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库制备

2020-11-09 01:01:07

  库制备

  技术领域

  本发明涉及制备用于下一代测序的DNA库。

  背景技术

  DNA的下一代测序(NGS)可快速提供大量医学上重要的遗传信息。NGS测序仪器对由临床或生物样品制备的DNA库进行操作。DNA库制备通常使用商业试剂盒,所述商业试剂盒随附用于分离所关注的基因的试剂和说明书。一种常用库制备型试剂盒是由启迪公司(Illumina)(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))以商标TRUSEQ出售的库制备型试剂盒。

  典型库制备试剂盒和方案提供输入DNA的片段化,随后进行末端修复、珠粒净化、A加尾、衔接子接合、珠粒净化、PCR扩增和最终珠粒净化。净化步骤可通过其它已知方法进行,但使用磁珠的净化是流行的,因为使用来自如安津考特(Agencourt)等公司的商业上可获得的试剂盒和说明书相当简单。

  虽然费时,但珠粒净化被认为是库制备中的必要步骤,因为来自一个步骤的过量试剂如果不被去除,将会干扰或妨碍后续步骤的成功完成。具体来说,应理解,在接合之后需要纯化以去除与后续PCR扩增不相容的衔接子和其它接合反应组分,例如高浓度的镁和PEG。此外,现有方案需要不同的PCR引物以便扩增功能性最终测序库。

  发明内容

  本公开提供不需要在衔接子接合与PCR扩增之间纯化并且其中衔接子寡核苷酸可在扩增期间充当引物的DNA库制备方法。在优选实施例中,将衔接子添加到DNA片段上,并且接着在无中间净化步骤的情况下扩增所述片段。实际上,在一些实施例中,起始衔接子的至少一个寡核苷酸链可以充当扩增引物。

  在一些实施例中,部分双链衔接子在DNA片段的两端接合到游离5'端上,此后延伸3'端以复制完整衔接子序列。衔接子可为至少部分双链的以通过接合酶促进识别和酶催化。在片段跨越衔接子的主链延伸之后,使衔接子的次要链移位,所得的衔接子接合片段通过聚合酶链反应(PCR)扩增。本公开包括展示在衔接子接合与扩增之间不需要纯化或净化步骤的结果。因此,在扩增期间可能仍存在为衔接子接合而存在的材料,包括如衔接子、酶、辅因子等的材料。衔接子和衔接子添加的其它实施例在本公开的范围内。

  在某些实施例中,第一衔接子接合到DNA片段上并且第二衔接子与其杂交,之后第二衔接子延伸穿过第一衔接子以形成扩增的寡核苷酸延伸产物。扩增甚至可以使用第二衔接子作为引物。在不停止或中断以进行净化步骤的情况下扩增寡核苷酸延伸产物。来自衔接子接合步骤的过量材料(如酶、衔接子或辅因子)不会干扰扩增步骤并且扩增步骤的进行不考虑来自接合步骤的试剂的存在。实际上,在优选实施例中,接合和扩增步骤利用共同引物,第二衔接子寡核苷酸。

  本公开的方法适用于单引物富集,其中靶标特异性引物和衔接子用于衔接子接合步骤并且接着还在扩增步骤中用作引物。在此类实施例中,将靶DNA片段化,并且接合索引的正向衔接子。将包含靶探针和反向衔接子的寡核苷酸退火到片段上并且延伸。使所得ds产物变性,并且使PCR引物退火以用于扩增和库富集。

  所述方法的实施例在PCR步骤之后只需要单一纯化或珠粒净化。本公开的方法与DNA的机械和酶催化剪切两者相容。根据本公开使用的衔接子允许接合和PCR扩增两者,而无需添加不同PCR引物(其需要具有Illumina Y-衔接子)。因此,本公开提供其中消除接合后珠粒净化的库制备方法。根据本公开的方法的库制备可在不超过单一纯化或珠粒净化步骤的情况下进行,并且产生用于测序的高质量库。库制备方法使用也充当PCR引物的测序衔接子。另外,本公开的方法与酶催化和机械DNA片段化两者相容。

  本发明的各方面提供制备测序库的方法。所述方法包括从来自样品的核酸获得多个DNA片段,将所述DNA片段与衔接子寡核苷酸一起培育以形成衔接子接合片段,其中至少第一衔接子寡核苷酸接合到片段上,并且至少第二衔接子寡核苷酸与所述片段杂交并且通过聚合酶延伸,从而形成与靶标互补并且与第一衔接子寡核苷酸互补的序列,并且在衔接子寡核苷酸的存在下扩增DNA片段以形成多个扩增子。在扩增步骤期间,第二衔接子寡核苷酸的拷贝充当引物。

  在某些实施例中,衔接子接合和扩增包括(a)将第一衔接子附接到每个DNA片段的5′端;(b)使一或多个第二衔接子寡核苷酸退火到DNA片段上,由此一或多个寡核苷酸中的每个包含与存在于片段中的一或多个中的相关序列互补的3′部分,以及包含第二衔接子序列5′部分;(c)用聚合酶延伸所述一或多个第二衔接子寡核苷酸,从而产生一或多个寡核苷酸延伸产物,其中第一衔接子在第一端并且第二衔接子序列在第二端;以及(d)扩增-其中无中间净化或纯化步骤-使用第二衔接子寡核苷酸作为扩增引物的一或多个寡核苷酸延伸产物,以富集在每一端处含有第一衔接子序列和第二衔接子序列的核酸片段。

  方法任选地包括纯化扩增子以去除过量材料。扩增子可以附接到流动池表面以形成测序簇。方法可以包括对扩增子测序以测定核酸的序列。在一些实施例中,所述方法以逆转录RNA中的任一种开始以获得DNA核酸和/或将来自样品的核酸片段化以获得多个DNA片段。

  附图说明

  图1图式一种库制备的方法。

  图2说明本公开的方法的操作。

  图3展示所述方法的步骤。

  图4展示根据所述方法制备的库成员。

  图5图式用于热循环仪的示例性程序。

  图6展示接合反应组分对PCR的影响。

  图7展示实验设置以展示消除接合后珠粒纯化的影响。

  图8给出实验的结果以展示消除接合后珠粒纯化的影响。

  图9展示了以下结果:将DNA片段输入到末端修复和接合反应中,接着进行PCR扩增。

  图10图式Y形衔接子和片段。

  图11展示通过衔接子接合制备的库的迹线和酶片段化核酸的扩增。

  具体实施方式

  本公开涉及用于核酸的下一代测序的简化库制备方法。

  本公开的方法包括将衔接子添加到DNA片段(例如通过将包括至少部分dsDNA的衔接子的自由端接合到DNA片段的游离5'端,或插入片段)上并且在无中间净化步骤的情况下扩增衔接子(并且任选地通过使用来自衔接子中的一或多个的未接合链作为扩增引物)。

  在某些实施例中,两个衔接子序列接合到插入片段的5'端上,接着延伸插入片段的3'端以复制衔接子序列。衔接子序列的拷贝变成PCR引物的引发位点,所述PCR引物与衔接子的长链或接合链相同。除了条形码、条形码引发位点和测序器引发位点以外,衔接子的长链还代表簇形成中所使用的序列中的一些或优选全部。衔接子的短寡核苷酸可与3'端接合(并且得到延伸)或不接合(仅用于使DNA接合酶能够与衔接子相互作用,因为接合酶期望dsDNA)。

  任选地,使用不接合的短寡核苷酸,因此3'延伸在DNA插入片段/片段的3'端起始,与短寡核苷酸的3'端相对。使用高浓度的衔接子确保足够的未接合的寡核苷酸将可用作PCR引物。(如果短寡核苷酸在两端被阻断,那么其无法接合或延伸,这使得库更干净,并且对于PCR中的干扰的关注也更少了。存在衔接子寡核苷酸但不干扰PCR的情境与此类似,但现在衔接子的残余接合寡核苷酸必须用更长寡核苷酸稀释(以提供完整序列)或部分降解以具有比用于PCR步骤的寡核苷酸更低的Tm)。

  此处,已证实DNA库制备可以在PCR步骤之后仅用单次珠粒净化即可实现。已证实与DNA的机械和酶催化剪切两者相容的工作流程。已展示在不添加不同PCR引物的情况下使用允许接合和PCR扩增两者的衔接子。

  本公开的益处包括其中可消除接合后珠粒净化的方法;产生高质量库的三步、单次珠粒净化方案;以及其中衔接子还充当PCR引物的方法。

  其它实施例在本公开的范围内。

  在一些实施例中,本公开的方法包括(通过接合、杂交和延伸)将测序衔接子添加到DNA片段以形成寡核苷酸延伸产物并且在无任何中间纯化或洗涤步骤的情况下扩增寡核苷酸延伸产物。当根据本公开的方法制备测序库时,在衔接子接合后存在的材料(其可以包括过量分子实体(如酶和衔接子)以及辅因子或其它试剂)不会阻止成功的扩增反应,这简化库制备工作流程。

  图1图解库制备的方法101。方法包括从样品获得107多个DNA片段。这可以包括获得包括待测序的核酸和在核酸为RNA的情况下,将RNA逆转录到输入DNA中,并且将核酸片段化以产生DNA片段的样品。接着将DNA片段末端修复113以提供钝端片段。DNA片段与衔接子寡核苷酸、接合酶、聚合酶和其它试剂一起培育以将第一衔接子寡核苷酸接合125到DNA片段。第二衔接子寡核苷酸与所述片段杂交并且延伸以形成寡核苷酸延伸产物。寡核苷酸延伸产物在来自接合的过量材料的存在下扩增129以形成多个扩增子或库成员。库成员可以用于形成可以测序135的测序簇。

  本公开的方法可以用于产生在以少到10pg双链DNA开始的下一代测序中使用的库。库构建工作流程适合于广泛范围的测序应用,包括RNA测序、数字基因表达(DGE)、基因组DNA测序、靶标捕获、扩增子测序、ChIP测序等等。这些库适合于在Illumina测序平台上测序。

  图2说明本公开的方法的操作。将衔接子201引入到DNA片段207中(例如,在末端修复113之后)。在所描绘的实施例中,衔接子201过量添加并且各自包括长链205和短链209。在所描绘的实施例中,长链205的3'端接合到片段207的游离5'端上(衔接子201的双链部分有助于与接合酶的相互作用)。这种衔接子添加125可以包括用聚合酶210延伸片段(同时例如移位短链209)。

  衔接子添加125产生衔接子接合片段213,其包括任意有义链215和互补链214。衔接子接合片段213进行扩增129,其包括使衔接子接合片段213熔融并且进一步包括使任意有义链215和互补链214的引物杂交。

  在一个实施例中,接合衔接子寡核苷酸不用作库扩增引物。举例来说,接合衔接子寡核苷酸可不为全长。举例来说,长衔接子寡核苷酸可以是来自Illumina衔接子的3'端的30个碱基。在扩增中,可以添加PCR引物,其可以更长并且将全长Illumina衔接子的其余部分添加到扩增库。

  尽管PCR引物与扩增中的长衔接子寡核苷酸之间可能存在竞争,但仍制备全长库(如通过所附实例中的数据所示)。在若干不同实施例中(例如其中(i)衔接子寡核苷酸存在并且与扩增引物竞争;(ii)衔接子寡核苷酸充当扩增引物;和/或(iii)单引物延伸实施例,其中第一衔接子接合并且第二衔接子与第一衔接子杂交且在第一衔接子上方延伸),在实施例中常见的是缺乏衔接子添加与扩增之间的净化步骤或纯化的任何要求。

  因此,本公开提供一种库制备方法,其中将衔接子添加到片段上,所述片段随后在无中间珠粒净化或纯化步骤的情况下扩增。来自衔接子添加步骤的材料(包括过量衔接子)可以在扩增期间存在,并且所包括的结果显示,那些材料不干扰成功扩增,从而产生适合于NGS测序的库。

  在任选的实施例中,引物中的一个由衔接子201的长链205(所述衔接子201已经过量添加)提供。衔接子201的长链205因此与衔接子接合片段213的互补链214杂交并且在扩增129步骤的核心处延伸。

  所说明的是根据某些可能实施例的某些可能步骤。在这类实施例中,两个衔接子序列接合到插入片段的5'端上,接着延伸插入片段的3'端以复制衔接子序列。衔接子序列的拷贝变成PCR引物的引发位点,所述PCR引物与衔接子的长链或接合链相同。为了使这个起作用,除了条形码、条形码引发位点和测序器引发位点以外,衔接子的长链还现在需要代表簇形成中所使用的全部序列。衔接子的短寡核苷酸可与3'端接合(并且得到延伸)或不接合(仅用于使DNA接合酶能够与衔接子相互作用,期望ds DNA)。可能优选的是使用不接合的短寡核苷酸,使得3'延伸在DNA插入片段/片段的3'端起始,与短寡核苷酸的3'端相对。使用高浓度的衔接子确保足够的未接合的寡核苷酸将可用作PCR引物。所说明的DNA库制备方法可以在PCR步骤之后仅用单次珠粒净化即可实现。工作流程与DNA的机械和酶催化剪切两者相容。衔接子允许接合和PCR扩增两者,而无需添加不同的PCR引物。

  其它实施例在本发明的范围内。

  图3展示某些实施例的步骤。所述方法可以包括将基因组DNA或双链cDNA片段化107,末端修复113以产生钝端,衔接子添加125与任选的复用和PCR扩增129以产生最终库。

  在步骤125处,DNA片段与衔接子寡核苷酸一起培育以形成衔接子接合片段,其中至少第一衔接子寡核苷酸与片段接合,并且至少第二衔接子寡核苷酸与片段杂交并且通过聚合酶延伸,从而形成与靶标互补并且与第一衔接子寡核苷酸互补的序列。关于细节,参见美国专利9,650,628,其以引用的方式并入。形成寡核苷酸延伸产物的重要子步骤如下陈述。衔接子添加125包括(a)将第一衔接子附接到每个DNA片段的5′端;(b)将第二衔接子寡核苷酸退火到DNA片段上,由此第二衔接子寡核苷酸具有与存在于片段中的一或多个中的相关序列互补的3′部分,以及包含第二衔接子序列的5′部分;以及(c)用聚合酶延伸第二衔接子寡核苷酸,由此产生一或多种寡核苷酸延伸产物,其中第一衔接子在第一端并且第二衔接子序列在第二端。

  方法101进一步包括在衔接子寡核苷酸的存在下扩增129寡核苷酸延伸产物以形成多个扩增子。在扩增步骤期间,第二衔接子寡核苷酸的拷贝充当引物。可快速完成包括片段化的整个工作流程,并且产生准备用于簇形成和单端测序或双端测序135的DNA库。重要的是,在方法101中,可以在无中间纯化步骤(如珠粒洗涤)的情况下进行衔接子添加125和扩增129的步骤。实际上,在扩增步骤129中,接合125步骤的第二衔接子寡核苷酸可以充当扩增引物。另外,可发现其它接合材料(过量衔接子、辅因子(如Mg、PEG)、酶(如接合酶))根本不干扰扩增129。因此,方法101可以包括(d)使用第二衔接子寡核苷酸作为引物扩增129一或多种寡核苷酸延伸产物。方法可包括美国专利9,650,628中所描述的步骤,所述专利出于所有目的以引用的方式并入。

  除与基因组和其它双链DNA源一起使用以外,方法还可以与输入RNA一起使用。重要的是,对于DNA测序应用,低丰度样品可以直接输入到库构建工作流程而不需要预扩增。本公开的方法产生适用于在测序平台(例如Illumina平台)上进行单端测序或双端测序的DNA库,而不需要基于凝胶的大小选择。

  图4展示根据所述方法制备的库成员。适用于簇产生的库可以使用少到10pg双链DNA输入在数小时内产生。根据所述方法产生的库可以包括来自试剂供应商的条形码,例如8bp条形码序列,所述序列可以在数据分析之前输入到测序软件中。

  库制备方法101可以在三个阶段中包括:获得107DNA片段,并且所述方法进一步包括剪切的DNA313的末端修复;衔接子接合325;以及扩增329。可以优选地使用阳性对照DNA,以允许建立性能基线。

  一般来说,所述方法将根据包括设置和解冻所指示的试剂的工作流程进行。试剂和反应管可以解冻、制备并且保持在冰上。在解冻和混合缓冲剂混合物之后,如果观察到任何沉淀物,那么缓冲剂可以再混合/再溶解,平缓地升温并且短暂地涡旋。一般来说,酶和引物未升温。观察到标准移液技术。可使用热循环仪进行方法101的步骤。

  图5图式用于热循环仪的示例性程序。一些实施例采用具有经设计用于0.2mL管并且配备有加热盖的加热块的热循环仪。遵循由制造商提供的操作说明书来制备程序。对于具有可调整加热盖的热循环仪,仅当样品温度达到30℃以上时将盖温度设定为100℃。对于具有固定温度加热盖(例如ABI GENE AMP PCR 9600和9700模型)的热循环仪,使用默认设置(通常100到105℃)。

  在一些实施例中,方法301包括DNA片段化307。可使用任何适合的片段化方法,包括机械、化学或酶催化片段化。

  在某些实施例中,将完整gDNA稀释到120pL的1×低EDTA TE缓冲液中,转移到Covaris搭扣盖微管中,并且遵循Covaris推荐设置将其片段化成所要插入片段大小。

  方法101的优选实施例包括末端修复313。末端修复313可包括使用末端修复缓冲液混合物(例如如由加利福尼亚州圣卡洛斯的NuGEN技术公司出售)、末端修复酶混合物、末端修复增强子和无核酸酶的水。将试剂混合并且根据制造商的说明书培育。末端修复步骤313可在经编程以运行程序1(末端修复;参见图5)或另外根据制造商的说明书在热循环仪中发生。

  在末端修复313之后,钝端片段进行衔接子添加125。根据制造商的说明书将衔接子和相关试剂添加到管中。在优选实施例中,打算共用相同测序流动池道的所有样品应具有独特的接合衔接子。在一些实施例中,接合反应将在热循环仪中进行(接合;参见图5)。衔接子添加包括第一衔接子的接合、第二衔接子的杂交和延伸,以形成寡核苷酸延伸产物。

  本公开的一个见解是纯化,如在衔接子添加125之后并且在扩增步骤129之前的珠粒洗涤是不需要的,并且实际上,用于添加125的衔接子可继续存在并且用于扩增。在添加125之后,过量衔接子(和其它试剂或材料)可存在于寡核苷酸延伸产物之中。那些过量材料可包括镁或其它金属、其它辅因子、磷酸盐、聚乙二醇(PEG)、酶(如接合酶)、过量衔接子和钝端片段。

  重要的是,方法101可以在无纯化步骤的情况下进行。

  方法101继续进行到库扩增129。对于扩增,添加扩增酶、缓冲剂和引物混合物并且根据制造商的说明书混合。扩增129可以在经编程以运行程序3(库扩增;参见图5)的预升温热循环仪中发生。富集伪影可在扩增129之后出现。在一些情况下,PCR富集可在下游库大小分析中产生伪影,其在生物分析仪或凝胶分析期间呈现为高分子量物种。此现象归因于在其端处具有相同衔接子序列的不同库分子的扩增。随着在PCR期间库分子的浓度增加,衔接子端开始与PCR引物竞争杂交,产生部分杂交的物种。尽管这可能影响PCR效率,但其并不影响用于后续测序的库质量,也不影响通过qPCR的定量。

  在扩增129之后,可能需要进行扩增子131的纯化135。对于DNA纯化,可以选择允许小体积洗脱的基于核酸柱的纯化系统,如反应净化,其以商标名MINELUTE由凯杰出售。此处为方便起见描述由安津考特提供的基于珠粒的纯化方案。

  在室温下通过倒置管和轻触管将珠粒悬浮于无核酸酶水中。

  通过移液将珠粒悬浮液引入到微离心管和混合物中的DNA样品中。

  将含有珠粒样品混合物的PCR管转移到磁体中并且静置5分钟以完全澄清珠粒溶液。

  去除并且丢弃结合缓冲液;用乙醇洗涤。

  风干磁体上的珠粒。

  将1×低EDTA TE缓冲液或无核酸酶水添加到干燥珠粒中。

  将管转移到磁体;去除洗脱液。

  从磁体中去除并且放在一旁。

  对于珠粒纯化步骤135,遵循制造商的说明书。给出以上轮廓以辅助理解步骤的顺序。对于精确试剂、计时和体积,参见制造商的说明书。进行任何QC步骤,如用于库的定量和定性评估的任何所需步骤。人们可任选地进行库的定量和定性评估。在生物分析仪DNA1000芯片上运行样品。

  用于32-重衔接子盘和96-重衔接子盘的多重反应物条形码序列中的条形码的序列在制造商的说明书中给出。所有条形码序列通过三个的编辑距离分隔开。关于条形码设计策略的其它细节,请参考Faircloth BC,Glenn TC(2012)。并非所有创造的序列标记都相同:设计和验证序列识别标记对索引为稳固的。科学公共图书馆综合卷7(8):e42543,其以引用的方式并入。

  以引用的方式并入

  贯穿本公开已经参考并且引用了其它文献,如专利、专利申请、专利公开案、期刊、书籍、论文、网络内容。所有此类文献在此出于所有目的以全文引用的方式并入本文。

  等效物

  根据包括对本文中引用的科学和专利文献的参考的本文献的完整内容,所属领域的技术人员将显而易见除本文示出和描述的之外的本发明的各种修改以及其许多其它实施例。本文中的标的物含有重要信息、范例和指南,其可适于本发明在其各种实施例和其等效物中的实践。

  实例

  实例1.传统库制备需要接合后珠粒净化

  首先,通过实时PCR研究接合反应组分对PCR的影响。使用补充有最终1×EvaGreen染料的NuGEN OVATION Universal RNA-Seq系统PCR反应组分,用10倍连续稀释的RNA测序库和2倍连续稀释的接合反应组分制备实时PCR反应物。

  图6展示接合反应组分对PCR的影响。展示含有1.3μl的1pg/μl、0.1pg/μl、0.01pg/μl和0.001pg/μl的RNA测序库模板、和相等体积的1×、0.5×、0.25×、0.125×、0.0625×、0.03125×、0.015625×接合反应组分或水的反应物的扩增曲线。与标准PCR条件相比,接合反应组分的添加通过延迟扩增产物的出现并且缩短扩增的平台期而损害PCR扩增。接着,我们研究了通过以接合反应物与总PCR体积的不同比率将接合反应物直接混合到PCR中来消除接合后珠粒纯化的影响。通过Covaris将人类基因组DNA剪切到200bp,并且使用1ng作为输入,使用来自NuGEN OVATION Universal RNA-Seq系统的反应进行末端修复和接合。在接合之后,样品通过Ampure珠粒纯化或以1:2、1:8或1:16的体积比直接稀释到PCR反应物中。PCR产物通过Ampure珠粒纯化并且通过生物分析仪分析。

  图7显示实验设置以显示通过以接合反应物与总PCR体积的不同比率将接合反应物直接混合到PCR中来消除接合后珠粒纯化的影响。

  图8由实验产生的生物分析仪迹线以展示消除接合后珠粒纯化的影响。迹线清楚地展示需要接合后珠粒纯化以去除衔接子伪影(在约150bp处的尖锐峰)。在更大体积的PCR中稀释接合反应物可减少但不消除这些伪影。即使在1:16的接合:总PCR体积比下,也可观察到衔接子伪影的小峰。大部分NuGEN库制备试剂盒(包括Universal RNA-Seq和Ultralowv2)的接合体积为30μl。1:16的接合与PCR比率意味着480μl的PCR体积,这对于在每管最大体积为50μl的现代热循环仪上实施来说是昂贵并且繁琐的。

  实例2.接合衔接子还可以充当PCR引物

  供应有NuGEN OVATION Ultralow系统V2的衔接子可充当PCR引物。出人意料和未预期的结果是通过消除接合后的珠粒纯化并且允许未接合的衔接子参与PCR而不是添加所供应的PCR引物,可以实现不具有衔接子伪影的稳固扩增。遵循标准方案,这通过使用Covaris将100ng或10ng DNA片段化为300bp作为输入到Ultralow v2末端修复和接合反应中来展示。在接合之后,将其在标准30μl体积中进行,添加25.5μl Amp缓冲液混合物、2μlAmp酶混合物和42.5μl水以制备100μl PCR反应物。分别遵循在Ultralow用户指南中所描述的循环条件,100ng和10ng反应物分别经历9或12个循环的PCR,然后通过生物分析仪纯化和分析PCR产物。

  本公开的方法可以与单引物富集技术(SPET)靶标富集方法以及UltraLow库系统一起使用。在ultralow方法中:将两个衔接子序列接合到插入片段的5'端上;延伸插入片段的3'端以复制衔接子序列。衔接子序列的拷贝变成PCR引物的引发位点,所述PCR引物与衔接子的长链或接合链相同。

  为了使这个起作用,除了条形码、条形码引发位点和测序器引发位点以外,衔接子的长链现在还优选地代表簇形成中所使用的全部序列。衔接子的短寡核苷酸可与3'端接合(并且得到延伸)或不接合(仅用于使DNA接合酶能够与衔接子相互作用,期望ds DNA)。

  可能优选的是使用不接合的短寡核苷酸,从而3'延伸在DNA插入片段/片段的3'端起始,与短寡核苷酸的3'端相对。使用高浓度的衔接子确保足够的未接合的寡核苷酸将可用作PCR引物。如果短寡核苷酸在两端处被阻断,那么其可不接合或其可延伸。这使得库更干净,并且对于PCR中的干扰的关注也更少了。其中存在衔接子寡核苷酸但不干扰PCR的情境类似,但现在衔接子的残余接合寡核苷酸必须用更长寡核苷酸稀释(以提供完整序列)或部分降解以具有比用于PCR步骤的寡核苷酸更低的Tm。

  图9展示生物分析仪迹线,其产生于将DNA片段输入到末端修复和接合反应中,接着进行PCR扩增。迹线显示预期大小和产量的正常查找库,无衔接子伪影证据,表明NuGENUltralow衔接子在接合后纯化的情形下充当PCR引物的出人意料的能力。

基于数据,可作出某些观测和结论。下一代测序DNA库制备的领域由启迪公司控制。其最广泛使用的库制备试剂盒中的一个为纳米DNA库制备。以片段化DNA开始,所述方案由以下组成:末端修复、珠粒净化、A-加尾、Y-衔接子接合、珠粒净化、PCR和最终珠粒净化,总共3个珠粒净化和5.5小时以完成所述方案。一个版本的NuGENUltralow库系统提供简化工作流程,所述简化工作流程仅需要末端修复、接合、珠粒净化、PCR和最终珠粒净化,总共两个珠粒净化和4小时来完成所述方案。在本领域中已理解,必须在接合之后进行纯化以便去除与后续PCR步骤不相容的衔接子和其它接合反应组分,例如高浓度的镁和PEG。此外,两个方案需要不同PCR引物以便扩增功能性最终测序库。

  此处,数据显示那些长期持有的观点不正确,并且DNA库制备可以仅在PCR步骤之后通过单次珠粒净化即可实现。所展示的工作流程与DNA的机械和酶催化剪切两者相容。此处,NuGEN型衔接子允许接合和PCR扩增(即,具有充当PCR引物的衔接子),而无需添加不同PCR引物(在Illumina Y-衔接子方法下不可能的途径)。

  因此,本公开的方法提供(1)可消除接合后珠粒净化的过程;(2)三步,产生高质量库的单次珠粒净化方案;以及(3)也充当PCR引物的衔接子。

  如图8中所示,通过实时PCR研究接合反应组分对PCR的影响,其中明显需要接合后珠粒纯化以去除衔接子伪影(在约150bp下的尖锐峰)。在更大体积的PCR中稀释接合反应物可减少但不消除这些伪影。

  此处,我们已显示接合衔接子还可充当PCR引物。出人意料和未预期的结果是通过消除接合后的珠粒纯化并且允许未接合的衔接子参与PCR而不是添加所供应的PCR引物,可以实现不具有衔接子伪影的稳固扩增。

  遵循标准方案,这通过使用Covaris将100ng或10ng DNA片段化为300bp作为输入到Ultralow v2末端修复和接合反应中来展示。在接合之后,将其在标准30μl体积中进行,添加25.5μl Amp缓冲液混合物、2μl Amp酶混合物和42.5μl水以制备100μl PCR反应物。分别遵循在Ultralow用户指南中所描述的循环条件,100ng和10ng反应物分别经历9或12个循环的PCR,然后通过生物分析仪纯化和分析PCR产物。图9中展示的所得生物分析仪迹线显示预期大小和产量的正常查找库,无衔接子伪影证据,表明NuGEN Ultralow衔接子在接合后纯化的情形下充当PCR引物的出人意料的能力。

  实例3.Illumina Y-衔接子无法充当PCR引物

  图10图式Y形衔接子,例如,来自启迪公司(加利福尼亚州圣地亚哥)和片段。Illumina Y-衔接子接合到A-带尾DNA插入片段上。由于衔接子寡核苷酸的结构,无法产生衔接子的反向互补序列。因此,不存在充当PCR引物的未接合的衔接子的可能性,因为不存在反向互补序列结合位点以允许衔接子在PCR期间退火和延伸。

  实例4.本发明与酶催化片段化相容

  完整基因组DNA在15μl反应物中片段化,所述反应物含有2mU HL-dsDNase(ArcticZymes)、6U大肠杆菌DNA聚合酶I(NEB)、1.5U T4 DNA聚合酶、1×NE缓冲液2(NEB)和0.2mM dNTP,在以下温度分布下:25℃持续15分钟,65℃持续15分钟,4℃下保持。NuGENUltralow v2接合和PCR组分用于如下进行接合和PCR。通过添加3μl接合衔接子混合物、5μl接合缓冲液混合物和2μl接合酶混合物总共25μl来进行接合。在25℃的标准接合培育步骤30分钟、70℃下10分钟和4℃下保持之后,将PCR组分直接添加到接合反应中,而无珠粒纯化。添加25.5μl扩增缓冲液混合物、2.5μl扩增引物混合物、2μl扩增酶混合物和45μl水制备100μl PCR反应物。遵循在Ultralow用户指南中所描述的循环条件之后9个循环PCR之后,将PCR产物珠粒纯化并且通过生物分析仪分析。

  图11展示通过衔接子接合制备的库的生物分析仪迹线和酶片段化核酸的扩增。所得生物分析仪迹线显示预期大小和产量的正常查找库,无衔接子伪影证据,表明无接合后纯化与酶催化片段化的相容性。

  参考文献:

  TRUSEQ纳米DNA库制备指南(TRUSEQ Nano DNA Library Prep guide),文件名称truseq-nano-dna-library-prep-guide-15041110-d.pdf,可获自加利福尼亚州圣地亚哥的启迪公司的support.illumina.com(40页)

  OVATION Ultralow系统V2用户指南(The OVATION Ultralow System V2 Userguide),第0344,0344NB号,文件名称M01379_v5_User_Guide__Ovation_Ultralow_Library_Systems_V2_(Part_No._0344)_2215.pdf,可获自来自加利福尼亚州的圣卡洛斯的NuGEN技术公司的nugen.com(30页)。

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