DNA编码化合物库构建中通过氧化酰胺化制备On-DNA酰胺化合物的方法
技术领域
本发明属于DNA编码化合物库技术领域，具体涉及一种通过氧化酰胺化由On-DNA醛基化合物和小分子胺制得On-DNA酰胺化合物的方法。
背景技术
美国Scripps研究院的Sydney Brenner和Richard Lerner教授于1992年提出了DNA编码化合物库(DNA Encoded Library，简称DEL)的概念(参考文献：Proc.Natl.Acad.Sci.,1992,89,5381)，该方法通过将一个有机小分子试剂与一段独特序列的DNA在分子水平进行连接，利用组合化学的“组合-拆分”策略通过两个至多个循环快速地构建数量巨大的化合物库，该化合物库中每一个化合物都由不同有机小分子试剂残基组成，并由相应的唯一碱基序列的DNA标识，将少量的DNA编码化合物库与靶标进行亲和筛选，与靶标没有吸附的库分子先被洗掉，留下与靶标有吸附的库分子再洗脱下来，这时得到的库分子浓度很低，常规手段难以分析和识别，通过DNA独有的聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，简称PCR)可以把得到的与靶标有吸附的库分子中的DNA部分进行复制扩增直至得到的DNA量可以被DNA测序仪识别，测序后的数据再通过构建DNA编码化合物库时创建的小分子试剂与DNA碱基序列之间的关系表来解码，进而找到具有潜在活性分子相对应的具体化合物对应的小分子试剂，再通过传统的有机合成方法把这些小分子试剂组合在一起得到筛选的目标分子，检测并确认其对靶标的生物活性。
DNA编码化合物库的构建方法主要有三种，第一种是以美国Ensemble公司为主利用DNA模板技术得到的DNA导向分子库(DNA-Templated Chemical Library Synthesis，简称DTCL)，第二种是以美国GSK公司，X-Chem公司和国内的成都先导为主利用DNA标记技术得到的DNA记录分子库(DNA-Recorded Chemical Library，简称DRCL)，第三种是以瑞士Philogen公司为主基于片段的药物设计(Fragment-based drug discovery，简称FBDD)技术得到的编码自组装分子库(Encoded Self-Assembling Chemical Libraries，简称ESAC)，目前工业上被大量运用的构建DNA编码化合物库的方法主要是第二种，该方法操作简单，成本更低，能更快速地利用组合化学方法得到含有海量的化合物的DNA编码化合物库。
除了DNA起始片段(详见本公司发明专利：CN108070009A,CN109868268A)外，需要有大量的DNA标签和可以按照一定顺序进行反应的有机小分子试剂。DNA标签的编码可以通过一定的计算机程序来获得(详见本公司发明专利：CN107958139A)，再通过DNA合成仪得到具体的DNA碱基序列的引物。有机小分子试剂的获得，可以使用一定的计算机程序来对获得的试剂清单进行筛选得到(详见本公司发明专利：CN108959855A)。
DEL库领域目前最主要的工作之一是DNA上化学反应的开发，简称On-DNA化学反应。因为DNA必须在一定的水相中、pH、温度、金属离子浓度和无机盐浓度下才能保持稳定，因此，对DNA损伤小、有较好的回收率和底物适应性广的On-DNA化学反应，才是大规模应用于DNA编码化合物库的合成所需要的。目前公开报道的On-DNA化学反应种类近120种，包括水相的、固相的和DNA模板反应(详见在线数据库DEL ChemFinder，https://delopen.org/reactions)，每种的反应条件少则一种，多则十几种，可以说，在其他情况一样的情况下，On-DNA化学反应的种类越多，条件越丰富，普适性越好，在DNA编码化合物库的设计时的选择性才越多，最终DNA编码化合物库的合成成功率才越高，得到的DNA编码化合物库的多样性才越丰富。
在DNA编码化合物库的构建中，酰胺键是一种最常见、最重要的成键方式之一，目前最主要的是通过小分子羧酸和DNA上的胺基来形成On-DNA的酰胺键，而通过小分子有机胺和DNA上的羧基来反向合成方法来形成On-DNA的酰胺化合物也有报道(参考文献：Nat.Chem.Biol.,2009,5,9,647-654,CN109456368A,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,2019,58(28),9570-9574,Org.Lett.,2019,21,7,2194-2199,ACS Comb.Sci.,2019,21,2,75-82)，但是该类反应普适性不好，使用受到小分子有机胺的限制，特别是邻位杂环类芳胺的反应成功率较低。
为了得到一种普适性更好的反向合成方法来形成On-DNA的酰胺化合物的方法，我们研究并开发了本发明的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种DNA编码化合物库构建中通过氧化酰胺化制备On-DNA酰胺化合物的方法，
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
一种DNA编码化合物库构建中通过氧化酰胺化制备On-DNA酰胺化合物的方法，将摩尔浓度为0.1～2.0mM的On-DNA醛基化合物与10～500摩尔当量的小分子伯胺、10-200摩尔当量的铜盐、10～500摩尔当量的氧化剂混合，在20～100℃下反应1～24小时直至反应结束，制得On-DNA酰胺化合物；反应方程式如下：
其中，所述On-DNA醛基化合物的结构式为：DNA-CHO，结构式中的DNA与CHO通过一个或多个化学键连接；所述小分子伯胺为分子量≤1000的伯胺，其结构式：R-NH2；On-DNA酰胺化合物的的结构式为DNA-CO-NH-R；
其中，所述On-DNA醛基化合物以及On-DNA酰胺化合物中的DNA是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链；
其中，所述反应的反应溶剂是含乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或几种的含水的混合溶剂；
其中，所述铜盐选自铜单质、氯化亚铜、溴化亚铜、碘化亚铜、氧化亚铜、醋酸亚铜、三氟乙酸铜、醋酸铜、硫酸铜中的一种或多种；
其中，所述氧化剂选自碘单质、过氧化氢、过氧化叔丁醇、四甲基哌啶氧化物中的一种或多种。
具体的，小分子伯胺的结构式R-NH2中，R可任意选为在前述方法的反应条件下不直接与醛基(CHO)及伯氨基(NH2)发生化学反应的基团。
在一种优选的实施方式中，On-DNA醛基化合物的摩尔浓度是0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，或2.0mM。优选的，On-DNA醛基化合物的摩尔浓度为0.5～1.5mM；优选的，On-DNA醛基化合物的摩尔浓度为0.8～1.2mM；优选的，On-DNA醛基化合物的摩尔浓度为1.0mM。
On-DNA醛基化合物溶于水溶液后的摩尔浓度是0.1～2.0mM；优选地，所述On-DNA醛基化合物水溶液的摩尔浓度为1.0mM。
在一种优选的实施方式中，所述小分子胺的摩尔当量是50～400当量；优选的，所述小分子胺的摩尔当量是100～300当量；优选的，所述小分子胺的摩尔当量是200当量。
在一种优选的实施方式中，所述铜盐选自氯化亚铜、溴化亚铜、碘化亚铜、氧化亚铜、醋酸亚铜中的至少一种；优选地，所述铜盐选自氯化亚铜、溴化亚铜、碘化亚铜中的至少一种；优选地，所述铜盐选自碘化亚铜。
在一种优选的实施方式中，所述铜盐的摩尔当量是10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，或200当量。优选的，所述小分子胺的摩尔当量是50～100当量；优选的，所述小分子胺的摩尔当量是80当量。
在一种优选的实施方式中，所述氧化剂选自过氧化氢或过氧化叔丁醇；优选地，所述氧化剂选自过氧化叔丁醇。
在一种优选的实施方式中，所述氧化剂的摩尔当量是10～500当量；优选的，所述氧化剂的摩尔当量是20～400当量；优选的，所述氧化剂的摩尔当量是40～200当量；优选的，所述氧化剂的摩尔当量是50～100当量；优选的，所述氧化剂的摩尔当量是100当量。
在一种优选的实施方式中，所述反应的反应温度为20～100℃；优选地，所述反应的反应温度为20～50℃；优选地，所述反应的反应温度为20～35℃；优选地，所述反应的反应温度为25℃。
在一种优选的实施方式中，所述反应的反应时间为1～24小时；优选地的，所述反应的反应时间是4～20小时；优选地的，所述反应的反应时间是8～16小时；优选地的，所述反应的反应时间是16小时。
在一种优选的实施方式中，所述方法用于批量的多孔板操作；优选的，所述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。
本发明提供一种在DNA编码化合物库构建中通过氧化酰胺化方法得到On-DNA酰胺化合物的方法，扩大了本公司的DNA编码化合物库的多样性，得到的DNA编码化合物库的库分子更能满足市场的需要。
本发明的方法具有反应普适性好、条件温和、成本低、操作方便、收率高，适合于多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。
附图说明
图1为本发明用On-DNA芳基醛基化合物3与芳胺经氧化酰胺化，制备得到相应的On-DNA酰胺化合物的小分子有机胺的代表结构式。
图2为本发明用On-DNA烷基醛基化合物9与芳胺经氧化酰胺化，制备得到相应的On-DNA酰胺化合物的小分子有机胺的代表结构式。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1On-DNA芳基醛基化合物5的合成
1)On-DNA芳基醛基化合物3的合成
DNA-NH2化合物1(例如专利CN108070009A的提及的起始头片段)溶于250mM,pH＝9.5的硼酸缓冲液，配制成1mM浓度溶液，与酸2使用EDCI作为缩合剂、s-NHS缩合活化剂反应得到相应的on-DNA芳硝基化合物3(参考文献：Nat.Chem.,2015,7,3,241)，该反应完成后只做乙醇沉淀处理，浓缩干燥后直接用于下一步的反应。
2)On-DNA酰胺化合物5的合成
上述On-DNA芳基醛基化合物3溶于水，配制成1mM浓度溶液，分装到96孔板中，分别加入芳胺4(400mM的乙腈溶液，200摩尔当量)，碘化亚铜(50mM的乙腈溶液，80摩尔当量)，过氧化叔丁醇(200mM的水溶液，100摩尔当量)，混合后于摇床中在25℃下反应16小时，之后，向反应液加入二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物(200mM的水溶液，240摩尔当量)，混合物在80℃下反应30分钟以去除铜。
加入乙醇沉淀：
向96孔板的反应孔加入总反应液体积10％的5M氯化钠溶液，封膜，振荡混匀后，加入总体积3倍的在-20℃储存的冷无水乙醇，于-80℃冰箱冷冻2小时，之后拿出在4℃以4000G的离心力离心30分钟，吸除上清液，沉淀用去离子水溶解后于-40℃真空冻干，得到产物，通过酶标仪检测OD确认回收率，同时检测LC-MS确认每个小分子的转化率(见图1)。
实施例2On-DNA氨基磷酸酯10的合成
1)On-DNA烷基醛基化合物9的合成
DNA-NHMe化合物6(例如类似于专利CN108070009A的提及的起始头片段)溶于250mM,pH＝9.45的硼酸缓冲液，配制成1mM浓度溶液，与酸7的钠盐(200mM的水溶液，42.5摩尔当量)使用DMT-MM(200mM的水溶液，40摩尔当量)作为缩合剂于20℃反应3小时得到相应的On-DNA缩醛化合物8(参考文献：Med.Chem.Commun.,2016,7,1316-1322)，该反应完成后只做乙醇沉淀处理，浓缩干燥后直接用于下一步的反应。
On-DNA缩醛化合物8溶于水，配制成1mM浓度溶液，加入醋酸水溶液(300mM)，于50℃反应1小时得到On-DNA烷基醛基化合物9，该反应完成后只做乙醇沉淀处理，浓缩干燥后直接用于下一步的反应。
2)On-DNA酰胺化合物10的合成
上述On-DNA烷基醛基化合物9溶于水，配制成1mM浓度溶液，分装到96孔板中，分别加入芳胺4(400mM的乙腈溶液，200摩尔当量)，碘化亚铜(50mM的乙腈溶液，80摩尔当量)，过氧化叔丁醇(200mM的水溶液，100摩尔当量)，混合后于摇床中在25℃下反应16小时，之后，向反应液加入二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物(200mM的水溶液，240摩尔当量)，混合物在80℃下反应30分钟以去除铜。
乙醇沉淀：向96孔板的反应孔加入总反应液体积10％的5M氯化钠溶液，封膜，振荡混匀后，加入总体积3倍的在-20℃储存的冷无水乙醇，于-80℃冰箱冷冻2小时，之后拿出在4℃以4000G的离心力离心30分钟，吸除上清液，沉淀用去离子水溶解后于-40℃真空冻干，得到产物，通过酶标仪检测OD确认回收率，同时检测LC-MS确认每个小分子的转化率，代表结构式的转化率见图2。
综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
