基于纳米孔测序平台的宏基因组样本建库方法、鉴定方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及宏基因组鉴定领域，具体而言，涉及基于纳米孔测序平台的宏基因组样本建库方法、鉴定方法及试剂盒。
背景技术
宏基因组测序鉴定相较于传统的培养鉴定方法，具有鉴定周期短、对操作及鉴定人员的技术水平要求低等优势。而且宏基因组测序克服了很多不能培养的微生物的鉴定弊端，被越来越多地应用于微生物鉴定中，特别是不明原因病原微生物的鉴定。目前主流的宏基因组测序方法主要是高通量测序方法，包括二代测序和三代测序。二代测序鉴定存在不少问题，比如：二代测序的鉴定通常从样本到结果的周期较长(>72h)；测序读长短，增加生信拼接的难度和时长；测序仪投入大，通常需要多样本合并测序以降低成本；三代测序如纳米孔测序以其包括超长序列读长、实时数据产生和生信分析和设备小巧便携等卓越的特征，似乎已是目前比较快捷方便的宏基因组研究方法。
但无论是二代测序还是三代测序，高通量测序都是基于样本基因组的，但在大多数的临床样本中，由于炎症反应等，往往存在大量宿主DNA，病原体DNA只占很少的一部分。因此，得到的测序数据中只有很小的一部分能够用于真正的物种和耐药基因鉴定，并且从大量的原始数据中通过生物信息学方法，过滤掉宿主序列需要大量的计算能力且耗时较长，也会影响临床样本中低丰度病原体鉴定的敏感性。
目前基于纳米孔测序平台开发的快速鉴定流程中，英国的Grady教授(DOI:https://doi.org/10.1101/387548)团队开发的针对感染样本的湿实验去宿主结合快速PCR条形码合并建库的流程是目前最为成熟的技术路线(见图1)。Grady的方法，首先通过破坏宿主细胞膜游离宿主DNA，再通过盐依赖的HL-SAN酶降解宿主DNA，离心收集细菌为主的微生物菌体，再针对细菌DNA进行提取，通常经过这个过程后得到的核酸量往往很低。因此，采用了起始量要求较低(1-5ng)的快速PCR建库试剂盒，先通过转座酶加上条形码，再通过一步全基因组PCR扩增来提高DNA总量，最后通过快速接头连接即可完成建库，上机测序数据实时basecalling，2h的总数据即可成功完成鉴定细菌病原体。
但该方法存在几个不足之处：
首先，在整个湿实验过程中存在一些必须的纯化步骤，所以整体流程并不像文章中呈现的可以在4h完成，根据实际检验，全流程需要5.5h完成；其次，由于去宿主DNA步骤尽量去除了样本中绝大部分的宿主DNA，导致样本的提取浓度往往极低。例如，在对于样本建库过程中由于PCR失败而无法继续建库；更重要的是，由于建库过程中存在的PCR步骤，无法避免地引入扩增偏向性，导致对于一些GC含量高的细菌的鉴定出现严重问题，菌种丰度比例严重失衡。
可见，本领域仍亟需一种更为高效便捷的宏基因组的鉴定方法。有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为准确获得样本宏基因组的序列信息和物种鉴定，本领域需要对样本进行去宿主前处理。现有技术中的技术偏见往往是在去宿主过程中要尽可能除尽宿主组分，进而选择无宿主DNA污染的样本去建库上机，比如上面提到的Grady方法和一些成熟商业化的试剂盒(MolYsisTM宿主DNA去除试剂盒)就是这个思路。而本申请在研究过程中发现，完全去宿主虽然保证了样本纯度，但同时给后期实验也会带来了一定的挑战，比如去宿主样本量的骤减需PCR扩增来富集DNA含量，不仅增加流程时间，且引入扩增偏向性。考虑到宏基因组测序鉴定全流程中除了包括了样本去宿主步骤外，还包括核酸提取，核酸建库，上机测序以及生信分析等多步骤，只有综合协调各步骤实现最快捷，最准确，且成本最低的流程似乎才是最理想的宏基因组鉴定方案。
本发明针对不同类型的临床样本进行去宿主以及测序优化，分别获得适于不同类型样本的最优体系，该最优体系呈现出出全流程运行的时间短，结果准，成本优等特性。而且意外的发现这些最优体系具有一个共同的特点，即克服完全去宿主的偏见，均采用不完全去宿主，并结合非PCR建库的手段。通过对样本的不完全去宿主，使样本宿主比例低于原始样本，但又高于Grady的常规建库流程。这样一来既可避免PCR偏向性造成的生信分析的难度，又保证DNA的总量足够建库上机，该建库不通过建库PCR步骤，可直接加接头测序，不但缩短了建库时间，更重要的是更加真实反映样本中的菌种组成和丰度，通过对临床样本的处理，准确度/吻合度远高于Grady的方法，具有巨大商业推广价值。
本发明的第一目的在于提供一种基于纳米孔测序平台的宏基因组样本建库方法，所述方法通过优化在样本建库过程中通过不完全去宿主，实现不经过PCR扩增即完成建库，并满足测序需要。
本发明的第二目的在于提供一种基于纳米孔测序平台的宏基因组鉴定方法，所述方法通过优化在样本建库过程中通过不完全去宿主，实现不经过PCR扩增即完成建库，并满足测序需要。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种基于纳米孔测序平台的宏基因组样本建库方法，所述方法包括不完全去宿主DNA的步骤和不经过PCR扩增直接建库的步骤。
在一些具体实施方式中，所述不完全去宿主DNA包括：宿主DNA游离和降解，将降解后的宿主DNA从所述样本中分离。
在一些具体实施方式中，所述宿主DNA游离包括：在所述样本中添加皂苷至终浓度0.08-0.25％，孵育5～15mim，优选地，所述皂苷在所述样本中的终浓度为0.8％、0.11％、0.13％、0.2％、0.22％或0.25％，所述皂苷的孵育时间为5min、7min、10min、12min或15min。
在一些具体的实施方式中，所述宿主DNA降解包括：在经宿主DNA游离后的所述样本中添加HL-SAN酶至终浓度10-55U/mL，孵育10～20min，优选地，所述HL-SAN酶的终浓度为10U/mL、15.6U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL、35U/mL、40U/mL、45U/mL、47.9U/mL、50U/mL或55U/mL，所述HL-SAN酶的孵育时间为10min、12min、15min、17min或20min。
在一些具体的实施方式中，所述样本在采集时为粘稠物质(可选地，所述粘稠物质为痰液、脓液或鼻腔分泌物)，或者，所述样本在采集时为非粘稠物质(可选地，所述非粘稠物质为肺泡灌洗液)。
在一些具体的实施方式中，当所述样本在采集时为粘稠物质时，所述皂苷的终浓度为0.2～0.25％，优选为0.22％，所述HL-SAN酶的终浓度为30-55U/mL，优选为35U/mL、40U/mL、45U/mL、47.9U/mL或50U/mL。
在一些具体的实施方式中，当所述样本在采集时为非粘稠物质时，所述皂苷的终浓度为0.08-0.13％，优选为0.11％，所述HL-SAN酶的终浓度为10～30U/mL，优选为15.6U/mL、20U/mL或25U/mL。
在一些具体的实施方式中，所述粘稠物质的取样量为150～250μL，优选为200μL；所述非粘稠物质的取样量为0.5～1.5mL，优选为1mL。
在一些具体的实施方式中，所述方法还包括在游离所述宿主DNA之前，对样本前处理，所述前处理包括：离心弃上清，重悬离心所得沉淀，制成重悬液；优选地，离心力为12000-14000g，离心时间为3～7min(可选地，5min)，重悬液的体积为200～300μL，优选为250μL。
在一些具体的实施方式中，所述宿主DNA与所述样本的分离包括：降解所述宿主DNA后，在样本中加入缓冲液，混匀后离心，弃上清，保留沉淀；优选地，所述缓冲液为PBS，所述缓冲液的体积为500～100μL，离心力为12000-14000g，离心时间为3～5min，所述沉淀至多保留50μL上清。
在一些具体的实施方式中，所述离心步骤包括：取200μL-1mL宏基因组样本，离心至出现沉淀；优选的离心步骤：取200μL-1mL人体或动物体宏基因组样本于2mL圆底离心管，12000-14000g离心5min，至出现沉淀。
在一些具体的实施方式中，所述宿主DNA游离步骤包括：用250μL的PBS重悬，添加皂苷溶液，吹吸混匀，室温旋转孵育10min。优选的宿主DNA游离包括：采用250μL的PBS重悬，添加200μL皂苷溶液，上下吹吸混匀；在旋转混匀仪上室温旋转孵育10min，过程中每2min吹打混匀，加入350μL水，用枪吹打混匀，30s后加12μL 5M NaCl立刻震荡；所述皂苷溶液制备方法为：500mg皂苷+10ml PBS，过滤除菌，室温避光保存，使用前稀释到工作液浓度。
在一些具体的实施方式中，所述宿主DNA降解包括：添加HL-SAN酶，孵育15min；优选的，所述宿主DNA降解包括：加800μL HL-SAN buffer液，用枪吹打混匀，所述HL-SANbuffer液为5MNaCl，100mM MgCl2水溶液；加1-3μL HL-SAN酶25U/μL，立即混匀，37℃，800rpm孵育15min。
在一些具体的实施方式中，所述将降解后的宿主DNA从所述样本中分离包括：PBS混匀，离心弃上清；优选包括：加800μL PBS，用枪吹打混匀，12000-14000g离心3min，弃上清收集，不触碰到沉淀，保留≤50μl上清。
在一些具体的实施方式中，所述建库采用以采用ONT建库试剂盒(SQK-RBK004)，具体方法如下：
1)打断加barcode：加样体系(200μL PCR小管)：
去宿主DNA 400ng，补足体积至7.5μL
条形码RB01-12(每个样本对应一个)2.5μL
反应体系：30℃1min；
80℃1min；
2)混样+纯化：混样总质量为1-1.8μg，每个样本的用量视具体浓度而定，用1×的磁珠纯化，13μL 10mM Tris-HCl pH 7.5-8.0用50mM NaCl洗脱；
3)加接头：往上述10μL样本中加入1μL RAP，室温反应10min。
在一些具体的实施方式中，所述样本为感染样本，优选的为非病毒类感染样本，更有选的为细菌性感染样本。
在一些具体的实施方式中，所述感染样本为呼吸系统感染样本；优选的，所述呼吸系统感染样本来源于痰液和肺泡灌洗液。
在一些具体的实施方式中，所述样本来源于人和动物体。
在一些方面，本发明还涉及到一种基于纳米孔测序平台的宏基因组鉴定方法，所述方法在上述建库方法基础上进一步包括利用纳米孔测序平台对建库样本进行上机测序和生信分析的步骤。
在一些方面，本发明还涉及一种基于纳米孔测序平台的宏基因组样本去宿主试剂盒，所述试剂盒包含终浓度为0.08-0.25％的皂苷溶液和终浓度为10-55U/mL的HL-SAN酶。
优选地，所述皂苷的终浓度为0.8％、0.11％、0.13％、0.2％、0.22％或0.25％，所述HL-SAN酶的终浓度为0U/mL、15.6U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL、35U/mL、40U/mL、45U/mL、47.9U/mL、50U/mL或55U/mL。
优选地，所述试剂盒用于粘稠样本，包括所述试剂盒包含终浓度为0.2～0.25％的皂苷溶液和终浓度为30-55U/mL的HL-SAN酶，更优选地，所述皂苷的终浓度为0.22％，所述HL-SAN酶的终浓度为15.6U/mL、20U/mL或25U/mL。
优选地，所述试剂盒用于非粘稠样本，包括所述试剂盒包含终浓度为0.08-0.13％的皂苷溶液和终浓度为10～30U/mL的HL-SAN酶，更优选地，所述皂苷的终浓度为0.11％，所述HL-SAN酶的终浓度为15.6U/mL、20U/mL或25U/mL。
在一些方面，本发明所述的宏基因组鉴定方法可应用于包括但不限于临床研究和科学研究等领域。
本发明所取得的有益效果：
(1)本发明所述方法简易、快速且满足检出需求，通过不完全去宿主的方法，以及去宿主流程的优化改良，省略建库PCR等流程，排除因PCR扩增导致的偏向性，能够更加真实准确地鉴定宏基因组微生物。
(2)本发明针对临床样本进行了去宿主和建库的系统优化，验证了多种不同的前处理流程，通过体系参数的改良和调整显著降低了样本建库失败几率。
(3)基于流程优化，降低单样本鉴定成本，省去了PCR相关试剂等的购买成本。
(4)缩短整体流程的鉴定时间，省去了PCR步骤，节省了2.5h，整个湿实验过程缩短到3h。
(5)相对于Grady教授流程和不做前处理直接建库的流程，本发明的不完全去宿主的方案与临床培养金标准的符合度最高，极大提升了测序结果的准确度，可信度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：Grady教授团队开发基于宏基因组鉴定流程管线示意图；
图2：本发明基于纳米孔测徐平台宏基因组鉴定流程管线示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
下述实施例和实验例涉及的仪器包括：生物安全柜、GridION、核酸自动提取工作站、高速离心机、Qubit 3.0、打断破碎仪、震荡金属浴、移液器、磁力架、冰箱等。
涉及的试剂包括：皂苷、PBS缓冲液、Promega核酸提取试剂盒、ONT建库试剂盒、AMPure XP纯化磁珠、QubitTM检测试剂盒、ONT测序芯片等。
本发明的实验流程如图2所示，本发明根据不同的样本类型做了前处理流程的优化，使得宿主比例低于原始样本，但高于Grady的原始流程，这样经过提取纯化后的核酸，可以直接用快速条码试剂盒建库上机，数据实时分析，具体实验步骤如下：
一、病原体富集流程
1.痰液去宿主流程
1.1.取200μL样本加入2ml圆底离心管，加入1ml解稠剂；
1.2.涡旋震荡后，42℃、400rpm震荡孵育5min，12000g离心5min；
1.3.弃掉上清(不要触碰到沉淀，可以留≤50μl上清)，250μL PBS重悬沉淀。用枪上下吹打充分混匀(用枪头尖搅动沉淀，上下吹打——忽略那些小的难以重悬的颗粒)；
1.4.加入200μL 0.5％皂苷，上下吹吸混匀，皂苷额终浓度为0.22％。在旋转混匀仪上室温旋转10min；
注：5％皂苷：500mg皂苷+10ml PBS。过滤除菌，室温避光保存。有效期一周。使用前稀释到工作液浓度；
1.5.加入350μL水，用枪吹打混匀，30s后加12μL 5M NaCl，立刻震荡。
注：所有的溶液使用前必须过滤除菌。
1.6.加800μL HL-SAN buffer(5M NaCl，100mM MgCl2水溶液)用枪吹打混匀。(这一步的沉淀比较溶液重悬)；
1.7.加3μL HL-SAN立即混匀，HL-SAN的终浓度为47.9U/mL，在37℃、800rpm孵育15min；
1.8.加800μL PBS，用枪吹打混匀，12000g离心3min；
1.9.弃上清(不要触碰到沉淀，可以留<＝50μl上清)。
2.肺泡灌洗液去宿主流程
2.1.取1ml样本于2ml圆底离心管用于下面去宿主流程；
2.2.14000g离心5min；
注1:如果样本没有沉淀，可以提高离心的时间；
2.3.用250μL的PBS重悬；
2.4.加入200μL 0.25％皂苷，皂苷的终浓度为0.11％，上下吹吸混匀。在旋转混匀仪上室温旋转10min，孵育的过程中每2min用枪吹打混匀；
注：5％皂苷：500mg皂苷+10ml PBS。过滤除菌，室温避光保存；有效期一周，使用前稀释到工作液浓度；
2.5.加入350μL水，用枪吹打混匀，30s后加12μL 5M NaCl，立刻震荡；
2.6.800μL PBS重悬(用枪吹打混匀)，加100μL HL-SAN buffer(5M NaCl，100mMMgCl2水溶液)用枪吹打混匀。(这一步的沉淀比较溶液重悬)；
2.7.加1μL HL-SAN，立即混匀，HL-SAN的终浓度为15.6U、mL，37℃、800rpm孵育15min；
2.8.加800μL PBS，用枪吹打混匀，14000g离心3min；
2.9.弃上清(不要触碰到沉淀，可以留<＝50μl上清)。
二、核酸提取
2.1.样本用700μL PBS重悬，将液体转移至Lysing Matrix E破碎管中；
2.2.在fastprep-5G仪器上设置破碎参数：6m/s，40s运行一次；
2.3.14000g离心10min，吸取500μL上清，采用Promega核酸提取试剂盒：
三、建库上机：
3.1.纯化
3.1.1.取上步核酸提取的样本35-50μL加水补齐至100μL；
3.1.2.加入平衡至室温的1.2×beads，室温旋转混匀孵育5min，瞬离放磁力架上去上清；
3.1.3.500μL新鲜配制的70％酒精洗2次beads；
3.1.4.加入11μL水，室温旋转混匀孵育2min，瞬离放磁力架上至澄清；
3.1.5小心吸取10μL上清至1.5ml低吸附的离心管中，取1μL qubit检测浓度；
3.2.建库：以采用ONT建库试剂盒(SQK-RBK004)为例。
3.2.1.打断加barcode：
加样体系(200μL PCR小管)：
去宿主DNA 400ng 补足至7.5μL
RB01-12(每个样本对应一个) 2.5μL
反应体系：
30℃ 1min；
80℃ 1min；
3.2.2.混样+纯化
混样总质量为1-1.8μg，每个样本的用量视具体浓度而定。用1×的磁珠纯化，纯化方法同上，13μL 10mM Tris-HCl pH 7.5-8.0with 50mM NaCl洗脱(注：取1μL Qubit定量)。
3.2.3.加接头
往上述10μL样本中加入1μL RAP，室温反应10min。
3.3.上机
3.3.1.室温融化：Sequencing Buffer(SQB)、Loading Beads(LB)、Flush Tether(FLT)、Flush Buffer(FLB)，融化后立即放入冰盒。
3.3.2.Sequencing Buffer(SQB)和Flush Buffer(FLB)涡旋混匀后，短暂离心，放入冰盒。
3.3.3.Flush Tether(FLT)短暂离心后，用移液枪吹匀，放入冰盒。
3.3.4.打开Nanopore测序仪器的盖子，顺时针打开Flow cell的Priming port的盖子。
3.3.5.检查Priming port的盖子下面是否有气泡，用移液器吸取少量体积以去除气泡：
(1)将1000μL量程的移液器调至200μL；
(2)将枪头插入Priming port
(3)缓慢调节旋钮，直至看到少量体积的缓冲进入枪头，移开移液器。
3.3.6.准备Priming mix：往融化并且混匀的Flush Buffer(FLB)中加入30μL融化并且混匀的FlushTether(FLT)，用移液器上下吹匀。
3.3.7.通过Priming port往Flow cell中加入800μL Priming mix，避免引入气泡，等待5min。
3.3.8.用移液器将SQB和LB充分吹匀。
3.3.9.在一个新的管子里，准备上样文库：
3.3.10.打开SpotON sample port的盖子。
3.3.11.通过Priming port往Flow cell中加入200μL Priming mix，避免引入气泡；
3.3.12.混文库，用移液器吹打混匀；
3.3.13.通过SpotON sample port往flow cell中加入75μL样品，一滴一滴地加入，确保流入port中再加入下一滴。
3.3.14.小心地盖上SpotON sample port的盖子，确保塞子进入SpotON port，关上priming port。
3.4.测序运行
采用三代测序平台GridION/MinION进行测序。
3.5.生信分析
对测序下机数据进行生信分析。
以下结合具体的实施例来证明本发明所产生的技术效果。
实施例1去宿主反应体系优化
本发明通过设置不同的皂苷浓度(5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％……)和HL-SAN酶的用量(10μL、5μL、3μL、1μL……)对多例临床样本进行了去宿主实验，发现虽然样本的异质性非常大，但1％以上的皂苷浓度处理的效果都与Grady教授使用的5％的皂苷去宿主效果类似，不能显著提高最终提取的核酸量。最终，为了满足建库要求，我们通过去宿主效果、菌量损失平衡等多方因素综合考虑，将痰液和肺泡灌洗液的处理条件分别确定，并进一步用随机收取的临床样本，按照该条件进行前处理，再利用建库试剂盒建库上机，确定了流程的可行性、稳定性和高效性。
实施例2临床阳性病原体样本的鉴定结果
本发明针对随机收取的临床培养阳性的细菌性感染痰液和肺泡灌洗液样本各30例，按照上述方法进行宏基因组进行建库和测序鉴定，以临床培养结果作为对照(所述临床培养结果来源于微生物培养和质谱鉴定)。结果全部建库上机成功，下表1是详细鉴定结果与培养金标准的比对结果。
表1.本发明流程病原体检出结果与培养金标准详细比对表
结果表明，采用本发明流程能够检出的病原体分别为肺泡灌洗液20例，痰液26例。其中未检出的纹带棒状杆菌和多食伯克霍尔德菌，进一步通过后续生物信息学优化发现，该未检出是因为采用的比对数据库中不包含纹带棒状杆菌和多食伯克霍尔德菌，因此不属于本发明湿试验流程所导致的未检出。所以校正后的本发明流程针对肺泡灌洗液和痰液的阳性检出率分别为87％(26例/30例)和97％(29例/30例)，如表2所示。
表2.本发明流程病原体检出结果与阳性检出率表
实施例3与Grady流程的比较
本发明进一步随机收取了临床培养阳性的细菌性感染痰液样本27例和肺泡灌洗液样本23例，严格按照Grady开发的进行病原体鉴定(图1)，结果表明：有1例痰液样本和12例肺泡灌洗液样本，建库均失败(由于PCR后核酸浓度<4ng/μg,无法上机测序)。下表3是Grady建库成功的样本的详细鉴定结果与培养金标准的比对结果。
表3.Grady流程病原体建库上机成功结果与培养金标准详细比对表
表4.Grady流程病原体建库上机成功结果与阳性检出率表
表4结果表明：针对阳性临床样本，Grady的阳性检出率分别为39％和41％，另外痰液样本和肺泡灌洗液样本的建库失败率为3.7％和52.2％，而采用本发明的去宿主及建库流程的针对痰液和肺泡灌洗液的阳性检出率分别为67％和87％(矫正后检出比例为87％和97％)，建库成功率为100％。相比之下，本发明对于样本的普适性更强，并且显著提高了和临床阳性样本的测序检出率。
对于用Grady流程不能完成建库的1例痰液和12例肺泡灌洗液，进一步跳过去宿主前处理过程直接提取总DNA，再继续按照Grady流程建库，建库成功，验证其阳性检出率。下表5是这部分样本的详细鉴定结果与培养金标准的比对。
表5.Grady流程不做前处理步骤直接提取建库上机病原体检出结果与培养金标准详细比对表
表6.未经前处理的Grady流程，直接提取建库上机，病原体的检出结果与阳性检出率表
表5～6结果表明：按照Grady流程前处理无法建库的样本即便直接提取建库上机测序，其实际检出率也仅有50％，这说明基于纳米孔测序平台，在完全不去宿主情况下，想要完成快速准确检测微生物组是十分困难的。
结论：本发明显著优于目前本领域最好的Grady开发的基于纳米孔测序平台的宏基因组去宿主测序鉴定方法以及传统的不去宿主直接建库测序的鉴定方法。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
