一种L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法。
背景技术
β-丙氨酸(B-alanine)，即3-氨基丙酸(3-aminopropanoic%20acid)，又称为β-氨基丙酸，β-丝析氨酸，β-初油氨基酸，其化学索引号(CAS)为107-95-9，分子式为C3H7NO2。目前国内外生产β-丙氨酸主要采用化学合成法合成，根据初始原料的不同可以分为丙烯腈法、丙烯酸法、琥珀酰亚胺(丁二酰亚胺)降解法、β-氨基丙腈法、生物法等等。
L-天冬氨酸α-脱羧酶又称L-天冬氨酸l-脱羧酶，其能催化脱去L-天门冬氨酸的α羧基，生成β-丙氨酸，其反应式如下所示：
众所周知，L-天冬氨酸α-脱羧酶的酶活测定方法是研究该酶的基础，目前正在不断建立和改进。现已有的L-天冬氨酸α-脱羧酶活性测定方法有以下几种：
①测定14CO2含量，L-天冬氨酸α-脱羧酶将L-[1-14C]-天门冬氨酸转化成β-丙氨酸，释放出14CO2，收集14CO2，通过电闪仪测定14CO2含量。
②测定β-[1-14C]-丙氨酸含量，L-天冬氨酸α-脱羧酶将L-[4-14C]-天门冬氨酸转化成β-[1-14C]-丙氨酸，转化一定时间后经离心、洗涤等处理，进行纸层析网或硅胶薄板层析，然后用放射自显影测定β-丙氨酸含量。另外可以用离子交换的方法纯化14C-标记β-丙氨酸，再用放射自显影测定β-丙氨酸含量。该法灵敏度高，但放射性物质的使用具有一定危险性，普通实验室也不具备该条件。
③柱前衍生高效液相色谱法，2，4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色谱法为直接检测β-丙氨酸与L-天冬氨酸的新方法。该已知方法色谱条件包括：色谱柱为Zorbax SB C18柱(5μm，4.6*250mm);流动相A为0.02mol/LNaAc-HAc缓冲液，pH6.2，流动相B为乙腈，采用线性梯度洗脱：时间(min)0-20，流动相B(体积百分含量)5-33%;流速为1.0mL/min;柱温为30℃;检测器为紫外可见光检测器，检测波长为360nm，参比波长为600nm：进样量为20μL。然而，该方法操作复杂，衍生配方组分多，衍生剂用量大，实施成本高，分析时间过长，因此并不适用于高通量的筛选。
发明内容
由于现有技术并不适用于以高通量的方式筛选出高活性的L-天冬氨酸α-脱羧酶，本发明致力于提供一种脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法，其能快速筛选出活性较高的L-天冬氨酸α-脱羧酶。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：
一种L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法，其包括以下步骤：
S1：制备L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库孔板;
S2：向L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库孔板中加入破碎液，充分震荡，离心，取上清加入到深孔板中，并加入天冬氨酸溶液，摇床反应;
S3：取反应后的深孔板，先用乙腈灭活，离心，再取上清液到酶标检测板;然后向所述酶标检测板中加入pH指示剂，并放入酶标仪，在560nm～600nm波长下读取OD值，最后筛选出较高OD值对应的L-天冬氨酸α-脱羧酶。
优选地，在上述L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法中，步骤S1包括：
S11：使用移液工作站的铺A板程序，向无菌浅孔板A的每个孔加入200μL含抗生素的培养基LB;使用挑菌机从表达L-天冬氨酸α-脱羧酶的大肠杆菌培养皿中挑取单克隆至浅孔板A的每个孔，恒温摇床培养，得到培养好的浅孔板A菌落;
S12：使用移液工作站的铺B板程序，向无菌深孔板B的每个孔加入400μL含抗生素的培养基TB;使用挑菌机从浅孔板A接种到对应的深孔板B的每个孔，恒温摇床培养，并准备对照板平行培养;当测得对照板中的OD值达到0.6-0.8后，从摇床取出深孔板B，并加入IPTG同步诱导对照板和深孔板B，再次恒温摇床培养;隔天取出对照板，稀释10倍后测OD值，当OD<1后，取出次培养板(指经IPTG诱导后的深孔板B(不包括对照板))，离心，去上清，将板内残留液拍干，-20℃冷冻保存，得冻存的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库孔板。
优选地，在上述L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法中，步骤S2中所述破碎液的配制方法包括：
称取溶菌酶、核酸酶、PMBS，加入纯水后混匀即得;其中溶菌酶：核酸酶：PMBS的质量比为2：1：1;纯水添加量为1mL/mg溶菌酶。
优选地，在上述L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法中，步骤S2中所述天冬氨酸溶液的浓度为20～60g/L，且所述天冬氨酸溶液的配制方法包括：
称取L-天冬氨酸，加入缓冲液，调节pH至6.0-9.0即得;其中，所述缓冲液选自以下任一种：四硼酸钠缓冲液，Tris-HCl缓冲液，三乙醇胺缓冲液，甘氨酸缓冲液，磷酸缓冲液。
优选地，在上述L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法中，步骤S2中所述摇床反应的温度为40℃，且所述摇床反应的持续时间为24小时。
优选地，在上述L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法中，步骤S3中所述pH指示剂为百里酚蓝溶液或苯酚红溶液。
进一步优选地，在上述L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法中，所述百里酚蓝溶液的浓度为0.1～0.2g/L。
进一步优选地，在上述L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法中，所述苯酚红溶液的浓度为0.01～0.1g/L。
进一步优选地，在上述L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法中，步骤S3中所述灭活的方式为a)加入乙腈或b)在烘箱中热处理。
因此，本发明所提供的技术方案与现有技术相比至少具备以下有益效果：本发明所述L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法操作简便，实施准确，筛选速度快、效率高，而且成本较低。
总之，所述L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法特别适用于筛选出更多高活性的L-天冬氨酸α-脱羧酶，因此也有利于酶科学技术的推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明所述的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库的高通量筛选方法，其包括以下步骤：
S1：制备L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库孔板;
S2：向L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库孔板中加入破碎液，充分震荡，离心，取上清加入到深孔板中，并加入天冬氨酸溶液，摇床反应;
S3：取反应后的深孔板，先用乙腈灭活，离心，再取上清液到酶标检测板;然后向所述酶标检测板中加入pH指示剂，并放入酶标仪，在560nm～600nm波长下读取OD值，最后筛选出较高OD值对应的L-天冬氨酸α-脱羧酶。
在一个优选实施例中，步骤S1包括：
S11：使用移液工作站的铺A板程序，向无菌浅孔板A的每个孔加入200μL含抗生素的培养基LB;使用挑菌机从表达L-天冬氨酸α-脱羧酶的大肠杆菌培养皿中挑取单克隆至浅孔板A的每个孔，恒温摇床培养，得到培养好的浅孔板A菌落;
S12：使用移液工作站的铺B板程序，向无菌深孔板B的每个孔加入400μL含抗生素的培养基TB;使用挑菌机从浅孔板A接种到对应的深孔板B的每个孔，恒温摇床培养，并准备对照板平行培养;当测得对照板中的OD值达到0.6-0.8后，从摇床取出深孔板B，并加入IPTG同步诱导对照板和深孔板B，再次恒温摇床培养;隔天取出对照板，稀释10倍后测OD值，当OD<1后，取出次培养板(指经IPTG诱导后的深孔板B(不包括对照板))，离心，去上清，将板内残留液拍干，-20℃冷冻保存，得冻存的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库孔板。
在一个优选实施例中，步骤S2中所述破碎液的配制方法包括：
称取溶菌酶、核酸酶、PMBS，加入纯水后混匀即得;其中溶菌酶：核酸酶：PMBS的质量比为2：1：1;纯水添加量为1mL/mg溶菌酶。
在一个优选实施例中，步骤S2中所述天冬氨酸溶液的浓度为40g/L，且所述天冬氨酸溶液的配制方法包括：
称取L-天冬氨酸1.2g，加入30mL 0.1M四硼酸钠缓冲液，调节pH至6.0即得。
在一个优选实施例中，步骤S2中所述摇床反应的温度为40℃，且所述摇床反应的持续时间为24小时。
在一个优选实施例中，步骤S3中所述pH指示剂为百里酚蓝溶液或苯酚红溶液。
在一个进一步优选的实施例中，所述百里酚蓝溶液的浓度为0.125g/L。
在一个进一步优选的实施例中，所述苯酚红溶液的浓度为0.04g/L。
实施例1
取加好抗生素的培养基LB倒入已灭菌的96孔板加样槽，使用移液工作站的铺A板程序，在无菌浅板的每个孔加入200μL的培养基LB。从冰箱取出表达L-天冬氨酸α-脱羧酶的大肠杆菌培养皿，平放于通风洁净处，蒸发培养皿表面的冷凝水。使用挑菌机从表达L-天冬氨酸α-脱羧酶的大肠杆菌培养皿中挑取相应数量的单克隆至96孔平底浅板，挑取结束后取出96孔平底浅板，封上透气膜，贴上浅板对应的标签，放入进口摇床中，以180rpm，80%的湿度、30℃过夜培养18-20h。
取加好抗生素的培养基TB倒入已灭菌的96孔板加样槽，使用移液工作站的铺B板程序，在无菌深孔板的每个孔加入400μL的培养基TB。准备好过夜培养好的浅孔板A，从浅孔板取20μL接种到相应的深孔板B中，立即给深孔板封透气膜;30℃，湿度80%，250rpm摇床培养，并准备对照板。培养一段时间后，取出对照板，测OD，当OD达到相应值(0.6-0.8)后，从摇床取出深孔板，并加入IPTG同步诱导对照板和深孔板B;每孔45μL IPTG溶液封上透气膜。过夜培养30℃,250rpm，80%湿度。隔天取出对照板，稀释10倍后测OD，当OD<1后，取出过夜培养的次培养板(指经IPTG诱导后的深孔板B(不包括对照板))，4℃，4000rpm，离心10-15min去上清，轻轻将板内残留液拍干封上透气膜，-20℃冷冻保存，得到冻存的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库孔板。
实施例2
配制40mL破碎液：称取0.04g溶菌酶，0.02g核酸酶，0.02g PMBS，加入40mL纯水后混匀。取出冻存的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库孔板，用移液工作站铺板程序往每孔加入200μL破碎液，放在振荡器上以700rpm振荡1小时。配制0.1M四硼酸钠40mL：称取1.144g四硼酸钠，加入40mL纯水后混匀备用。配制40g/L天冬氨酸溶液，30mL：称取L-天冬氨酸1.2g，加入30mL0.1M四硼酸钠缓冲液，用盐酸和氢氧化钠调节pH至6.0。把破碎完的库孔板放入离心机离心，转速4000rpm，10min，离心后用移液工作站取上清100μL加入到96孔深孔板，并加入100μL 40g/L的天冬氨酸溶液，放入40℃摇床反应24小时。
实施例3
配制1g/L百里酚蓝母液：称取0.10g百里酚蓝溶于2.2mL4g/L氢氧化钠溶液，加入5mL乙醇，用纯水定容至100mL。配制40mL 0.125g/L百里酚蓝溶液：取5mL 1g/L百里酚蓝母液,加入35Ml 20%乙醇稀释至0.125g/L。取反应后的深孔板，用移液工作站加入200μL乙腈灭活30min后放入离心机离心，4000rpm，10min后用移液工作站吸取上清100μL放入酶标检测板，并加入100μL0.125g/L百里酚蓝溶液，放入酶标仪在600nm波长下读取OD值;较高的OD值表明对应的L-天冬氨酸α-脱羧酶的活性越高。
实施例4
配制40mL破碎液：称取0.04g溶菌酶，0.02g核酸酶，0.02g PMBS，加入40mL纯水后混匀。取出冻存的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因突变库孔板(制备步骤同实施例1)，用移液工作站铺板程序往每孔加入200μL破碎液，放在振荡器上以700rpm振荡1小时。把破碎完的库孔板放入离心机离心，转速4000rpm，10min，离心后用移液工作站取上清20μL加入到96孔深孔板，封膜后放入50℃摇床中热处理16小时;热处理完成后，用移液工作站往孔内加入180μL22g/L pH为7.0的天冬氨酸溶液，封膜，放入50℃摇床反应1小时;反应后把孔板放到95℃的烘箱中热处理20min，热处理完后放入水里冷却孔板;孔板离心(4000rpm，10min，4℃)，离心后用移液工作站取100μL上清液到酶标检测板;用移液工作站取100μL 0.04g/L苯酚红指示剂至酶标检测板;把该酶标检测板放到酶标仪上震荡20秒后在560nm波长下读取OD值;较高的OD值表明对应的L-天冬氨酸α-脱羧酶的活性越高;酶标仪检测数据如下表1所示：
表1 B10000351号库孔板检查结果
并且，按照以下公式计算酶活性提升倍数：
酶活性提升倍数=(样本OD值-阴性对照OD平均值)/(阳性对照OD平均值-阴性对照OD平均值)
例如，E4对应计算结果如下：
阳性对照OD平均值=
(0.7982+0.7774+0.6327+0.8389+0.8180+0.7358+0.8016+0.8150+0.8251)/9=0.7825
阴性对照OD平均值=(0.3952+0.4549+0.4978)/3=0.4493
倍数=(1.297-0.4493)/(0.7825-0.4493)=2.54
同理，可以筛选出“酶活性提升倍数”为2.5倍(E4)、2.2倍(E5)、1.9倍(G3)的活性很高的L-天冬氨酸α-脱羧酶。
对比例
本对比例采用已知的色谱方法分析筛选L-天冬氨酸α-脱羧酶：
表2样本衍生过程
称取2.0122g四硼酸钠，加入90mL纯水，用6M盐酸或5M氢氧化钠溶液调节pH至10.4，用纯水补充体积至100mL。称取0.0250g OPA，加入5mL0.1M四硼酸钠溶液，溶解后备用。称取0.1000g N-异丁酰基-L-半胱氨酸(N-i-Bu-L-Cys)，加入5mL 0.1M四硼酸钠溶液，溶解后备用。取40μL待测样本(例如1g/L产物标样，其为β-丙氨酸标样)加到96孔深孔板，再依次加入80μL 0.1M四硼酸钠溶液，40μL 5g/L OPA溶液，40μL 20g/L N-异丁酰基-L-半胱氨酸溶液，封膜后在25摄氏度室温，700rpm转速下震荡10min。震荡结束后在4000rpm转速下离心10min，取上清180μL于液相检测。
色谱柱：ZORBAX XDB-C18，50mm×3.5um，流速：1mL/min，柱温：40℃，波长：338nm;流动相0.05M醋酸钠和甲醇;梯度洗脱程序如下表3所示：
表3梯度洗脱程序
可见分析时间为：8.5min每个样本。
若按照上述方法分析实施例4中96孔板离心后的上清液中的β-丙氨酸(96孔板离心、取上清液之前的步骤同实施例4)，从而对应地筛选出较高活性的L-天冬氨酸α-脱羧酶，则至少需要13.6小时才能完成，所耗费的操作时间远长于实施例4。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
