抗PD-1纳米抗体的筛选及应用
技术领域
本发明设计纳米抗体文库的构建以及利用哺乳动物展示技术筛选医用抗PD-1纳米抗体与其应用研究。
背景技术
PD-1(programmed death 1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子，为免疫球蛋白超家族，是一个268氨基酸残基的膜蛋白。其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。PD-1和PD-L1结合启动T细胞的程序性死亡，使肿瘤细胞获得免疫逃逸。肿瘤免疫治疗领域研究热点主要集中在抗程序性死亡-1(PD-1)受体等免疫检查点抑制剂上，它和传统的化疗和靶向治疗不同，主要是通过克服患者体内的免疫抑制，重新激活患者自身的免疫细胞来杀伤肿瘤，是一种全新的抗肿瘤治疗理念。
肿瘤的免疫逃逸机制与肿瘤微环境之间存在着极为复杂的关系。肿瘤免疫治疗早期肿瘤特异性的杀伤性T细胞是有其生物活性的，但随着肿瘤生长后期失去了杀伤的功能。所以肿瘤免疫治疗是为了最大限度的提高患者自身对肿瘤的杀伤，它不但要在体内激活原有的免疫系统反应，更要维持免疫系统反应的持续时间和反应强度。人体内T细胞的活化采取了两条信号通路的系统，即通过抗原呈递细胞MHC-抗原给细胞提供第一信号外，还需要一系列分子提供第二号，才能使T细胞产生免疫应答。这个双信号通路系统严格调控着机体对自身和非自身抗原产生不同的免疫应答。如果缺少协同刺激分子提供的第二信号，将会导致T细胞的无应答或持续特异性免疫应答。肿瘤细胞通过高表达PD-L1与体内的T细胞表面的PD-1结合，弱化T细胞的杀伤能力，从而躲避T细胞的杀伤。因此，PD-1为一个行之有效的靶点，对其开发出相应的抗体是治疗此类肿瘤的有效手段之一。日前有多家跨国制药公司在研发针对PD-1的单克降抗体，通过阻断PDL1和PD-1之间相互左右，最大限度的提高患者自身对肿的免疫系统反应，从而达到对肿瘤细胞进行杀伤。如Merck公司的PD-1单克隆抗体在临床结果中，在非小细胞肺癌、黑素瘤等癌症中都看到了一定的疗效。这表明PD-1抗体对肿有着积极疗效。
哺乳动物细胞展示系统为治疗性抗体的产生提供了许多潜在的优势，包括能够在细胞表面显示功能性糖基化IgGs的同时，选择与制造相关的关键特性，如高表达和稳定性。这种技术不仅能够展示全长抗体，还能够利用真核表达系统指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而展示的抗体在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子，并在哺乳细胞中稳定且高水平的表达分泌。因此哺乳细胞展示技术具有其他技术没有的潜在优势。
在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区和两个常规的CH2与CH3区。纳米抗体结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。纳米抗体的可溶性极高，不易聚集，能耐高温、强酸、强碱等致变性条件，适合于原核表达和各种真核表达系统，广泛用于开发治疗性抗体药物、诊断试剂、亲和纯化基质和科学研究等领域。纳米抗体的应用优势用于生物医药研发(基因工程药物研发、ADC药物研发);用于临床体外诊断(胶体金法、酶联免疫吸附法);用于肿瘤研究、免疫学研究等基础研究等。纳米抗体的独特性质，使其在疾病的诊断和免疫靶向治疗等方面展现了更为广阔的应用前景。
发明内容
本发明所解决的技术问题是，如何构建纳米抗体文库并筛选出相应蛋白的纳米抗体，并用此纳米抗体有效治疗肿瘤。
为解决上述技术问题，本发明首先构建了CDR1,CDR2,CDR3随机氨基酸的纳米抗体文库。
本发明第一方面，本发明的第一方面，构建并提供了纳米抗体文库;该纳米抗体文库由框架区和决定簇互补区构成;纳米抗体文库的决定簇区CDR1,CDR2,CDR3均有随机氨基酸构成;编码决定簇区的氨基酸的核苷酸均为NNS(N：A/T/C/G;S：C/G)。
所述的纳米抗体文库决定簇互补区CDR1由7个随机氨基酸组成，CDR2由8个随机氨基酸组成，CDR3由6-16个随机氨基酸组成。
该纳米抗体的框架区FR由FR1,FR2,FR3,FR4组成;其中所述FR1氨基酸序列为表中第1-26位氨基酸;所述FR2氨基酸序列为表中第35-51位氨基酸;所述FR3氨基酸序列为表中第60-97位氨基酸;所述FR4氨基酸序列为表中第104/105/106/107/108/109/110/111/112/113/114/115/116/117/118/119-117/118/119/120/121/122/123/124/125/126/126/128/129/130/131/132位氨基酸。
为了使纳米抗体文库在哺乳动物细胞上展示以便筛选，在纳米抗体序列的羧基端加入跨膜域以便锚定在哺乳动物细胞膜上，其氨基酸序列在列表NbLSQE中所示;在纳米抗体文库序列氨基端加入分泌肽Igκ，其氨基酸序列在列表中NbLSQE中所示;纳米抗体文库与其跨膜域之间有柔性linker，其氨基酸为GGGGSGGGS。
所述纳米抗体文库的氨基酸序列如表NbLSQE中所示。
为了便于纳米抗体文库的筛选，改造CRISPR-V2慢病毒质粒，保留原有EF-1αcore启动子，剔除U6启动子到gRNA scaffold这段核苷酸序列;将纳米抗体文库构建到此慢病毒载体中，所述改造后慢病毒载体如图1所示。
为了便于抗PD-1纳米抗体的筛选，所表达的PD-1胞外域重组蛋白在真核细胞中表达，所选用的表达细胞株为HEK-293T。
为了便于抗PD-1纳米抗体的筛选，在PD-1胞外域的羧基端加上mFc以便流式分选以及检测，所述mFc序列为表SQE中所示;在mFc的羧基端连接上6个重复组氨酸(HHHHHH)标签以便纯化。
本发明也应用构建的纳米抗体文库筛选出PD-1的纳米抗体，该纳米抗体包含决定簇互补区和框架区;所述的纳米抗体决定簇互补区由CDR1，CDR2，CDR3组成;所述CDR1氨基酸序列为列表SQE中的第27-34位氨基酸;所述CDR2氨基酸序列为列表SQE中第52-59位氨基酸;所述CDR3氨基酸序列为列表SQE中98-108位氨基酸。
所述抗PD-1纳米抗体氨基酸序列表中SQE所示。
为了使所述抗PD-1纳米抗体便于纯化与检测，可在序列表中SQE所示的第1-121位氨基酸所示的蛋白质的氨基酸末端连接上6个重复组氨酸(HHHHHH)标签以便纯化。
本发明还提供了与所述抗PD-1纳米抗体相关的生物材料，B1-B12中任一种：
B1 编码权利要求1或2或3所述纳米抗体的核酸分子
B2 含有B1所述核酸分子的表达盒;
B3 含有B1所述核酸分子的重组载体;
B4 含有B2所述表达盒的重组载体;
B5 含有B1所述核酸分子的重组微生物;
B6 含有B2所述表达盒的重组微生物;
B7 含有B3所述重组载体的重组微生物;
B8 含有B1所述重组载体的重组微生物;
B9 含有B1所述核酸分子的转基因动物细胞系;
B10 含有B2所述表达盒的转基因动物细胞系;
B11含有B3所述重组载体的转基因动物细胞系;
B12含有B4所述重组载体的转基因动物细胞系。
上述生物材料中，所述的载体可以是病毒，噬菌体或者质粒。
上述生物材料中，所述重组载体可为将B1)所述核酸分子导入到 PVAX中得到的重组载体。在本发明的一个实施例中，B3)所述重组载体为将所述抗PD-1纳米抗体的编码基因导入PVAX中得到的重组载体PVAX-NbPD-1，重组载体PVAX-NbPD-1表达抗PD-1纳米抗体。
本领域普通技术人员可以很容易地采用己知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的B1)所述抗PD-1纳米抗体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的B1)所述抗PD-1纳米抗体的核酸序列75%或75%以上同一性的核苷酸，只要编码所述抗PD-1纳米抗体且具有抗PD-1纳米抗体活性，均是本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ所示的蛋白质的核酸序列具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75%或75%以上同一性，可为75%、80%、85%、90%或95%以上的同一性。
本发明所提供的所述抗PD-1纳米抗体的衍生物，为下述a或b或c或d或e：
a含有所述抗PD-1纳米抗体的单链抗体;
b含有a所述单链抗体的融合抗体;
c含有所述抗PD-1纳米抗体的融合抗体;
d含有所述抗PD-1纳米抗体的完整抗体。
本发明进一步提供一种根据本发明所述的抗PD-1纳米抗体，在制备用于治疗PD-1介导的疾病药物中的用途：其中所述的疾病优选为症：最优选为非小细胞肺癌。
本发明进一步提供一种治和预防PD1介导的疾病或病症的方法，该方法包括给予所需患者治疗有效量的根据本发明所述的抗PD-1纳米抗体：其中所述的疾病优选为癌起：最优选为非小细胞肺癌。
本发明还提供了包含纳米抗体文库的构建方法以及抗PD-1纳米抗体的筛选方法;筛选出来的该抗PD-1纳米抗体可应用于分子检测，作为治疗多种肿瘤的方法。
附图说明：
图1A是CRISPR-V2载体改造之后完整图谱，用于将纳米抗体文库克隆到此载体中，图1B文库载体具体原件，EF-1αcore启动子启动纳米抗体的表达，Igκ为分泌肽，随后为纳米抗体文库，之后连接跨膜域。
图2是纳米抗体文库的数据库分析，A图是纳米抗体文库决定簇互补区CDR1，CDR2，CDR3长度的分析和确定，B图是框架区的分析和确定。
图3A是用筛选出的抗PD-1纳米抗体做免疫荧光，所用细胞是Hela稳转PD-1-mCherry的细胞株，B图是抗PD-1纳米抗体与抗原PD-1高表达的Hela细胞流式图。
图4本发明抗PD-1纳米抗体对非小细胞肺癌生长的抑制效果。
图5治疗之后肿瘤体积的变化图。
图6治疗之后的小鼠体重变化图。
具体实施方法：
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1，纳米抗体文库的构建
本发明提供抗1种PD-1纳米抗体，本发明所提供的抗PD-1纳米抗体由所构建纳米抗体文库筛选而得，其氨基酸序列和核酸序列如表SQE中所示。
纳米抗体文库的框架区FR由数据库数据的比对确定而得，决定簇互补区CDR1，CDR2，CDR3长度由数据库比对分析确定。
CRISPR-V2载体用做构建纳米抗体文库载体的。用HindIII和PstI内切酶将U6启动子到gRNA scaffold这段核苷酸序列切除，将纳米抗体文库构建到EF-1αcore启动子之后XbaI和EcoRI之间。重组载体表达纳米抗体文库，使纳米抗体文库分泌并锚定在哺乳动物细胞膜上。
PD-1(胞外域)-mFc蛋白的表达和纯化;将PD-1(胞外域)-mFc蛋白的核苷酸序列克隆到表达载体PVAX的HindIII和EcoRI之间，转入HEK293T中表达4天。PD-1(胞外域)-mFc蛋白带有HHHHHH标签，用Ni进行纯化：
(1)用20mM Tris 250mM NaCl用作平衡Ni胶的缓冲液，1mL的Ni胶平和缓冲液用5mL。
(2)用0.45μm的滤器过滤上清，加入平衡好的Ni中。
(3)用 20mM Tris 250mM NaCl 20mM咪唑5mL洗Ni。
(4)加入20mM Tris 250mM NaCl 150mM咪唑10mL洗脱蛋白。
(5) 将洗脱PD-1(胞外域)-mFc蛋白进行缓冲液置换，置换成PBS，再将蛋白浓缩至浓度为1mg/ml，进行储存。
构建稳定表达纳米抗体文库的稳转Hela细胞株;将构建好的慢病毒纳米抗体文库重组质粒包装成慢病毒，所用质粒PSPA:PMDG:纳米抗体文库慢病毒质粒=3：1：4的比例进行混合，加入PEI进行包装，转到HEK293T细胞株中进行慢病毒的包装;转染12小时之后经行换液;转染72小时之后收集上清，用0.45μm的滤器进行过滤，20000g，4℃离心2个小时;弃上清用1mL双无DMEM培养基经行病毒重悬。将包装好的病毒100μL+polybrene加入Hela细胞中，24小时经行感染。24小时之后撤去病毒液，加入终浓度为1ug/ml的嘌呤霉素进行筛选，孵育3天。3天之后撤去嘌呤霉素培养基，进行细胞的繁殖。
抗PD-1纳米抗体筛选步骤：
(1)将稳定表达纳米抗体文库的Hela细胞胰酶消化，用PBS洗两次。
(2)PD-1(胞外域)-mFc蛋白与稳定表达纳米抗体文库的Hela细胞4℃进行孵育2个小时。
(3)用预冷PBS洗3次将多余PD-1(胞外域)-mFc蛋白洗净。
(4)加入欧联FITC的抗mFc的二抗与稳定表达纳米抗体文库的Hela细胞4℃孵育1个小时。
(5)PBS洗涤两次。
(6)将样品上BACKMAN流式细胞仪进行分选出阳性细胞单克隆。
抗PD-1纳米抗体体外PD-1配体结合阻断实验：
体外抗PD-1纳米抗体免疫荧光检测：
(1).接种细胞至光学培养皿中
(2)细胞贴壁后，从培养箱中取出，吸弃旧培养基，用DPBS清洗1~2遍
(3)加入500ul/皿4%多聚甲醛固定细胞15~30min
(4)吸弃4%多聚甲醛，用DPBS清洗3次，每次5min
(5)加入适量0.2%Triton X-100通透细胞15~30min
(6)吸弃0.2%Triton X-100，用DPBS清洗3次，每次5min
(7)加入5%BSA，室温封闭1h
(8)回收BSA，加入500ul/皿的一抗，4℃，孵育过夜
(9)回收一抗，用DPBS清洗3次，每次5min
(10)加入二抗，室温孵育1h(加入二抗后用锡箔纸包住培养皿避光)
(11)回收二抗，用DPBS清洗3次，每次5min
(12)加入适量DAPI染细胞核，室温，5min
(13)吸弃DAPI，用DPBS清洗3次，每次5min加入1mlDPBS，至激光共聚焦显微镜观察。
体外结合亲和力和动力学实验
Biacore方法是一个能客观检测蛋白相互间亲和力。我们通过 Biacore分析本发明待测抗PD-1纳米抗体表征亲和力及结合动力学利用由 Biacore提供的试剂盒，采用标准氨基偶联法将本发明待测抗PD-1纳米抗体共价连接至CM5芯片上。然后将将稀释于同样缓冲液中的一系列浓度梯度的PD-1胞外域蛋白于前后各个循环进样，进样后均以试剂盒内配再生试剂再生。追踪抗原一抗体结合动力学3分钟并追踪解离动力学10分钟，使用软件以1：1结合模型分析所得数据，以此法测定的ka(1/Ms)为1.152E+5、kd(1/s)为2.886E-4和KD(M)值为2.505E-9。
抗PD-1纳米抗体对肿瘤细胞的抑制实验
非小细胞肺癌细胞培养在含有10%FBS、1%青霉素链霉素的DMEM培养基中，96孔板中每孔加入1X104个细胞。抗PD-1纳米抗体用PBS按一定倍数稀释成不同浓度梯度96孔板中每孔加入10u1，37℃、5%CO2培养箱中培养6小时。细胞贴壁后每孔加入80uLT细胞悬液，细胞密度为2×104个/孔，每孔分別加入10u1CD3和CD28抗体，CD3和CD28抗体终浓度均为500ng/ml 37℃，5%CO2培养箱中培养72小时，每孔加入10u1CCK8显色，2小时后检测OD450。
抗PD-1纳米抗体对非小细胞肺癌皮下移植抑制实验;将非小细胞肺癌细胞(2×106个)200u1接种到SCID-Bege小鼠右肋部皮下，待7天肿瘤长至80-100mm3后，去除体重、肿瘤过大和过小的，按肿体积将小鼠随机分为5-110mg/kg组和 Human IgG 10mg/kg组，每组7只。将经CD3抗体刺激3天的两种PBMC以1：1比例混合，以6×105cells/60u1量注射到肿组织中，并开始皮下注射抗体，5天一次，共给药3次。每周测2次体积，称鼠重，记录数据肿瘤体积0)计算公式为：V=1/2×a×b2：其中a、b分别表示长、宽。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制：尽参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
