基于杂交、延伸连接反应的核酸捕获文库制备方法
技术领域
本发明涉及一种基于杂交、延伸连接反应的核酸捕获文库制备方法，属于核酸检测技术领域。
背景技术
高通量测序技术发展后测序成本降低，但测序之后的庞大的数据量分析工作难度加大。测序深度更高后导致测序的数据量越来越大，分析工作也是越来越困难。近年来测序技术的发展逐渐形成了两个方向：大而全的全基因组测序 (Whole Genome Sequencing)和小而精的靶向捕获测序(Target Capture Sequencing)。
与全基因组测序相比，捕获测序可以针对感兴趣的区域进行分离与富集，可以大大降低后续的数据分析工作。在遗传突变、肿瘤筛查等领域，靶向捕获所能达到的灵敏度也是全基因组测序完全无法实现的。由于捕获测序在测序前就对基因的目标区域进行了分离与富集，目标区域的大幅减少可实现5000×甚至更高的测序深度。测序深度的提高意味着更高的灵敏度(能够检测低频率的变异)，其检测极限低至0.1％。靶向捕获方法主要包括杂交捕获、分子倒置探针以及多重PCR。
杂交捕获根据核酸分子碱基互补杂交原理，设计分子探针。探针可以和目标区域通过碱基互补配对结合，从而将目标区段捕获。非捕获区域会被洗脱丢弃，之后通过变性(一般是调节PH值到碱性)将探针和捕获区段分开，被捕获的片段即可进行二代测序。一般来说，杂交捕获根据探针状态的不同分为固态杂交和液态杂交。优点是捕获的区段大，均一性好，缺点是特异性差。因为样本是随机打断，捕获时候可能与部分目的区段杂交，导致含有部分目的区段的片段被捕获。
分子倒置探针(MIP)技术优势是特异性好而且捕获完成后的片段直接完成了建库(杂交捕获后还需要构建测序文库，主要是添加Index和测序接头)。其原理是设计一个口袋状探针，H1和H2能和目标区段退火，然后利用DNA 聚合酶将探针缺口补齐，同时添加DNA连接酶，将缺口处磷酸二酯键连接，即可构成一个完整的环状探针。然后通过外切酶将游离的探针消化，完整的探针包括目标区段的序列，利用通用序列作为后续文库构建的引物(可添加index 和测序引物)，扩增产物可以直接作为二代测序文库。优点是特异性高，但是缺点是捕获效率不高。
多重PCR富集是目前应用比较广泛的，适合大规模样本的捕获方法，主要以Life公司和Illumina公司的两种方法为主：Ion Ampliseq最关键之处在于引物设计，该公司设计的引物可以满足1000-2000重单管反应。优点：方法简单，起始量低至10ng，在PCR产物以及石蜡样本中有明显优势。难点：引物池是需要丰富的引物设计经验，目前只有thermo做的好，并且将经验做成了软件，登陆www.ampliseq.com提交序列即可。Illumina公司的方法：针对目标区段设计两段探针，探针和DNA双链中的一条链杂交，通过DNA聚合酶和DNA连接酶的作用，将探针中间的缺口补齐。上下游探针携带有通用序列，之后利用携带通用序列的建库引物(index和测序引物等)进行扩增以后即完成建库。优点是保证多个扩增子扩增效率的一致性，缺点是连接反应操作繁琐，并且对起始模板浓度要求比较高。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种基于杂交、延伸连接反应的核酸靶向捕获测序文库制备方法，开发一种比较灵活的，操作简单，耗时较短的靶向区域捕获建库方法，尽量减少因PCR扩增效率差异造成的捕获区域均一性很差的现象。
本发明的第一个目的是提供一种基于杂交、延伸连接反应的核酸靶向捕获测序文库制备方法，包括如下步骤：
(1)针对1～20位需要捕获的位点进行捕获探针引物设计，使目的区域延伸长度在150bp-200bp之间；这个延伸长度可以满足双端测序时目的序列部分覆盖两次，结果更加准确；
(2)将基因组DNA加热变性后，与步骤(1)设计的捕获探针引物、杂交液进行杂交，捕获探针引物与基因组DNA上的目的区域进行结合；
(3)加入延伸反应试剂，对步骤(2)捕获成功的DNA片段进行碱基延伸反应；
(4)添加连接反应试剂进行连接反应，连接步骤(3)延伸反应后DNA 片段的缺口；
(5)添加只对单链DNA片段作用的核酸酶，消化多余的脱氧核糖核苷三磷酸和杂交引物；
(6)采用PCR反应扩增捕获成功的DNA片段，并加上测序所需的接头序列；
(7)纯化后进行测序。
进一步地，所述杂交液包括50-100mM NaCl、10-20mM Tris-HCl、10-20mM MgCl2和1-2mM DTT，pH 7.0-8.0。
进一步地，所述延伸反应试剂包括10X Klenow fragment buffer、Klenowfragment、dNTP(10mM)和H2O。
进一步地，所述的连接反应试剂包括Taq DNA Ligase、10X Taq DNA LigaseBuffer(dATP)、延伸反应产物和H2O。
进一步地，在步骤(5)中，所述核酸酶为EcoR I。
进一步地，所述的接头序列为5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAA GAGACAG-3’(SEQID NO.1)和5’-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCC ACGAGAC-3’(SEQ ID NO.2)。
进一步地，在步骤(1)中，所述的需捕获的位点为rs11235604、rs750188 782、rs2228479、rs2143340、rs401681、rs26722、rs1051168、rs5219、rs10489 90、rs1041981、rs429358、rs2738058、rs1799752、rs2395029、rs6706649、rs9 904341、rs2736098、rs2153271、rs201038679或rs1001179中的一种或多种。
进一步地，在步骤(7)中采用Ampure XP磁珠对PCR产物进行纯化。
进一步地，在步骤(7)中，所述的测序采用的是二代测序仪进行测序。
本发明的有益效果是：
本发明的靶向区域捕获建库方法比较灵活，特异性高，捕获效率高，操作简单，耗时较短，并且能够尽量减少因PCR扩增效率差异造成的捕获区域均一性很差的现象。
附图说明
图1为本发明靶向捕获方法原理示意图；
图2为rs6706649位点测序数据进行结果分析图；
图3为rs401681位点测序数据进行结果分析图；
图4为rs26722位点测序数据进行结果分析图；
图5为rs2736098位点测序数据进行结果分析图；
图6为rs2143340位点测序数据进行结果分析图；
图7为rs1041981位点测序数据进行结果分析图；
图8为rs2395029位点测序数据进行结果分析图；
图9为rs2738058位点测序数据进行结果分析图；
图10为rs2153271位点测序数据进行结果分析图；
图11为rs11235604位点测序数据进行结果分析图；
图12为rs5219位点测序数据进行结果分析图；
图13为rs1001179位点测序数据进行结果分析图；
图14为rs750188782位点测序数据进行结果分析图；
图15为rs201038679位点测序数据进行结果分析图；
图16为rs1048990位点测序数据进行结果分析图；
图17为rs1051168位点测序数据进行结果分析图；
图18为rs2228479位点测序数据进行结果分析图；
图19为rs1799752位点测序数据进行结果分析图；
图20为rs9904341位点测序数据进行结果分析图；
图21为rs429358位点测序数据进行结果分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
在本发明中，需捕获的位点为rs11235604、rs750188782、rs2228479、 rs2143340、rs401681、rs26722、rs1051168、rs5219、rs1048990、rs1041981、 rs429358、rs2738058、rs1799752、rs2395029、rs6706649、rs9904341、rs2736098、rs2153271、rs201038679或rs1001179中的一种或多种，位点信息见表1，引物信息见表2：
表1位点信息
表2引物信息
实施例1：
一、选取24例样本，参照核酸提取试剂盒厂家的说明书，对患者(受试者) 的全血、唾液或者其他组织进行DNA提取，DNA的浓度及纯度符合检测要求。
二、主要试剂：主要包括PCR混合缓冲液(PCR buffer Mix)；dNTP Mix；PCREnzyme；SAP混合缓冲液(SAP Buffer Mix)；SAP酶(SAP E nzyme)；iPLEX Buffer；iPLEXTermination mix；iPLEX Enzyme
三、PCR反应体系及扩增程序
(1)DNA的准备
准备50-250ng基因组DNA样本，终体积5-10ul。
(2)杂交引物的准备
a)首先将订购的20个位点的上下游引物稀释到100uM，引物稀释液是10 mM Tris-HCl，pH＝8.0。
b)将所有位点的Forward引物吸取2ul进行混合，Reverse引物吸取2ul混合，终浓度均为5uM。
c)混合好的Forward引物再稀释5倍即为杂交引物CP1，混合好的Reverse 引物再稀释5倍即为杂交引物CP2。
将订购的两个位点的引物进行稀释，储存液100uM，再稀释到1-5uM，并分装保存。(需要添加捕获位点的两条混合引物pool。需要把订购的20个位点干粉稀释到100uM。再把20个位点的F和R引物混合至终浓度1-5uM。)
(3)杂交反应
杂交程序：
(4)延伸反应
试剂混匀后短暂离心，25℃反应15min。
(5)连接反应
试剂混匀后短暂离心，45℃反应15min。
(6)去除多余的杂交引物
反应程序：
37℃下30分钟
80℃下15分钟
(7)PCR反应
a.向新的PCR管中加入20-25ul外切酶消化产物
b.加入各1-3ul通用引物及0.5-2ul index1引物(10uM)到上一步离心管中。
c.加入20-30ul PCR Master Mix至离心管中。
d.混合均匀后，在PCR仪上进行扩增，程序如下：
95℃下3分钟
30次以下循环：
98℃下30秒钟
65℃下30秒钟
72℃下30秒钟
72℃下4分钟
保持在12℃。
(8)纯化文库
a.转移45ul上清液到新的PCR管中，再加入36ul磁珠溶液。
b.将板以1800rpm的速度摇动2分钟。
c.在室温下孵育5分钟。
e.在280×g下离心1分钟。
f.置于磁力架上，并等到液体变得清澈为止(约2分钟)。
g.取出并丢弃每个孔中的所有上层清液。
h.按以下方式清洗两次。
i.将200ul新制备的浓度为80％的乙醇加到每个样品孔中。
j.在磁力架上孵育30秒钟。
k.使用20微升移液器从每个孔中移除残留的EtOH。
l.从磁力架上取下，并风干5分钟。
m.将25ul洗脱液加到每个孔中。
n.将板以1800rpm的速度摇动2分钟。请确保所有微珠均已重悬。如有必要，请移液以混匀，并重复摇动步骤。
o.在室温下孵育2分钟。
p.在280×g下离心1分钟。
q.置于磁力架上，并等到液体变得清澈为止(约2分钟)。
r.转移20ul已纯化的文库到新的96孔板中。
(9)文库定量用荧光染料或者qPCR方法对文库进行定量。
(10)建好的文库进行二代测序实验。
(11)测序数据进行结果分析。
IGV软件截图结果见图2～21：
1)图2～21中，小框中第一行为该碱基的染色体位置，证明此位置为SNP 位点的正确位置；
2)Total count为测序的深度；
3)最后几行是各个碱基的测序深度数值，“+”“-”表示序列正向和反向；
4)N表示没有结果的深度数值。
本方法特异性高：本发明方法杂交时间比传统杂交短，杂交结束后，几个简单反应就完成建库，传统捕获杂交是首先建好文库，再进行杂交，还需要多步磁珠纯化步骤。并且杂交前没有进行PCR扩增，减少了常规杂交建库的扩增步骤造成的非特异。
本方法捕获效率高：合适的探针数量及先杂交再扩增提高了捕获效率；而常规杂交捕获方法中随机打断会造成模板不完整，从而捕获效率降低。
本方法扩增效率差异小：以杂交后捕获到的产物作为后续PCR扩增的模板，由于第一步杂交各个位点捕获效率相近，从而后续扩增效率差异较小。而传统方法的建库是以PCR后产物再进行杂交捕获，最终捕获产物的均一性会受前一步PCR中扩增效率差异影响，差异较大。
本方法应用灵活：杂交时间较短，杂交和建库实验操作简单。捕获位点数可以灵活选择，捕获建库样本数也可以灵活选择。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
