色体，以此为依据评估文库质量，我们认为顺式互作比例大于60％即为一个比较好的文库，可以用于大量测序及后续分析。
实施例1：
本实施例以链霉菌为研究对象，对菌体进行甲醛交联、裂解细胞释放染色质，再经消化染色质、生物素标记、分子内连接、超声打断，最后进行文库构建，具体实验过程如下：
1.甲醛固定
1)取新鲜培养对数生长期的链霉菌菌液50mL，2000g RT离心5min，吸弃上清；
2)加入25mL 1×PBS配制的终浓度1％的甲醛，轻微吹打重悬细胞；
3)室温摇晃10分钟进行交联；
4)加入5.55mL 1×PBS配制的2.0M甘氨酸；
5)室温摇晃5分钟终止交联；
6)2000g RT离心5min，吸弃上清；
7)3mL预冷1×PBS重悬细胞，每1mL样品分装于一个1.5mL离心管中，4℃2000g离心5min，吸弃上清；
8)交联好的组织在-80℃冻存，可干冰运输。
2.裂解酶切
1)准备研钵，纯水洗净，使用锡箔纸包裹，倒入酒精，烧5min，室温放凉，研钵中加入液氮预冷，将保存的细胞倒入盛有液氮的研钵中，迅速研磨至粉末状态；
2)取研磨好的样品0.1g(取0.1g备份)加入500μL SET buffer，2.8μL溶菌酶(50mg/mL，88015U/mg Ready-lysozyme)，充分混匀，37℃温浴1h；
3)2000g，4℃离心5min，去上清，使用500μL 1×CutSmart重悬；
4)2000g，4℃离心5min，去上清，通过添加500μL 1×CutSmart(含终浓度0.3％SDS)每管溶解染色质，吹打混匀，重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫；
5)65℃孵育10min，并立即放置冰上(长时间高温会解交联)，瞬时离心以移除管盖液体；
6)中和SDS：添加75μL的20％Triton X-100至终浓度3％，重悬细胞碎片并避免形成气泡，37℃950rpm震荡15min；
7)每管加入16μL限制性内切酶(Sau3AI，5000units/mL)，900rpm 37℃过夜(终体积约600μL)。
3.末端标记
1)2000g离心5min，弃上清，200μL 1×NEBuffer2.1重悬，65℃孵育20min；
2)补平末端并插入生物素碱基，生物素补平体系如表1所示：
表1
3)加入补平体系于每个Hi-C反应(终体积240μL)，混匀后，37℃孵育2h。
4.分子内连接
1)DNA分子内连接处理，连接体系如表2所示：
表2
2)转移每个Hi-C反应体系至上述连接体系(终体积900μL)，轻柔颠倒混匀；
3)16℃孵育连接反应4h，每小时颠倒混匀。
5.解交联
1)5μL 20mg/mL蛋白酶K 65℃处理2h；
2)将反应混合液冷却到室温，一倍氯仿分离回收上清，加入3/4体积异丙醇室温沉淀10min，两次75％乙醇清洗(弹起沉淀)，吹干，回收产物溶解在50μL EB，通过添加2μL 1mg/mL RNAse在37℃温育30min以降解所有的RNA，Qubit测定浓度，大约20-100ng/μL为正常浓度范围。(store at-20℃)；
3)通过琼脂糖凝胶电泳图谱鉴定基因组完整性、酶切效果、连接效果。琼脂糖凝胶电泳图谱如输送2所示，图为正常的完整基因组DNA条带明显无拖尾；酶切效果明显，DNA片段整个下移；连接效果明显，DNA条带上移；说明酶切连接均达到预期效果，可以进行下步实验。
6.末端去生物素
1)取3μg样品1×Ampure XP beads纯化后Qubit测定浓度；
2)取1μg样品用于末端去生物素，去生物素体系如表3所示：
表3
3)12℃反应4h，2μL 0.5M EDTA终止反应。
7.DNA打断
1)使用130μL超声体系在Covaris上超声片段至400bp左右，超声选择400bp程序90s进行1次；
2)1×Ampure XP beads回收DNA，溶解于52μL Tris，Qubit测定浓度大约10ng/μL左右为正常浓度范围。
8.Illumina试剂盒建库
1)Illumina建库试剂盒(NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina)补平末端并+A及+Adaptor；
2)使用Illumina建库试剂盒的Ampure Beads纯化回收步骤，回收+Adaptor后的DNA。
9.生物素捕获
生物素捕获使用试剂盒( MyOneTMStreptavidin C1，Thermo Fisher)，操作过程按照试剂盒说明书执行。
10.Illumina试剂盒扩增嵌合片段
1)Illumina试剂盒建库(100μL，PCR至6cycles，分别取3微升摸索循环数6,8,10,12cycles)，选取能扩增出足量产物的最低循环数；
2)1.5％agarose凝胶回收400-600bp条带；
3)回收产物对文库大小分布进行检测，文库大小合适分布均匀，可以进行高通量测序。从图中可以看出，文库大小集中在400-600bp之间，与凝胶回收预期范围一致。
11.对质控得到的clean data，使用ICE3软件对数据进行迭代比对，并进行噪音reads过滤。
表4链霉菌数据分析结果说明
注：为SE(Single End)数据，其它均为PE(Paired End)数据。Hi-C测序数据中主要reads类型包括，valid pair，single side，self circles，dangling ends及unmapped等类型。其中：valid pair是指符合Hi-C实验预期，由补平并携带生物素标记的酶切位点将基因组上不同位点DNA连接在一起形成的嵌合体DNA片段；single side是指，仅有一端序列可以唯一匹配到基因组上的DNA片段；self circles是指同一位点DNA环化连接形成的DNA，它主要由单一酶切片段两端相连接，经超声波打断，捕获并测序产生；dangling ends是指双端均在同一位点的DNA片段，它源自未经过连接反应，最终却被捕获测序产生的数据；unmapped是指双端均无法唯一匹配到基因组上的DNA片段。在Hi-C分析中，仅valid pair可以反映基因组上位点与位点间的互作信息。因此，非重复的valid pair所占的比例是评估Hi-C文库质量的重要指标。
因此，本发明提出的适用于细菌的Hi-C高通量测序建库方法，通过设计合适的内源酶灭活条件，调整灭活时间和温度，从而降低了长时间高温对细菌三维结构的破坏，从而解决了原核生物染色质偏少、互作捕获难度大的技术问题，实现了细菌的Hi-C高通量测序建库，扩大了Hi-C技术的适用范围。本发明的方法构建的Hi-C文库测序数据不仅仅可以用于基因表达调控的研究，还可以用于辅助基因组组装。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
